VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------------o0o -----------

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Đề tài

Chuyên ngành :

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60420114

Hƣớng dẫn
Học viên:

: TS. Lƣu Thị Ngọc Huyền
Phạm Thị Minh Hiền

Hà Nội – 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

1

/>

MỞ ĐẦU


2

/>

độc canh một giống lúa trồng. Sử dụng giống lúa kháng là biện pháp ưu việt, một mặt
giảm chi phí phòng trừ, hạn chế dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường, mặt
khác góp phần ổn định môi trường sinh thái.
Trong công tác chọn giống lúa kháng rầy nâu thì việc sử dụng chỉ thị phân tử
liên kết với các gen kháng rầy nâu được coi là hiệu quả và ưu việt. Các phương pháp
chọn giống truyền thống thông thường để chọn thành công một giống lúa mới ít nhất
phải mất từ 4 - 5 năm. Hơn nữa, quá trình chọn lọc gặp nhiều khó khăn, tốn kém về
sức người, sức của. Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS - Marker
Assisted Seletion) sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn vừa
nâng cao hiệu quả chọn lọc, vừa rút ngắn thời gian chọn giống. Đến nay đã có hơn
10.000 chỉ thị phân tử SSR ở lúa được phát hiện và thiết kế, các nghiên cứu về tìm chỉ
thị phân tử liên kết với gen kháng rầy nâu đã được tiến hành ở một số phòng thí
nghiệm trên thế giới.
2. Mục tiêu của đề tài
Sử dụng công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử để tạo 1-2 dòng lúa thuần ưu việt
kháng ổn định với quần thể rầy nâu cho Đồng bằng sông Hồng
3. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài:
- Từ năm 2010 đến năm 2013
- Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Bảo vệ Thực vật
4. Ý nghĩa của đề tài:
Trong đề tài này đã qui tụ được 2 gen kháng rầy nâu vào 1 giống lúa, có sử
dụng chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng. Phối hợp với chọn giống truyền
thống đã chọn tạo dòng lúa kháng rầy nâu KR1-1. Điểm kháng rầy nâu trong nhà lưới
1-3 với quần thể rầy nâu của ĐBSH . Có thời gian sinh trưởng vụ mùa 105-112 ngày,
năng suất trung bình là 59-60tạ/ha.

cây lúa. Trong những thập niên gần đây, ở nước ta, rầy nâu đã bộc phát vào những
năm 1980, 1990.
Ikeda và Vaughan (2006) cho rằng rầy nâu hiện nay có 4 biotype: Biotype 1phân
bố rộng ở Ðông Á và Ðông Nam Á; Biotype 2 có nguồn gốc ở Philipine phát sinh sau
khi sử dụng rộng rãi các giống có gen Bph 1; Biotype 3 phát sinh tại các phòng thí
nghiệm ở Nhật Bản và Philipine, Biotype 4 chưa thấy ở vùng Nam Á. Theo công bố
mới đây của Jena và cs (2006) [58] tại IRRI đã phát hiện ra gen kháng rầy Bph18 trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

4

/>

giống lúa hoang Oryza australiensis. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, quần thể rầy
nâu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có thể là sự pha trộn giữa hai loại biotype 2 và 3.
1.1.1. Phân bố và ký chủ
Rầy nâu có mặt trên khắp các nước trồng lúa. Dịch rầy bùng phát mạnh từ năm
1977 đến nay gây thiệt hại trầm trọng tại Philippin, Thái Lan, Indonesia, Ấn Độ, Mã
Lai, Đài Loan, Trung Quốc, Srilanka và Việt Nam.
Ngoài cây lúa, rầy nâu còn tác hại trên các cây trồng khác ngô, lúa mì, lúa
mạch, kê, cỏ gấu, cỏ lồng vực.
1.1.2. Đặc điểm sinh học của rầy nâu
 Thành trùng
Có 2 dạng cánh dài và cánh ngắn.
Dạng cánh dài: con cái dài 4,5-5,0 mm, bụng màu nâu vàng, đỉnh đầu nhô ra phía
trước. Cánh trong suốt, giữa cạnh sau của mỗi cánh có một đốm đen, khi hai cánh này
xếp lại hai đốm chồng lên nhau tạo thành một đốm đen to trên lưng. Mắt kép màu nâu
nhạt, mắt đơn màu nâu đỏ. Gốc râu có hai đốt phình to, con đực dài 3,6-4,0 mm, màu
nâu đậm bé hơn con cái, cuối bụng dạng loa kèn.

rầy đực ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Rầy trưởng thành thường sống 10-20
ngày ở mùa hè và 30-50 ngày ở mùa thu vì thế rầy nâu thường phát triển ở vụ khô
hơn là vụ mưa.
Rầy có thể phổ biến ở vùng lúa nước tưới tiêu và lúa nước trời trong suốt chu kỳ
sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Thường có 3 lứa rầy trong một vụ lúa ngắn
ngày (100-110 ngày). Ở Đồng Bằng sông Cửu Long mỗi năm có từ 10-12 lứa rầy
nâu, cây lúa bị hại nặng vào tháng 1, 2 và tháng 6, 7, 8 dương lịch.
Trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, rầy nâu sống quanh năm và biến động mật số tuỳ
vào giống lúa, hệ thiên địch và điều kiện môi trường. Sau khi lúa gặt xong rầy nâu di
chuyển lên cỏ dại nhưng không sống tiềm sinh ở đó. Tuy nhiên chúng chỉ qua đông ở
dạng trứng và rầy non tuổi 5 trong vùng ôn đới như Nhật Bản. Sau khi lúa mới sạ hay
cấy, rầy nâu di chuyển từ cỏ dại sang ruộng lúa. Như vậy, sự xuất hiện theo mùa xảy
ra ở vùng có giai đoạn hưu miên và hoạt động quanh năm ở nơi không có miên kỳ
nhưng phát triển mạnh vào mùa khô từ tháng 9-10 và gối lứa liên tục.
Trong điều kiện dẫn thuỷ tốt, trồng lúa liên tục, thời vụ lai rai kéo dài, gieo sạ dày
với giống lúa nhiễm rầy lại bón nhiều phân đạm, phun thuốc trừ sâu bừa bãi thì rầy
nâu sẽ bùng phát mạnh do có tiểu khí hậu phù hợp ẩm độ cao, nhiệt độ tối hảo và
không khí êm mát.
 Tập tính sinh sống và qui luật phát sinh gây hại
Rầy trưởng thành thường tập trung thành từng đám ở trên thân cây lúa phía dưới
khóm để hút nhựa. Khi bị khua động thì lẩn trốn bằng cách bò ngang, nhảy sang cây
khác hoặc nhảy xuống nước hay bay xa đến chỗ khác. Ban ngày trưởng thành ít hoạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

6

/>

động ở trên lá lúa, chiều tối bò lên phía trên thân lúa hoặc lá lúa. Khi lúa ở thời kỳ
chín phần dưới cây lúa đã cứng khô nên chúng tập trung phía trên cây lúa hoặc gần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

7

/>

hửng nắng thì rầy nâu dễ phát sinh thành dịch. Thông thường nhiệt độ từ 20-30oC và
ẩm độ từ 80-85% là điều kiện thích hợp cho rầy nâu sinh sống và phát triển.

Hình 1.2. Vòng đời rầy nâu
(Nguồn: www.khuyennongvn.gov.vn/anh/vllxl.pdf)
1.1.3. Tình hình dịch rầy nâu và mức độ gây hại
a. Tình hình dịch rầy nâu hại lúa trong những năm gần đây tại Việt nam:
- Ở các tỉnh phía Bắc: dịch rầy nâu bùng phát trong các năm: 1981-1984, 19861987, 1992-1993. Đặc biệt năm 2000: hơn 200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy, 66 nghìn
hecta bị nhiễm nặng
- Ở các tỉnh phía Nam: dịch rầy nâu xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại
hơn. Dịch rầy xảy ra vào các năm 1977-1978, 1990-1991, 1996-1997, đặc biệt là năm
1977-1978 có tới 1 triệu hecta lúa bị nhiễm rầy; 1999-2000: 340 nghìn hecta, trong đó
có 190 nghìn hecta bị nhiễm nặng.
- Đặc biệt ở đồng bằng Sông Cửu Long, vụ hè thu 1998: dịch rầy nâu bùng phát
trên diện tích 150 nghìn hecta lúa (Bộ NN và PTNT, 1998) [1]; vụ đông xuân 20052006 hơn 200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy; vụ hè thu 2006 gần 100 nghìn hecta; vụ
thu đông 2006: gần 150 nghìn hecta.
b. Mức độ gây hại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

8

/>

* Cháy rầy (hopper burn)

đoạn. Rầy có thể không truyền được bệnh trong 1 - 4 tuần hoặc cho đến khi chết. Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

9

/>

biotype của rầy nâu đều có khả năng truyền bệnh như nhau. Virus không được truyền
qua trứng rầy bị bệnh.
1.2. Đặc tính kháng rầy nâu ở lúa
1.2.1. Cơ chế tính kháng đối với côn trùng
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007) [5], sự phá hoại của côn trùng
đối với mùa màng khác với bệnh cây về mặt cơ chế, bởi vì chúng thuộc sinh vật bậc
cao (eukaryote) có đặc điểm thích nghi (fitness) với điều kiện mới khá mạnh mẽ và đa
dạng.
Cây trồng và côn trùng cùng tiến hành hiện tượng đồng tiến hoá, cùng hiện
hữu trong môi trường sinh thái phù hợp với chúng, trong một giai đoạn lịch sử khá
dài. Côn trùng (insect) chỉ trở thành sinh vật gây hại (pest) khi con người bắt đầu tiến
hành thâm canh trong nông nghiệp. Trong tự nhiên sự cân bằng sinh học vốn có đã bị
phá vỡ, đa dạng sinh học ngày càng bị thu hẹp, môi trường sống luôn bị đe dọa, tính
hệ thống trong môi trường sinh thái cũng bị phá vỡ nghiêm trọng.
Việc phát triển giống kháng sâu hại được quan sát chủ yếu trên nền tảng các
giống bản địa và mức độ đa dạng di truyền cao hơn gấp nhiều lần giống cải tiến. Kết
quả đánh giá của Heinrich và ctv. (1985) [44] cho thấy có 0,91% giống lúa cổ truyền
địa phương kháng rầy nâu trong số 30709 mẫu giống thanh lọc, trong khi đó có 48%
quần thể lúa hoang kháng rầy nâu trong số 248 quần thể thanh lọc. Khả năng phát
hiện nguồn gen kháng trong loài hoang dại gấp 48 lần trong giống lúa bản địa.
Painter (1951) đã phân chia cơ chế tính kháng của giống cây trồng đối với côn
trùng gây hại thành 3 mức độ sau:
a. Cơ chế không ưa thích (non-preference)

khuẩn gây bệnh, nhưng qua việc tăng cường thâm canh lúa trong vài chục năm gần
đây, các kiểu sinh học rầy nâu mới đã hình thành kèm theo sự thay đổi độc tính của
các quần thể rầy nâu đã làm cho nhiều giống lúa kháng rầy trước đây trở nên nhiễm.
Đến nay các nhà khoa học đã phân lập được 4 kiểu sinh học rầy nâu phân bố tại các
vùng trồng lúa chính trên thế giới. Tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế năm 1994, bằng
phương pháp nuôi phân lập rầy nâu qua nhiều đời trên các giống lúa TN1, Mudgo và
IR36, các nhà khoa học đã phân lập được 3 quần thể rầy nâu mang độc tính khác
nhau, gọi là kiểu sinh học 1, kiểu sinh học 2 và kiểu sinh học 3 với đặc tính gây hại
như sau:
+ Kiểu sinh học 1: là loại hình rầy nâu phổ biến trên đồng ruộng tại Viện
Nghiên cứu Lúa Quốc tế (và ở Việt Nam trong những năm 70), chỉ có thể sống và gây
hại trên các giống lúa không mang gen kháng rầy.
+ Kiểu sinh học 2: có thể sống và gây hại trên những giống lúa mang gen Bph1
hoặc không mang gen kháng, nhưng không gây hại được trên những giống mang gen
bph2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 11

/>

+ Kiểu sinh học 3: sống và gây hại trên những giống mang gen bph2, nhưng
không gây hại được trên những giống mang gen Bph1 hoặc Bph3.
Ngoài ra còn thấy ở khu vực Nam Á (Ấn Độ, Srilanka và Bangladesh) có các
kiểu sinh học rầy nâu mang độc tính cao hơn so với các kiểu sinh học rầy ở khu vực
Đông Nam Á (Nguyễn Công Thuật và ctv, 1996) [16]. Theo tác giả Bùi Chí Bửu
(1997)[5] thì quần thể rầy nâu với độc tính mạnh có mặt tại Ấn Độ thuộc kiểu sinh
học 4.
Nghiên cứu đặc điểm của các kiểu sinh học rầy nâu di chuyển từ vùng này
sang vùng khác cho thấy độc tính của chúng không ổn định (Xiao, 1998) [117].
Những nghiên cứu về khả năng gây độc ở rầy hoang dại trên hai giống lúa Thai Col
(mang gen kháng rầy bph8) và Pokkali (mang gen kháng rầy Bph9) cho thấy chúng

kháng rầy Bph1 và bph2 đã được xác định vào năm 1970 Giống kháng rầy đầu tiên
mang gen Bph1 là IR26 đã được đưa ra vào năm 1973 và đã được chấp nhận rộng rãi
tại Philippine, Indonesia và Việt nam. Nhưng đã trở nên nhiễm vào nawm 1976-1977
bởi ảnh hưởng của biotype 2. Vào thời điểm này, giống IR36 và IR38 và sau đó là
IR42 với gen bph2 đã được đưa ra và nhanh chóng thay thế IR26. Tính kháng của nó
đã kéo dài được 14 năm đến tận 1991. Sau đó là một sô giống khác như IR60, IR62,
IR72 kháng với biotype 3 đã được đưa ra. Bằng các thí nghiệm phân tích di truyền và
chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã xác định được 1 số gen kháng rầy chính (Bảng
1). (Bùi Chí Bửu và ctv, 1997; Nguyễn Công Thuật và ctv, 1996; Ikeda, 1985; Ishii
và ctv, 1994; Khush và Brar, 2011; (Liu va CS 2009); Murai và ctv, 2001 [6] [16]
[52] [53] [63] . Các gen Bph20, Bph21 cũng đã được lập bản đồ trên NST lúa.
Bảng 1. Các gen kháng rầy nâu và giống chỉ thị mang gen kháng
Dòng chỉ thị

Gen kháng

Trội/Lặn

TN1

Không

-

Mudgo

Bph1

Trội


T12

bph7

Lặn

Chinsaba

bph8

Lặn

Pokkali

Bph9

Trội

O. australiensis

Bph10

Trội

O. officinalis

bph11(t)

Lặn



Bph1

R

S

R

S

ASD7

bph2

R

R

S

S

Rathu Heenati

Bph3

R

R


Bph6

S

S

S

R

T12

bph7

S

S

S

R

Chin Saba

bph8

R

R


Bph18

R

R

R

R

O. officinalis

Bph6, Bph13

R

R

R

R

O. minuta

Bph20, Bph21

R

–

Nghiên cứu cơ chế của tính kháng rầy nâu trên những loài lúa dại Oryza
officinalis, O. punctata, O. latifolia và trên 6 giống lúa trồng, trong đó bao gồm 5
giống lúa chỉ thị mang gen kháng rầy: Rathu Heenati (Bph3), Babawee (bph4),
ARC10550 (bph5), Swarnalata (Bph6), Ptb33 (bph2+Bph3) cùng với giống TN1
(không mang gen kháng) cho thấy các loài lúa dại duy trì tính kháng cao qua 48 giờ
thả rầy, trong khi ở các giống lúa trồng, tốc độ phá hủy cây tăng theo thời gian thả
rầy. Nghiên cứu này cũng cho thấy lượng thức ăn rầy ăn vào và lượng thức ăn tiêu
hóa được trong ruột rầy ở các giống lúa trồng cao hơn ở lúa dại. Tốc độ sinh trưởng,
tuổi thọ, số trứng và tỉ lệ nở của trứng rầy trên lúa dại thấp hơn so với lúa trồng. Rất
có thể lúa dại mang nhiều gen kháng rầy hơn so với lúa trồng nên các cây lúa dại
mang đặc tính kháng rầy tốt hơn. Theo Jairin và cs 2007, [57] các gen Bph1, bph2,
Bph3, bph4 đã được sử dụng rộng rãi trong chương trình chọn giống ở Thái lan,
nhưng những giống này đã mất khả năng kháng rầy nâu mặc dù Bph3 đã được xác
định là có mức kháng cao, phổ kháng rộng đối với rầy nâu.
2. CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ NHỮNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DI
TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA
2.1. Chỉ thị phân tử
2.1.1. Khái niệm chung chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử là một công cụ mới trong nghiên cứu di truyền và chọn giống
cây trồng. Hiệu quả của phương pháp này trong chọn giống là rất lớn như: nhanh, rẻ,
chính xác, nâng cao được năng suất sản lượng. Ứng dụng của DNA-Marker trong
chọn giống như: Lập bản đồ QTL/gen kiểm soát những tính trạng quan trọng có ý
nghĩa kinh tế. Chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection - MAS)
cho một tính trạng. Chuyển QTL/gen vào giống mới nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại
(Marker-assisted backcrossing MABC) vào giống mới. Tạo các dòng đẳng gen cho
các tính trạng kháng sâu bệnh phục vụ việc phân lập gen. Chọn tạo giống phân tử của
tổ hợp nhiều tính trạng khó mà chọn giống truyền thống không làm được.
Đặc điểm của chỉ thị phân tử ADN:
- rất nhiều đa hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 15

mỗi họ, giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn
để cắt phân tử ADN của hệ gen, sau đó dùng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò.
người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau.
Sự khác nhau về kích thước các đoạn được tạo ra do xử lý enzym giới hạn đối
với các phân tử ADN trong nhân hoặc trong các cơ quan tử khác nhau được gọi là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 16

/>

tính đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn. Chỉ thị này được các nhà di truyền học
lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở
người. Trong phương pháp RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt ADN genome
thành nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những
đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen như đảo đoạn,
thêm hoặc mất đoạn ADN tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể.
Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những
enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, các đoạn cắt ra của ADN với kích
thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem
xét các mẫu nhiễm sắc thể. Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai
với các mẫu ADN (Nguyễn Quang Thạch, và ctv) [21].
Đặc điểm của chỉ thị RFLP:
- Là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng
một lôcut gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc BB) và
các cá thể dị hợp tử AB.
- Chỉ thị RFLP rất đáng tin cậy, dùng để kiểm tra các chỉ thị phân tử khác
- Hạn chế của chỉ thị RFLP: phương pháp phát hiện RFLP tiêu tốn nhiều thời
gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh.
2.1.2.2. Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR
a. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình các đoạn
ADN khuyếch đại ngẫu nhiên)

biến NST đều làm thay đổi kích thước của đoạn cần nhân vì khi có sự thay đổi một
bazơ nitơ nào đó thì sẽ ngăn cản việc tiếp hợp của mồi với ADN khuôn.
b. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài
các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn cắt ADN hệ gen và
nhân bội các đoạn ADN chọn lọc bằng kỹ thuật PCR, được phát triển bởi Vos và
cộng sự năm 1995. Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết ta cắt các mẫu
nghiên cứu bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô
số mảnh có kích thước khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide
của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn
(adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu
ADN đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR. Mồi PCR gồm hai phần:
Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm
vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn
ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 18

/>

Chỉ thị AFLP rất chính xác, có thể sử dụng cho tất cả các thực vật, động vật.
Loại chỉ thị này vô cùng hữu hiệu trong việc “DNA fingerprinting” “lấy vân tay
ADN” của bất kỳ cá thể sinh vật nào. Nhược điểm: kỹ thuật cầu kỳ, tốn kém.
c. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu)
Chỉ thị STS do M.Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN
ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép
xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết
trước của ADN trong genome. STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut đã biết
bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối
của những locut đặc trưng này (Trịnh Đình Đạt, 2006)[8]. Các đoạn mồi STS chứa

- Chỉ thị SSR: Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989, là những
đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide,
theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Ví dụ:
NNNNNNN(GA)20-40NNNNNNNNN
NNNNNNN(CAT)16-26NNNNNNNNN
NNNNNNN(TTGG)12-18NNNNNNNNN
Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và ctv,
1982)[35], sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và
ctv, 1998)[27]. Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có
kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài.
Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote là khá phổ biến,
tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một
đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn
lần hoặc nhiều hơn. Các „vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật.
Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá
thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau. Như vậy vùng “vi vệ
tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác.
Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội dựa trên các trình tự lặp lại ngắn. Đây là loại
chỉ thị đang được sử dụng nhiều trong lập bản đồ gen, trong nghiên cứucứu đa dạng
di truyền và chọn giống MAS.
Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém.
SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết
kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài. Tuy nhiên, SSR là
một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại
các giống vật nuôi cây trồng khác nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật.
Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen trong chọn giống, xây dựng bản đồ
liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan
đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 20


mang lại hiệu quả cao và đã từng được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế
giới. Tuy nhiên loại enzyme này có giá khá cao trên thị trường.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 21

/>

2.2. Các nghiên cứu lập bản đồ gen kháng rầy nâu ở lúa
Gen kháng rầy nâu đầu tiên là Bph1 là một gen trội được xác định từ giống lúa
Mudgo thuộc loài phụ indica kháng rầy (Athwal et al. 1971) [26]. Bph1 đã được xác
định lập bản đồ với vị trí nằm trên cánh tay đòn dài của NST 12 liên kết chỉ thị phân
tử Restriction Fragment Length Polymorphism (Hirabayashi and Ogawa 1995) [47].
Gen bph2 được xác định từ giống lúa indica ASD7 (Athwal et al. 1971) [26]. Gen
Pbh2 được xác định lập bản đồ phân tử tại vị trí cánh tay đòn dài trên NST12 (Murata
et al. 1998; Murai et al. 2001). Để lập bản đồ phân tử Pbh2, tác giả đã sử dụng quần
thể lai giữa giống lúa Tsukushibare ( giống lúa japonica nhiễm rầy nâu) với dòng
Norin-PL4

(dòng

mang

đoạn

locus

gen

bph2


giữa hai chỉ thị phân tử RM6997 and RM5742 nhiễm sắc thể số 4 (Qiu et al. 2010).
Gen bph8 đã được xác định trên ba giống lúa Col. 5 Thailand, Col. 11 Thailand và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 22

/>

Chin Saba. Gen bph9 đã được xác định lập bản đồ phân tử trên giống lúa
Kaharamana, một giống lúa kháng rầy nâu của Sri Lanka. Tác giả đã sử dụng 180 cá
thể trong quần thể phân ly F2 tổ hợp lai giữa Kaharamana và 02428. Kết quả xác định
gene kháng rầy nâu Bph9 ở giống lúa Kaharamana tại vị trí giữa hai chỉ thị phân tử
RM463 and RM5341 với khoảng cách tương ứng là 6.8 cM and 9.7 cM trên nhiễm
sắc thể số 12(Murata et al. 2001).
Lúa hoang dại là một nguồn rất giầu gene kháng rầy nâu. Tới nay, ít nhất 10 gen
chính kháng rầy nâu đã được xác định từ loài lúa hoang. Gen Bph10 đã được xác định
trên nhiễm sắc thể 12 từ loài lúa hoang O. australiensis (Ishii et al. 1994) [53]. Các
gen kháng rầy nâu bph8, Bph9 and Bph10(t), kháng các chủng biotypes 1, 2 và 3.
Gen kháng rầy nâu bph11được xác định trên cánh tay đòn dài nhiễm sắc thể số 3 ở
giống lúa O. officinalis (Hirabayashi et al. 1998) [47]. Gen trội kháng rầy nâu BPH12
đã được xác định trên cánh tay đòn ngắn nhiễm sắc thể 4 tại vị trí giữa hai chỉ thị
phân tử RM16459 và RM1305 trên giống lúa hoang O. latifolia (Yang et al. 2002;
Qiu et al. 2012) [122], [92]. Hai Gen trội Bph13 xác định tại vị trí trên cánh tay dài
nhiễm sắc thể số 2 từ giống lúa O. eichingeri (Liu et al. 2001) và cánh tay đòn ngắn
nhiễm sắc thể số 3 từ giống lúa O. officinalis (Renganayaki et al. 2002) . Hai gen trội
kháng rầy nâu Bph14 và Bph15 cũng được tìm thấy và lập bản đồ phân tử từ giống
lúa O. officinalis, hai gen này được lập bản đồ phân tử tại vi trí tương ứng trên cánh
tay đòn dài nhiễm sắc thể số 3 và cánh tay đòn ngắn trên nhiễm sắc thể số 4 (Huang et
al. 2001) [51]. Một gen kháng rầy nâu khác là Bph17 đã được xác định tại vị trí cánh
tay đòn ngắn trên nhiễm sắc thể số 4 từ giống lúa Rathu Heenati (Sun et al. 2005).
Gene, bph19 được lập bản đồ từ giống lúa AS20-1 tại vị trí trên cánh tay đòn
ngắn nhiễm sắc thể số 3 (Chen et al. 2006) [34]. Gen Bph18 được xác định ở dòng lai

giwaxhai chỉ thị phân tử SSR markers RM273 và RM471 trên cánh tay đòn dài nhiễm
sắc thể số 4 (Li et al. 2006). Đã lập bản đồ chi tiết gen Bph27 từ quần thể lai giữa
giống lúa kháng Balamawee và giống japonica nhiễm 02428 với khoảng cách 63 kb
giữa hai InDel markers Q52 and Q20. (He và CS 2013)
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu
Đối với rầy nâu, nhiều nhà chọn giống đã thành công trong việc chọn tạo giống
mang một hay một vài gen kháng rầy nâu vào một giống. Để tạo ra giống lúa kháng
bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào
"genome đích". Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ
hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào "genome đích" (quy tụ
nhiều gen vào 1 dòng ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn, hoặc đôi khi không thể
thực hiện được. Ở đây, thay vì đánh giá kiểu hình các cá thể con lai để chọn ra cá thể
mang gen kháng, người ta xác định các cá thể mang gen kháng thông qua chỉ thị phân
tử liên kết chặt với gen kháng. Các nhà khoa học Thái Lan đã tạo ra được những dòng
lai mới, mang các QTLs kháng rầy nâu, mang gen kháng bạc lá Xa21 và có khả năng
chống chịu ngập được cải thiện dựa trên nền gen của dòng KDML 105 (Therayut
Toojinda và ctv. (2004) .
Ở Nhật Bản, các nhà khoa học cũng đã thành công trong việc quy tụ các gen
kháng rầy nâu Bph1 và Bph2 vào các dòng lai nhờ chọn lọc bằng chỉ thị phân tử. Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 24

/>

dòng lai này biểu hiện tính kháng tương đương đối với các giống mang một gen Bph1
và biểu hiện tính kháng hơn hẳn so với các dòng chỉ mang một gen Bph2 (Prem N.
Sharma và ctv. (2004). N.S. Gamalath và ctv. (2005) cũng đã thông báo về việc quy
tụ hai gen kháng Bph1 và bph2 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 12 vào giống nhiễm
Tsukushibare. Những nghiên cứu tiếp theo của nhóm tác giả về ARNm sử dụng
phương pháp dấu phân tử ARNm dựa trên chỉ thị AFLP đã nhân dòng 12 trong số 41
băng đa hình giữa giống nhiễm và các dòng quy tụ. 3 trong số các đoạn này được