ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG

CHUYÊN NGÀNH

: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH : 62.54.02.01
Phản biện độc lập 1

: PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM


thông số nuôi cấy tối ưu như sau: độ ẩm môi trường = 65%; độ dày lớp môi trường =
1,5 cm; tỷ lệ giống = 9 x 107 CFU/g môi trường. Vào ngày nuôi cấy thứ 7, tiến hành xử
lý vi bao tòan bộ canh trường nuôi cấy với 5% bột gạo và sấy ở nhiệt độ 50 ± 1 oC đến
độ ẩm 11-12% để thu nhận chế phẩm sinh học từ Rhodotorula sp.3 (gọi tắt là βCR).
Chế phẩm βCR đã được thử nghiệm dùng làm nguyên liệu thức ăn nuôi gà đẻ trứng
công nghiệp IsaBrown. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi khẩu phần thức ăn có đáp
ứng nhu cầu năng lượng trao đổi ME ở mức (2893 ± 10) Kcal/Kg, hàm lượng protein
thô đạt (18,27 ± 0,35) %Klg và hàm lượng carotenoid tổng ở mức (131,57 ± 17,46)
ppm gà mái sẽ cho năng suất trứng đạt trên 94%. Các chỉ tiêu chất lượng trứng như
màu của lòng đỏ, kết cấu albumin của lòng trắng trứng đặc, độ dày vỏ cùng với hàm
lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể, đặc biệt
hàm lượng vitamin A (µg %) trong lòng đỏ trứng đạt (895,26 ± 66,96) so với trứng gà
ở lô đối chứng là (468,24 ± 52,48).


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Nghiên cứu sinh

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên xin bày tỏ lòng tri ân đến Cô PGS.TS. Đống Thị Anh Đào và Thầy TS.
Nguyễn Hữu Phúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi
hoàn thành nghiên cứu này.
Chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Kỹ

1.1 NẤM MEN RHODOTORULA .............................................................................. 3
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại ........................................................ 3
1.1.2 Đặc điểm sinh lý, hình thái ............................................................................ 5
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa........................................................................................... 6
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula ................................ 6
1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula
............................................................................................................................ 13
1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN ...............................................................14
1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn ...................................................................... 14
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn ................................ 15
1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn ....................... 17
1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula ..................................................... 19
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula ...... 19
1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GÀ ĐẺ TRỨNG .
.....................................................................................................................................23
1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin .............................................. 24


1.3.2 Vai trò của sắc tố carotenoid đối với gà đẻ ................................................. 25
1.3.3 Vai trò của enzym phytase .......................................................................... 26
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN RHODOTORULA .....................29

2.1.1 Vật liệu phân lập .......................................................................................... 29
2.1.2 Môi trường phân lập ..................................................................................... 29
2.1.3 Các thí nghiệm định danh nấm men ............................................................ 30
2.2


2.4.7

Xác định mối tương quan giữa tổng hàm lượng carotenoid trong thức ăn

với năng suất cho trứng của gà ................................................................................... 52
2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................... 53
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1

KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ..........................................54
3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid ........................................... 54
3.1.2 Tuyển chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ
sở thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij ....................... 54
3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên
cơ sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ............................................................... 57
3.2

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM

MEN RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN ............................... 59
3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men ......................... 59
3.2.2

Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng

hợp beta-carotene của Rhodotorula ............................................................................ 63
3.2.3


Chương 4:

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 99
4.2 ĐỀ NGHỊ .............................................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CB

: cân bằng

CFU

: đơn vị hình thành khuẩn lạc

CK

: chất khô

cs

: cộng sự

DM


ME

: năng lượng trao đổi

NT

: nghiệm thức

OD

: mật độ quang

TB

: trung bình

TYT

: tối ưu các yếu tố toàn phần

TN

: thí nghiệm

Sac.

: đường saccharose

UI



Bảng 2.4

Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu

huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm ............................................................................... 36
Bảng 2.5

Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2
................................................................................................................ 37

Bảng 2.6

Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh

(ppm)

................................................................................................................ 37

Bảng 2.7

Các mức khảo sát độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để

tìm thí nghiệm tại tâm................................................................................................ 38
Bảng 2.8

Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn

phần


Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng saccharose khác nhau ..................................................................................... 64
Bảng 3.5

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng nitơ khác nhau ................................................................................................ 65
Bảng 3.6

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng phospho khác nhau ......................................................................................... 66
Bảng 3.7

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng lưu huỳnh khác nhau ...................................................................................... 67
Bảng 3.8

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực

nghiệm tối ưu dinh dưỡng ........................................................................................ 68
Bảng 3.9

Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng . 69

Bảng 3.10 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh
dưỡng


Bảng 3.23 Công thức thức ăn gà đẻ sử dụng trong thí nghiệm............................. 91
Bảng 3.24 Kết quả trung bình khảo sát các chỉ tiêu chất lượng trứng qua các
tuần thí nghiệm........................................................................................................... 95
Bảng 3.25 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng ở các lô
thí nghiệm ................................................................................................................ 97


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH
Trang

Sơ đồ
Sơ đồ 2.1

Sơ đồ khảo sát và thu nhận chế phẩm sinh học CR từ Rhodotorula .. 33

Sơ đồ 3.1

Tóm tắt quy trình thu nhận chế phẩm βCR .......................................... 83

Hình (hình, biểu đồ, đồ thị)
Hình 1.1

Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi Rhodotorula

glutinis

................................................................................................................ 5

Hình 1.2


................................................................................................................ 16

Hình 2.1

Gạo tấm và bã đậu nành dùng trong nghiên cứu ................................ 34

Hình 2.2

Chuột nhắt trắng dùng trong nghiên cứu ............................................. 42

Hình 2.3

Gà IsaBrown tại trại thực nghiệm ........................................................ 46

Hình 2.4

Trứng gà đập trên mặt phẳng kính ....................................................... 50

Hình 2.5

Quạt so màu lòng đỏ trứng ................................................................... 51

Hình 3.1

Các nấm men giả định sinh sắc tố carotennoid phân lập được ........... 54

Hình 3.2

Giống nấm men Rhodotorula phân lập được ....................................... 55



carotenoid tổng theo thời gian ................................................................................... . 80
Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hàm lượng
beta-carotene giữa hai nghiệm thức có bổ sung và không bổ sung chitinase ........ 81
Hình 3.11 Khay lên men bán rắn Rhodotorula và chế phẩm βCR thu được .... 82
Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
canxi, phospho trong xương và phospho trong phân của chuột thí nghiệm........... 88
Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
hemoglobin, beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh chuột......................... 88
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn năng suất cho trứng (%) của gà qua các tuần khảo
sát

................................................................................................................ 92

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng với
năng suất cho trứng ................................................................................................... 93
Hình 3.16

Quan sát hệ vi sinh vật trong phân gà của lô thí nghiệm và lô đối

chứng

................................................................................................................ 96


1

MỞ ĐẦU
Nhu cầu phải có thức ăn sạch, an toàn, đảm bảo dinh dưỡng và sức khỏe cộng đồng để
cải thiện và phát triển thể lực, trí lực của các thế hệ người Việt trong tương lai là một

CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA LUẬN ÁN
- Phân lập và chọn từ tự nhiên các nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc giống
Rhodotorula có khả năng tổng hợp sinh khối giàu beta-carotene trên môi trường bán
rắn.
- Xác định các thông số kỹ thuật của quá trình nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula
và thu nhận chế phẩm.
- Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến năng suất và chất lượng cho trứng
của gà đẻ.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Tuyển chọn được một chủng nấm men Rhodotorula có khả năng tổng hợp carotenoid
giàu beta-carotene, sinh khối và phytase trên môi trường bán rắn.
- Tối ưu thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula
trên cơ chất chính là gạo tấm và bã đậu nành với hàm mục tiêu là hàm lượng betacarotene, đồng thời đã đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm sinh học có giá trị dinh
dưỡng cao từ nấm men Rhodotorula theo phương pháp bán rắn.
- Thử nghiệm dùng chế phẩm làm nguyên liệu bổ sung nuôi gà đẻ trứng cho kết quả
tăng năng suất và chất lượng trứng.
- Tìm ra phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng trong
thức ăn và năng suất cho trứng của gà chuyên trứng IsaBrown.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 NẤM MEN RHODOTORULA
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại
Hiện nay có hai cách phân loại vi sinh vật. Cách thứ nhất dựa vào đặc điểm sinh lý,
sinh hoá; cách thứ hai dựa vào cơ sở cấu trúc phân tử của tế bào. Nấm men thuộc giới
(Regnum) nấm (Fungi). Giới này bao gồm nấm và nấm lớn (hay nấm quả thể). Ước tính
có khoảng 1,5 triệu loài nấm [74] và giới này cho đến nay vẫn còn là điều bí ẩn [106].

4

loại của Barnett và cs (1990) hay Kurtzman và Fell (1998). Trong nghiên cứu này,
khóa phân loại của Kreger-van Rij (1984) được sử dụng để định danh nấm men. Theo
khóa phân loại này, nấm men gồm 60 giống, trong đó có 25 giống xếp vào nhóm có
khả năng tạo và không tạo bào tử, và giống Rhodotorula thuộc nhóm này. Đặc điểm
phân loại của Rhodotorula theo mô tả của Kreger-van Rij như sau [95]:
-

Không hình thành bào tử và không sinh sản hữu tính;

-

Nẩy chồi theo nhiều hướng;

-

Tạo sắc tố đỏ, hồng, cam hay vàng;

-

Khuẩn lạc nhầy;

-

Không lên men các loại đường;

-

Có hay không đồng hóa nitrat NO3- ;

thước tế bào nấm men trung bình khoảng 5µm x 8m [4, 10].

Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi của Rhodotorula glutinis [95]
Thành tế bào nấm men Rhodotorula bao gồm nhiều lớp, thành phần chủ yếu là các
polysaccharid như: 1,3-alpha-glucan; mannan; 1,3-beta-1,6-beta-glucan và chitine (nacetyl glucosamine). Các cấu tử tham gia vào cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula
thường khác nhau ở các loài, đa số các loài có thành phần cấu tạo gồm glucose,
mannose, galactose và fucose [18, 95].
Khuẩn lạc Rhodotorula phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục,
đôi khi gồ ghề, mịn và nhớt. Bờ khuẩn lạc Rhodotorula không có răng cưa, có màu từ
kem, hồng đến đỏ san hô, cũng có khi có màu vàng và đỏ cam thuộc nhóm sắc tố
carotenoid [10, 89, 129]. Kích thước khuẩn lạc tuỳ thuộc vào thành phần môi trường
dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy. Đường kính khuẩn lạc Rhodotorula có thể từ 1 đến
10 mm [109]. Trên bề mặt dịch chúng tạo thành các vòng có màu từ vàng đến đỏ [10].
1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý
Đa số các loài thuộc giống Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi đa cực, một số
loài sinh sản theo kiểu nẩy chồi có cực. Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu


6

phân đôi nhưng giống Rhodotorula không có hình thức sinh sản theo kiểu hữu tính [3,
18]. Nấm men Rhodotorula không hình thành sợi nấm, một số loài có sinh sợi nấm giả
nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4, 10].
Theo Phaff và cs (1969), khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý
quan trọng dùng trong phân loại của các giống Rhodotorula và Cryptococcus [117].
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa
Ngoài các đặc điểm sinh hoá dùng để phân loại giống nấm men Rhodotorula theo
Kreger-van Rij (mục 1.1.1.), nấm men này còn có một số đặc điểm sinh hóa sau:
-


oleic (C18:1) thành acid linolenic (C18:3) [154].
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
1.1.4.1 Sơ lược về carotenoid
Các carotenoid chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi
sinh vật nhưng có chức năng sinh lý đặc hiệu đối với cơ thể người và động vật. Số
lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 700 loại với các màu sắc khác
nhau. Carotenoid được tổng hợp từ các tiền chất isoprenoid (C5), hợp chất này sau đó
chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Sau đó, chuỗi phân tử 20 nguyên tử carbon
này liên kết đuôi – đuôi để tạo thành chuỗi C40. Do đó các carotenoid còn được gọi là
tetraterpenoid [35].


7

Các carotenoid được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dưới dạng các chất
màu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cá hồi [34], gia cầm [84]. Trong số hàng trăm loại
carotenoid được biết thì beta-carotene được xem là tiền chất cao nhất của vitamin A
[20]. Phân tử beta-carotene có cấu tạo cân đối, được hình thành do một chuỗi prolene
và 2 vòng beta-ionone ở hai đầu, khi thủy phân cho hai phân tử vitamin A. Dưới tác
dụng của nhiệt độ cao, ánh sáng và bức xạ, beta-carotene bị mất màu do xảy ra quá
trình chuyển hóa như hình 1.2.

Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng và bức xạ [35]
1.1.4.2 Sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men
Nấm men sinh tổng hợp sắc tố carotenoid qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu sinh tổng
hợp các isoprenoid gồm dimethyallyl-pyrophosphat (DMAPP) và isopentenyl-5pyrophosphat (IPP) từ acetyl-CoA. Giai đoạn tiếp theo, DMAPP và IPP sẽ tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp carotenoid [137, 144].
- Giai đoạn 1: Sinh tổng hợp isoprenoid (DMAPP và IPP)
Sau phát minh ra con đường mevalonate về quá trình sinh tổng hợp isopenoid ở sinh
vật [20], các tác giả Boll M. và cs (1975) [32], Trocha và cs (1976) [146], Ratledge


9

liên hợp có màu đỏ. Lycopene bị đóng vòng để hình thành beta-carotene có màu vàng
[41, 83].

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid [83]
Chú thích: IPP- isopentenyl diphosphat, acetyl-CoA - acetyl coenzym A, HMG-CoA3-hydroxi-3-methylglutaryl coenzym A, DMAPP- dimethylallyl diphosphat; FPPfarnesyl diphosphat, GPP- geranyl diphosphat, GGPP- geranylgeranyl diphosphat.
Sự hình thành các carotenoid của nấm men xảy ra theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất
bão hòa giống các sinh vật tổng hợp carotenoid khác. Theo Daisuke Umeno và cs
(2003) [43], các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp carotenoid không được phân
loại cụ thể bằng cách dựa vào cơ chất. Theo Simpson và cs (1964) [137], Kocková
(1990) [89], Visser H. và cs (2003) [152] từ phytoene sẽ xảy ra các quá trình khử, tạo
vòng và oxi hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt và các quá trình này ở nấm men có
thể xảy ra theo nhiều hướng khác nhau.
1.1.4.3 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để
phân loại giống Rhodotorula [18, 19, 91, 95]. Carotenoid hình thành được kết hợp với
màng tế bào và chỉ tồn tại bên trong tế bào. Các sắc tố carotenoid ở Rhodotorula có


10

khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng rộng từ 450 đến 550 nm [39]. Theo Kocková
và cs [89], các carotenoid có tác dụng bảo vệ tế bào nấm men chống lại ảnh hưởng có
hại của tia cực tím. Cường độ màu của nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với
các giống men trắng khi chúng sống ở các vùng địa lý có tia cực tím mạnh. Tuy nhiên,
khi cường độ bức xạ quá cao, các carotenoid không còn khả năng che chở cho tế bào.
Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp [116]
Các carotenoid thu được

Rho. araucariae CBS 6031
+ + + +
Rho. glutinis CBS 20
+ + + +
Rho. graminis CBS 2826
+ + + +
Rho. lactosa CBS 5826
+ + + +
Rho. mucilaginosa CBS 17
+ + + +
Rho. armeniaca CBS 8076
+ + +
+ +
+
Rho. aurantiaca CBS 317
+ + +
+ +
+ +
Rho. hasegawae CBS 8253
+ + +
+
+
+ +
Rho. minuta CBS 319
+ + +
+
+ +
Chú thích: I- beta-carotene, II- beta-zeacarotene, III- torulene, IV- torularhodin, Vplectaniaxanthin, VI- hydroxyplectaniaxanthin, VII và VIII- dẫn xuất của torulene, IXchưa xác định, X- beta-carotenone.
Các carotenoid do Rhodotorula tổng hợp nên chủ yếu là -carotene, -carotene,
torulene và torularhodin [59], trong đó torulene thường chiếm tỷ lệ cao hơn [91]. Tuy