ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HỒNG KIM

NGHIÊN CỨU TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA CÁC EPITOPE
KHÁNG NGUYÊN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐÃ ĐƯỢC DỰ
ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01
Phản biện 1: PGS.TS. Trương Thị Xuân Liên
Phản biện 2: TS. Trần Tấn Thành
Phản biện 3: TS. Nguyễn Hữu Hùng
Phản biện độc lập 1: TS. Trần Tấn Thành
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Hữu Hùng

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. Trần Linh Thước

Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2014


Lời cảm ơn
Em trân trọng cảm ơn Thầy GS.TS. Trần Linh Thước, người hướng dẫn
khoa học đồng thời là người hướng dẫn ba chương trình nghiên cứu học thuật
của em tại Trường. Thầy không những đã định hướng đề tài, quan tâm giúp đỡ
vật chất và tinh thần cho luận án của em mà cũng là người dẫn dắt, người thủ
trưởng tinh tế, nhiệt tâm của em trong suốt 12 năm vừa qua.
Cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Lệ, chủ nhiệm đề tài KC.04.18 đã cho tôi cơ
hội tham gia và thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài.

đã hỗ trợ tôi thực hiện một số thí nghiệm của luận án.
Con xin gửi đến các đấng sinh thành: Ba – Má hai bên nội ngoại lời tri ân
và biết ơn sâu sắc. Cảm ơn đại gia đình con ở Cam Ranh đã luôn yêu thương,
động viên con trong suốt 34 năm qua.
Em cảm ơn anh và con đã luôn bên cạnh, chia sẻ những vui buồn, là
nguồn động lực cho em vượt qua những lúc gian nan và sẽ cùng em bước tiếp
trên con đường phía trước.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 12 năm 2014

Trần Thị Hồng Kim


Mục lục

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. ix
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. DỊCH BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 Ở GIA CẦM VÀ Ở NGƯỜI .......... 4
1.1.1. Bệnh cúm do virus cúm A/H5N1 ..................................................................... 4
1.1.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới ....................................................... 4
1.1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam ........................................................ 5
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ...................................... 5
1.2.1. Phân loại và danh pháp ..................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc di truyền và tiến hóa ........................................................... 7
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH DO
VIRUS CÚM A/H5N1 ........................................................................................ 10
1.3.1. Phòng ngừa virus cúm A/H5N1 bằng vắc-xin ............................................... 10

1.8.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin phòng cúm A/H5N1...... 34
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 37
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 37
2.1.2. Vâ ̣t liê ̣u sinh ho ̣c ............................................................................................. 38
2.1.3. Hóa chất – Môi trường ................................................................................... 43
ii


Mục lục
2.2. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP VÀ KIỂM TRA TÍNH SINH MIỄN DỊCH
CÁC EPITOPE KHÁNG NGUYÊN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐÃ
ĐƯỢC DỰ ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC ...................... 47
2.2.1. Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên epitope dự đoán từ
kháng nguyên HA dưới dạng peptide tái tổ hợp ....................................................... 49
2.2.2. Tạo các chủng E. coli biểu hiện epitope tế bào B và epitope tế bào T
dưới dạng các peptide tái tổ hợp ............................................................................... 52
2.2.3. Phương pháp tinh chế, định lượng và phân tích độ sạch của kháng nguyên .. 56
2.2.4. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột với các kháng nguyên
thu nhận được ............................................................................................................ 58
2.2.5. Phương pháp ELISA gián tiếp để đánh giá tính sinh miễn dịch của
các epitope tế B ......................................................................................................... 59
2.2.6. Phương pháp ELISPOT để đánh giá tính sinh miễn dịch của các
epitope tế T ............................................................................................................... 61
2.2.7. Phương pháp kiểm tra khả năng trung hòa kháng nguyên HA
virus cúm A/H5N1 của kháng huyết thanh kháng epitope bằng thử nghiệm
ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) ................................................................................ 63
2.2.8. Phương pháp kiểm tra khả năng trung hòa độc lực virus cúm A/H5N1
bằng kỹ thuật vi trung hòa ......................................................................................... 64
2.2.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .......................................................... 67

TỪ HỖN HỢP EPITOPE TIỀM NĂNG ....................................................... 103
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 107
4.2. ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................ 109
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................... 110
iv


Mục lục
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 111
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
aa

Acid amin

ANNs

Artificial Neural Network (mạng nơron nhân tạo)

APS

Ammonium Persulfate

bp


ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

ELISPOT

Enzyme-linked immunosorbent spot

GST

Gluthathione-S-tranferase

HA

Haemagglutinin

HI

Haemagglutinin Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu)

HMMs

Hidden Markov Models (mô hình Markov ẩn)

IFN

Interferon gamma

IL


Madin-Darby Canine Kidney (tế bào thận chó)

mRNA

messenger RiboNucleic Acid

OPD

O-Phenylene Diamine

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PMSF

Phenyl methyl sulphonyl fluoride

RNA

Ribonucleic acid

SDS – PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis

Bảng 2.1. Các mồi được sử dụng trong luận án .......................................................... 39
Bảng 2.2. Các epitope dự đoán được tổng hợp hóa học ............................................. 41
Bảng 2.3. Cách tính kết quả TCID50 trong phản ứng vi trung hòa. ............................ 65
Bảng 3.1. Các epitope bảo tồn nhận diện bởi tế bào B và tế bào T được tổng hợp
hóa học để kiểm tra tính sinh miễn dịch. ...................................................................... 68
Bảng 3.2. Các plasmid tái tổ hợp đã được tạo dòng trong luận án ............................ 74
Bảng 3.3. Các epitope tế bào B và T đã được tổng hợp hóa học và tổng hợp
di truyền để kiểm tra tính sinh miễn dịch trong luận án. .............................................. 82

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sự phân bố dịch cúm A/H5N1. ..................................................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc virus cúm A (A) và ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử (B) ............ 7
Hình 1.3. Các đáp ứng miễn dịch thích ứng của vật chủ đối với kháng nguyên
virus cúm ..................................................................................................................... 16
Hình 1.4. Quy trình ELISPOT điển hình. ..................................................................... 25
Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVFT và plasmid pGEX-fljB. ................................................ 39
Hình 2.2.Các thang chuẩn DNA được sử dụng trong luận án .................................... 42
Hình 2.3.Các thang chuẩn protein được sử dụng trong luận án ................................ 42
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các nội dung nghiên cứu trong luận án ............................. 48
Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước tạo dòng plasmid tái tổ hợp ............................... 49
Hình 3.1. Kết quả thu nhận plasmid (A), PCR thu gen hab (B) và sản phẩm PCR
plasmid tái tổ hợp pVFT- hab (C) ................................................................................. 69
Hình 3.2. Kết quả so sánh trình tự gen hab của plasmid tái tổ hợp pVFT-hab
với trình tự gen mã hóa epitope tế bào B liên tục HaBc.. ............................................ 70
Hình 3.3. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của plasmid pVFT-(hab)3
bằng cặp mồi hab-3-F/hab-3-R và cặp mồi gst-F/T7-ter .......................................... 71
Hình 3.4. Kết quả phân tích plasmid pVFT-fljB-hab ly trích từ dòng

tế bào B của kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope HaBc (A) và HaBdc (B) ..... 87
Hình 3.18. Hình ảnh quan sát kết quả thử nghiệm ELISPOT của ba epitope
bảo tồn nhận diện bởi tế bào T.. .................................................................................. 88
Hình 3.19. Kết quả ELISPOT định lượng số tế bào đơn nhân tiết IFN- phân lập
từ lách chuột tiêm các epitope và ủ với các epitope tổng hợp hóa học ..................... 89
x


Hình 3.20. Kết quả ELISA kiểm tra sự hiện diện của kháng thể nhận diện
epitope HaBc của các kháng huyết thanh chuột được tiêm kháng nguyên HaBc
và kháng nguyên (HaBc)3............................................................................................. 90
Hình 3.21. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện epitope HaBc (A) và
peptide tái tổ hợp H;1,2-HaBc (B) của các kháng huyết thanh chuột được tiêm
kháng nguyên HaBc, H;1,2-HaBc, GST-H:1,2 ............................................................. 91
Hình 3.22. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện kháng nguyên HA
virus cúm A/H5N1 của các kháng huyết thanh chuột được tiêm H:1,2-(HaBc)3 (A)
và H:1,2-(HaBdc)3 (B).. ................................................................................................ 93
Hình 3.23. Kết quả ELISPOT phát hiện tế bào đơn nhân tiết cytokin INF-
phân lập từ lách chuột được tiêm peptide GST-H:1,2-(HaT1)3 khi được ủ với
epitope HaT1 (A) và peptide GST-H:1,2-(HaT1)3 (B) ................................................ 95
Hình 3.24. Kết quả ELISPOT định lượng số tế bào đơn nhân tiết IFN- phân lập
từ lách chuột tiêm các epitope tế bào T tổng hợp hóa học và epitope tế bào T
tổng hợp di truyền ....................................................................................................... 95
Hình 3.25. Kết quả HI so sánh khả năng trung hòa kháng nguyên HA
virus cúm A/H5N1 (A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của
kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope và peptide tái tổ hợp của epitope
tế bào B.......................................................................................................................... 98
Hình 3.26. Kết quả HI kiểm tra khả năng trung hòa kháng nguyên HA từ hai
chủng virus cúm A/H5N1 (A/Vietnam/CL26/2004(H5N1)
và A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của kháng huyết thanh chuột

lại hiệu quả bảo hộ của các vắc-xin đang lưu hành. Do đó, các phương pháp mới để
phát triển vắc-xin vẫn tiếp tục được nghiên cứu nhằm cải thiện các loại vắc-xin hiện có,
khắc phục vấn đề hàng năm phải tạo vắc-xin mới cho các chủng virus cúm mới, đồng
thời nhằm nghiên cứu tạo ra một loại vắc-xin đa trị có khả năng phòng ngừa được
nhiều chủng virus cúm khác nhau.
Một trong các hướng tiếp cận đang được quan tâm hiện nay là phát triển vắc-xin
phổ rộng, dựa trên các epitope bảo tồn của hai kháng nguyên bề mặt quan trọng HA và
NA của virus cúm A. Epitope là một vùng nhỏ trên bề mặt cấu trúc kháng nguyên có
khả năng tương tác với các phân tử của hệ thống miễn dịch của vật chủ để gây đáp ứng
miễn dịch. Epitope được phân thành epitope tế bào B (nhận diện bởi tế bào B) và
epitope tế bào T (nhận diện bởi tế bào T). Ưu điểm chính của vắc-xin dựa trên epitope
là khả năng gây đáp ứng miễn dịch với cấu trúc kháng nguyên tối thiểu; do vậy, nếu
chứa đầy đủ các epitope cần thiết, vắc-xin sẽ kích thích phản ứng miễn dịch chuyên
biệt trong khi tránh được những ảnh hưởng không mong muốn.

1


Lời mở đầu

Cùng với sự phát triển của ngành Tin Sinh học, Phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học Phân tử (PTN.CNSHPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Trường ĐH
KHTN) thuộc Đại học Quốc gia TP.HCM (ĐHQG - HCM) quan tâm đến hướng
nghiên cứu phát triển vắc-xin phòng virus cúm A dựa trên epitope bảo tồn nêu trên.
Trong các năm 2008 – 2010, PTN.CNSPT đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao
chủ trì triển khai một đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước là “Nghiên cứu ứng
dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vắc-xin và thuốc”, mã số KC.04.18/06-10. Một
trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope được nhận diện bởi tế
bào B, tế bào T từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A bằng các chương trình
dự đoán epitope khác nhau và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope dự đoán.


-

Đánh giá khả năng trung hòa kháng nguyên HA và trung hòa độc lực virus của
kháng huyết thanh kháng epitope và kháng peptide tái tổ hợp;

-

Đề xuất các kháng nguyên có triển vọng ứng dụng để phát triển vắc-xin và bước
đầu đánh giá hiệu quả trung hòa kháng nguyên HA và trung hòa độc lực virus
của hỗn hợp các kháng nguyên tiềm năng.

3


Tổng quan

1.1.

DỊCH BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 Ở GIA CẦM VÀ Ở NGƢỜI

1.1.1. Bệnh cúm do virus cúm A/H5N1
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A,
thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng truyền nhiễm từ động vật sang người.
Tuy quần thể chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời) và gia cầm (vịt, gà tây, gà,
ngan, ngỗng) là các vật chủ tự nhiên của virus cúm A, nhưng nhóm virus này có khả
năng dễ dàng biến đổi các kháng nguyên bề mặt dẫn đến việc nó có thể xâm nhiễm và
gây bệnh cho người. Ca nhiễm cúm gia cầm ở người do virus cúm A/H5N1 gây ra
được báo cáo lần đầu tiên là tại Hồng Kông năm 1997. Năm 2006, các nghiên cứu trên
một chùm ca nhiễm virus cúm A/H5N1 ở Thái Lan cho thấy sự lan truyền từ người

vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các
tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia
cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt
hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân. Từ năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn
thường xuyên tái phát hàng năm tại nước ta và kéo theo nhiều trường hợp mắc bệnh và
tử vong. Trong những tháng đầu năm 2014, Việt Nam đã có thêm 2 ca nhiễm mới ở
người đã tử vong, nâng tổng số ca nhiễm cúm A/H5N1 trên người ở Việt Nam từ năm
2003 đến ngày 05/05/2014 lên 127 ca với 64 ca tử vong (WHO, 2014) [27] [95].
1.2.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
5


Tổng quan
1.2.1. Phân loại và danh pháp
a. Phân loại
Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Influenzavirus. Họ
Orthomyxoviridae gồm 5 týp A, B, C, D và Isavirus, được phân biệt dựa vào số lượng
sợi RNA trong bộ gen, thành phần nucleoprotein (NP), protein M và ký chủ của virus.
Virus cúm A có bộ gen gồm 8 sợi RNA, có độc lực mạnh, là nguyên nhân gây đại dịch
trên thế giới, lây nhiễm trên chim, heo, ngựa, người. Virus cúm B cũng có bộ gen gồm
8 sợi RNA, chỉ nhiễm trên người. Virus cúm C có bộ gen gồm 7 sợi RNA, độc lực
thấp, nhiễm ở người và heo. Virus cúm D là Thogotovirus được phân lập từ ve (rận) kí
sinh trên chuột lang. Isavirus là virus cúm được phát hiện ở cá vẫn chưa được nghiên
cứu kỹ [15] [52].
Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên bề mặt của protein
Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), virus cúm A được chia thành các thứ týp
(subtype) dựa vào sự tái tổ hợp giữa các thứ týp HA (H1 - H16) và NA (N1 - N9) khác
nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Virus cúm B và C không được chia thành các

cần

ghi

loài

nhiễm

trong

danh

pháp,

ví

dụ:

A/Vietnam/1194/2004(H5N1).
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc, di truyền và tiến hóa
a. Đặc điểm cấu trúc và di truyền
Virus cúm A có dạng hình cầu, thuộc họ virus có màng bao lipid, bên trong
chứa bộ gen RNA sợi đơn âm, liên kết chặt chẽ với các nucleoprotein (NP) gồm có tám
phân đoạn của phức hợp ribonucleoprotein (RNP) mã hoá 11 protein. Trung bình trong
một hạt virus có khoảng 500 phân tử glycoprotein HA (dạng hình que) và NA (dạng
hình nấm), 1000-3000 phân tử protein (M1 và NP) và 20-40 phân tử các polypeptid thứ
yếu. Protein M1 tạo thành một lớp protein nền trong hạt virus, nằm ngay dưới lớp
màng lipid, đóng vai trò là một nhân tố trung gian giữa vỏ lipid và RNP của virus
(Hình 1.2).


2

PB1

86,5

Gắn mũ RNA.

3

PA

84,2

Kéo dài phiên mã.

Vai trò, chức năng

4

HA

76

Gắn với các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ. Dung
hợp màng virus với màng tế bào chủ để đưa
nucleocapsid vào.
Dễ bị biến đổi hình thành nên chủng mới.

5


NS1 và
NS2

NS1: 26,8
NS2: 14,2

NS1: ức chế vận chuyển mRNA.
NS2: đưa ribonucleoprotein ra ngoài nhân.

b. Đặc điểm tiến hóa
Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [4], [61].

8


Tổng quan
-

Sự lệch kháng nguyên (antigenic drift): là sự biến đổi tiến hóa do sự tích lũy

các đột biến điểm xảy ra trong các phân đoạn gen của virus. Tần suất xảy ra đột biến
điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của
virus cúm A) thì có 1 nucleotide bị biến đổi. Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được
sinh ra đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó. Sự tích lũy các đột biến
này qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một thứ týp virus mới có đặc tính kháng
nguyên mới. Đột biến lệch kháng nguyên thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng
nguyên HA và NA.
-