B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O

B YT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N I

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ
NGHIÊN C U XÂY D NG QUY TRÌNH TỔNG HỢP
LEVOTHYROXIN MONONATRI VÀ LIOTHYRONIN
MONONATRI TỪ L-TYROSIN

Chuyên ngành: Công nghệ dư c phẩm và bào ch thuốc
Mã số: 62720402
TÓM T T LUẬN ÁN TI N Sƾ DƯỢC HỌC

Hà N i, năm 2016


Công trình này đư c hoàn thành t i:
-

B môn Công nghiệp Dư c, trường Đ i học Dư c Hà N i

-

B môn Bào ch , trường Đ i học Dư c Hà N i

-

Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương



13

Phổ c ng hưởng từ h t nhân carbon-13

C-NMR

(Carbon13- Nuclear Magnetic Resonance)
1

H-NMR

Phổ c ng hưởng từ h t nhân proton
(Proton- Nuclear Magnetic Resonance)

Ac

Acetyl (CH3CO-)

Acac

Acetyl acetonat

ACN

Acetonitril

DMF

Dimethylformamid [HCON(CH3)2]


Me

Methyl (CH3-)

MS

Phổ khối lư ng (Mass Spectrometry)

OECD

Tổ chức H p tác và Phát triển Kinh t
(Organization for Economic Co-operation
and Development)

Rf

Hệ số lưu giữ (retention factor)


T2

Diiodothyronin (3,5-diiodo-thyronin)

T3

Triiodothyronin, liothyronin (3,5,3’-triiodothyronin)

T3 Na



MỞ Đ U
Tính c p thi t c a lu n án
Kho ng 3 - 5% dân s Vi t Nam bị suy tuyến giáp. B nh gặp ở nhiều
lứa tuổi và nhiều đ i tượng. Trẻ em bị suy giáp sẽ chậm lớn và kém
phát triển trí tu . B nh cũng hay gặp ở phụ nữ có thai, gây hậu qu
nghiêm trọng đến thai nhi. Ngoài s ít trường hợp suy giáp do dùng
thu c kháng giáp có thể hồi phục khi ngưng thu c, còn đa s các
trường hợp khác đều ph i điều trị bằng hormon giáp tr ng c đời.
Hi n nay, nhu cầu s dụng levothyroxin và liothyronin ở nước ta
trong điều trị b nh là khá lớn mà vi c s n xuất nguyên li u trong
nước chưa thực hi n được. Con đường tổng hợp levothyroxin
mononatri và liothyronin mononatri chủ yếu đi t L-tyrosin, nguyên
li u này có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân các nguồn
keratin khác nhau như s ng, tóc… Nếu chúng ta tiến hành nghiên
cứu, s n xuất thành công levothyroxin mononatri và liothyronin
mononatri thì sẽ chủ động được nguồn nguyên li u.
Quyết định s

61/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày

07/05/2007 về vi c phê duy t “Chương trình nghiên cứu khoa học
công ngh trọng điểm qu c gia phát triển công nghi p hóa dược đến
năm 2020” đã đặt ra cho ngành dược Vi t Nam một mục tiêu quan
trọng là tăng cường tự s n xuất nguyên li u làm thu c, tiến tới chủ
động s n xuất thu c trong nước.
Mục tiêu c a lu n án
1. Xây dựng được quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Đánh giá được độ ổn định và độc tính cấp của sản phẩm.


2


Luận án gồm 135 trang, 50 hình, 38 b ng, 148 tài li u tham kh o. B
cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (32 trang), Nguyên li u,
trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Thực nghi m và
kết qu nghiên cứu (65 trang), Bàn luận (25 trang), Kết luận và đề
xuất (2 trang), Tài li u tham kh o (17 trang), Danh mục các công
trình khoa học đã công b liên quan đến đề tài luận án (1 trang),
Danh mục phụ lục (4 trang), Phụ lục (79 trang).
Ch

ng 1: T NG QUAN

1.1. T ng quan v levothyroxin và liothyronin
1.1.1. Levothyroxin mononatri hydrat
I
HO
I

O
I

ONa
NH

O

. x H O


Kích thích các ph n ứng trao đổi làm tăng chuyển hoá cơ b n, tăng
hấp thu glucose ở ruột và tăng phân huỷ glycogen, nên gây tăng
đường huyết, tăng phân huỷ triglycerid, phospholipid và cholesterol,
tăng tổng hợp protein. Không đủ hormon tuyến giáp sẽ gây ra b nh
3


suy giáp, trẻ chậm lớn và không phát triển trí tu , người lớn bị chứng
m ch chậm, gi m thân nhi t, gi m trao đổi chất cơ b n, gi m ho t
động trí não, bướu cổ.
1.2. Các ph

ng pháp t ng hợp levothyroxin mononatri và

liothyronin mononatri
Có 2 phương pháp:
Phương pháp chính tổng hợp qua chất trung gian 3,5-diiodo-Lthyronin:
I
1 . I2/KI/base
1e q

O
HO

I

OH

O

I

O
I

ON a
NH2

O

8

I

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp levothyroxin mononatri (8) và liothyronin
mononatri (7) t 3,5-diiodo-L-thyronin (6)
Trong đó giới thi u các phương pháp tổng hợp 6: Phương pháp của
các tác gi như: C. R. Harington và cộng sự, A. David và cộng sự, W.
Siedel và cộng sự, G. Hillmann, J. R. Chalmers và cộng sự (sau này
có c i tiến của P. Bracco trong 1 s bước quan trọng), P. Z. Anthony
và R. I. Meltzer.
Các phương pháp khác: Phương pháp của Salamonczyk, Phương
pháp oxy hóa của L. G. Ginger.
1.3. Các ph

ng pháp t o hợp ch t diaryl ether

Có 4 phương pháp: Phương pháp ghép đôi nhờ xúc tác Cu: Ph n ứng
Ullmann cổ điển; Ph n ứng ghép đôi Ullmann các dẫn chất có nhóm
4

PHÁP NGHIÊN C U

2.1. Nguyên li u
5

NG


Nguyên li u, hóa chất, dung môi s dụng trong nghiên cứu đều là
lo i đ t tiêu chuẩn tổng hợp. Các dung môi sắc ký đ t tiêu chuẩn
dùng cho HPLC.
2.2. Thi t b nghiên c u
S dụng các thiết bị tổng hợp hóa dược chuyên dụng, các thiết bị
dùng để định tính, định lượng tin cậy của trường Đ i học Dược Hà
Nội, vi n Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Vi n Hàn lâm Khoa học
Vi t Nam, vi n Kiểm nghi m thu c trung ương.
2.3. Ph

ng pháp nghiên c u

2.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Bằng các ph n ứng hữu cơ cơ b n: iodo hóa, acetyl hóa, ester hóa,
oxy hóa, thủy phân, nitro hóa, ngưng tụ, kh hóa, diazo hóa và ph n
ứng t o mu i natri t phenol, t acid carboxylic.
2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
Theo 2 phương pháp: Nhi t độ nóng ch y và Sắc ký lớp m ng.
2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc
Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp, đề tài đã s
dụng phương pháp phổ: IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR.
2.3.4. Phương pháp kiểm nghiệm


O

4 - br o m oa n is o l

I

M eO

I

OE t

OEt
N H Ac

HO

C u I, F e (a c ac ) 3, K 2C O 3 , DM F

I

8 7, 0 %

I

N H Ac

O



O 2N

2

OH

7 7, 9 %

N O2
34

25
O

O
E t OH , S O C l2
8 9, 6 %

O 2N

N H Ac
NO

O N
2

M eO

1 . T s Cl / p y r id i n

2

N H Ac

O

2 . p - m e th o x y p h e n o l

27

26
O
M eO

H N
2

O
OE t

N H Ac

O
NH

2 . I /K I
2
2

I

9 1, 1 %

NH2

HO
3

b . N aI O 3/ N aI

NH 2

HO

OH
N H Ac

HO

8 5,2 %

31

I

9 0, 1 %

O
I

A c 2O / N aO H


HO
33

I
4

4 9, 3 %
O
M eO

I

OEt
N H Ac

O
5

I

Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp 5 theo phương pháp của G. Hillmann

8


3.2. T ng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin
Dùng 2 tác nhân: HBr 47% hoặc HI 57%:
OEt
NHAc


Hình 3.5. Sơ đồ tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin (6)

3.3. T ng hợp và tinh ch levothyroxin mononatri
3.3.1. Tổng hợp levothyroxin (1)
Tổng hợp 1 t 6 theo phương pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco.
O
HO

I
O
6

I
OH

O

I2 / KI, EtNH2

HO

I

86,4 %

I

O
1



2

JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a =

14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b
13

= 4,5 Hz, H-2); 7,1 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’).

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,8 (C-3); 54,7 (C-2);

87,8 (C-3’’, C-5’’); 91,8 (C-3’, C-5’); 125,0 (C-2’’, C-6’’); 139,0 (C1’); 140,9 (C-2’, C-6’); 150,1 (C-4’’); 151,0 (C-1’’); 151,4 (C-4’);
169,4 (C=Ocarboxylic).
3.3.3. So sánh và lựa chọn phương pháp tổng hợp levothyroxin
B ng 3.6. So sánh các phương pháp tổng hợp levothyroxin
Ph
Đặc điểm
Số phản ứng
HS 5 từ Ltyrosin (%)

ng

Ph

ng pháp J.

Ph


58,8

HS 5 từ phản
ứng có dùng
Iod (%)
Các ph n ứng
Hợp chất

không quá phức

iodoni 33 d

t p, trang thiết bị

Các đặc điểm

gây nổ, khó

phù hợp với điều

khác

tinh chế, hi u

ki n hi n có. Quy

suất thấp

trình khá ổn định.



O

HO

I

I

O

N H2

O
1

Na2C O3 bh

I

8

ONa
NH2
I

K t qu : tonc: 206,5-208,9 (phân hủy); Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH
(70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C = 2 trong HCl
0,2M / EtOH 96%); Hàm lượng: 97,9 %; Kết quả phân tích phổ: IR
(KBr), υmax (cm-1): 3458 (NH2); 3060 (C-Hthơm); 2910 (C-Hno); 1591

I

OH
N H2

O
1

N aH C O3 bh

O

HO

I

I

O
8

I

11

ON a
NH2
I




6

OH
NH2

2

I
NaOH 50 %
O

O
HO

I

I

O

HCl 1 N

OH
NH2

2

I


Liothyronin: tonc: 236-237oC; Rf = 0,32 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu
mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR = 4,3 phút). Điều ki n sắc ký:
Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid
H3PO4 trong 1000,0 mL. T c độ dòng: 1,5 mL/phút. Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả
phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3178 (OHphenol); 3035 (CHthơm); 2762 (N+-Hmu

i nội phân t

); 1599 (C=Ocarboxylat mu

i nội phân t

); 1570

và 1496 (C=Cthơm); 1246 và 1175 (C-Odiaryl ether); 534 (C-I). ESI-MS
(m/z): 651,6 [M+H]+ (CTPT C15H12I3NO4, M = 650,97). 1H-NMR
12


(500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2JH3a-H3b = 14,0 Hz,
3

JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 =

4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2-H3b = 4,5 Hz, H-2);
6,6 (1H, dd, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, 4JH5’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-5’’); 6,8 (1H, d,
JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, H-6’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’-H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8

3


140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,8 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 170,0
(C=Ocarboxylat).
3.5. Triển khai quy trình t ng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri
L - ty ro s i n
N IT R O H Ó A

H N O 36 8 % /H 2S O 4 9 8 %

N -A C E T Y L H Ó A

A c 2O / N a O H 2 N

E ST ER H ÓA

E t O H / S O C l2

E TH ER H ÓA

p -m e t h o x y p h e n o l/p y r i d in

T s C l / p y ri d i n

K H HÓ A
á p s u ấ t t h ườ n g

H 2/ P d -C

D IA Z O H Ó A
IO D O H Ó A

L e v o t h y ro x i n
m o n o n a tr i

Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri
14


Kh i lượng L-tyrosin: 525,0 g. Hi u suất toàn chặng: levothyroxin
mononatri đ t 27,4 %, liothyronin mononatri đ t 23,0 %. Các ph n
ứng cho hi u suất tương đ i ổn định.
3.6. Kiểm tra ch t l ợng s n phẩm theo tiêu chuẩn d ợc điển
Nguyên li u liothyronin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn
theo USP 34 và levothyroxin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu
chuẩn theo BP 2010.
3.7. Đánh giá độ n đ nh c a s n phẩm
S li u độ ổn định ở điều ki n lão hóa cấp t c cho thấy 2 s n phẩm
không có biến đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theo dõi. Dữ
li u độ ổn định dài h n cho thấy hàm lượng trong giới h n qui định.
Tuổi thọ của levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri được
dự đoán lần lượt là 26 tháng và 30 tháng.
3.8. Đánh giá độc tính c p
C hai nguyên li u không độc, không xác định được LD50.
Ch

ng 4: BÀN LU N

4.1. V t ng hợp hóa học
4.1.1. Các phương pháp tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin
Qua tổng quan tài li u chúng tôi tìm được 5 phương pháp tổng hợp

được áp dụng trong tổng hợp levothyroxin với hi u suất t o ether là
81 %. Không chỉ d ng ở đó, đến năm 2010, hai tác gi người Trung
Qu c là Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự đã tiếp tục c i
tiến phương pháp t o ether Ullmann kết hợp xúc tác Cu/Fe đã làm
gi m đáng kể lượng chất xúc tác. Các tác gi này đã tổng hợp thành
công cấu trúc diaryl ether của hàng chục chất với quy mô lớn và hi u
suất tương đ i t t. Nghiên cứu của Xiaoyan Liu và Songlin Zhang
cùng cộng sự t o ý tưởng cho chúng tôi trong quá trình tìm kiếm
phương pháp mới tổng hợp cấu trúc diaryl ether của hormon giáp
tr ng. Chúng tôi th nghi m ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa
3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester và 4-bromoanisol với xúc
tác là các nguồn đồng và ph i t là các nguồn sắt. Nghiên cứu bước
đầu cho thấy, ph n ứng có nhiều ưu điểm như: d tiến hành, thích
16


hợp để nâng cấp quy trình. Tuy nhiên cũng có một s vấn đề cần
khắc phục như khi tiến hành ph n ứng ph i đặc bi t tránh nước, tất c
các chất tham gia ph n ứng cũng như dung môi ph i đ m b o khan
để hợp chất 4-brommoanisol không bị thủy phân t o ra hợp chất
phenol. Đồng thời khi kết thúc ph i tiến hành x lý ngay để tránh
ph n ứng thủy phân s n phẩm trong môi trường kiềm.
Về cơ chế của ph n ứng, theo Ying-Peng Zhang và cộng sự, có thể
gi i thích như sau:
PhOH

Fe(acac)3 HO-Cu-OPh
Fe(acac)3

(a)

Cu
O
O

d

HO→Cu←OPh
a

17


Cu (I) thường t o phức với s ph i trí 2, do đó nếu dùng xúc tác Cu
(I) thì ưu tiên phức (a). Cu (II) thường t o phức với s ph i trí 4, do
đó nếu dùng xúc tác Cu (II) thì ưu tiên phức (d). Phức (a) tham gia
vào chu trình ph n ứng theo cơ chế ph n ứng đã đề cập ở trên nên
hi u suất ph n ứng cao nhất khi dùng xúc tác CuI.
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của phối tử: ph i t Fe(acac)3 cho
hi u suất ph n ứng cao nhất, có thể gi i thích do có cấu trúc phức
chất khác hẳn cấu trúc thông thường của các ph i t khác nên kh
năng tham gia ph n ứng của ph i t sắt (III) acetylacetonat cao nhất.
Mặc dù hi u suất của ph n ứng t o ether theo phương pháp Ullmann
tương đ i cao nhưng do thời gian nghiên cứu h n hẹp và nguyên li u
đắt tiền là iod l i được dùng ngay t ph n ứng đầu tiên của quy trình
nên vi c áp dụng để triển khai s n xuất trong thời điểm này là chưa
thích hợp.
Ph

ng pháp qua hợp ch t nitro c a tác gi J. R. Chalmers và P.


O CH 3

+
N
H

R
N

26

Cl
R
tosylat ester

N
H3 C O

4 -me thoxyphe nol

27

O-

+ H3 C O
N
H

- OT s



Ph

ng pháp qua muối iodoni c a G. Hillmann: Tổng hợp 6 theo

con đường qua mu i iodoni qua 5 giai đo n. Hi u suất 3 ph n ứng
đầu tiên tương đ i cao, hi u suất toàn chặng 33,3% (không tính hi u
suất ph n ứng tổng hợp mu i iodoni). Riêng ph n ứng tổng hợp mu i
iodoni, dùng đến các nguyên li u natri iodat và kali iodid đắt tiền,
nhưng cho hi u suất rất thấp (12,3%). Hơn nữa, s n phẩm khó tinh
chế và d gây nổ. Do vậy khó làm ph n ứng với cỡ mẻ lớn hơn. Một
s kh o sát thay đổi tỉ l natri iodat và anhydrid acetic nhưng không
tăng được hi u suất ph n ứng.
4.1.2. Về quá trình tổng hợp levothyroxin và liothyronin từ 3,5diiodo-L-thyronin
Vi c định hướng s n phẩm của ph n ứng iodo hóa 3,5-diiodo-Lthyronin (6 hoặc T2) để được levothyroxin hay liothyronin khác nhau
ở tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin, t c độ tiến hành ph n ứng iodo
hóa và nhi t độ của ph n ứng. Với tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin
= 1/1 thì quá trình iodo hóa chủ yếu x y ra ở 1 vị trí ortho- so với
nhóm OH phenol của 3,5-diiodo-L-thyronin. Với tỷ l mol I2/3,5diiodo-L-thyronin ≥ 2 sẽ t o levothyroxin. Để h n chế sự t o thành
levothyroxin trong ph n ứng tổng hợp liothyronin, cần lưu ý dùng
đúng tỉ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin và h n chế t c độ ph n.
4.1.3. Phương pháp tạo muối mononatri c a levothyroxin và
liothyronin
Phương pháp t o mu i mononatri của levothyroxin (T4) và
liothyronin (T3) thông qua mu i dinatri về b n chất là để tinh chế T4
và T3. Qua tổng quan tài li u, chúng tôi nhận thấy để t o mu i
mononatri tất c các tác gi đều dùng Na2CO3 bão hòa.
20



X

O

NaO

I

I

O

N H2
I

ON a
N H2
I

X

O

HO

I

I

O