viện hoá học
viện khoa học và công nghệ việt nam
18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội
Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật
đề tài:
"nghiên cứu xây dựng quy trình
tổng hợp cyclophosphamide làm
thuốc điều trị ung th"

GS. TSKH. Trần Văn Sung
6500
10/9/2007

Hà Nội, 4 - 2006

Bản quyền 2006 thuộc VHH - VAST
Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện
trởng VHH - VAST trừ trờng hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu

Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nớc,
mã số KC 10. 25
Danh sách cán bộ tham giathực hiện đề tài

Họ và tên Cơ quan công tác
Chủ nhiệm đề tài
1. GS.TSKH. Trần Văn Sung Viện Hoá học, Viện KH và CNVN
Cán bộ tham gia nghiên cứu
1. PGS. TS. Nguyễn Hữu Định Khoa Hoá
Trờng ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội
2. ThS. Nguyễn Việt Thắng nt
3. ThS. Trần Văn Lộc Viện Hoá học, Viện KH và CNVN
4. ThS. Trần Văn Chiến nt
5. ThS. Trần Đức Quân nt
6. CN. Phạm Thị Ninh nt
7. TS. Trịnh Thị Thuỷ nt
8. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh nt
9. TS. Nguyễn Thanh Đạm Bệnh Viện K Hà Nội
10. ThS. Nguyễn Tuyết Mai nt
11. DS. Lê Tiến Dũng XN Dợc phẩm TW I
12. TS. Phùng Thị Vinh Viện Kiểm nghiệm
Mục lục

Tr

19
Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide
28
2.2.2.
Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học của sản phẩm
cyclophosphamide tổng hợp đợc
29
2.2.3.
Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn
Dợc điển Anh, BP 2001
32
2.2.4.
Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của sản phẩm
cyclophosphamide
33
2.2.5. Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm
36
2.2.6.
Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide pha
tiêm
39
2.2.6.1. Đề cơng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
39
2.2.6.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
42
2.2.7. Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide
48
2.2.7.1. Nghiên cứu độ bền của nguyên liệu cyclophosphamide
48
2.2.7.2.

GMP. Thuốc bào chế xong phải đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm của Dợc điển Anh
BP 2001.
Nghiên cứu đánh giá lâm sàng giai đoạn I thuốc cyclophosphamide tổng hợp
đợc trên bệnh nhân ung th.
1.2. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu:
1.2.1. Nguyên liệu:
Các hoá chất đợc sử dụng có độ tinh khiết P. A. của hãng Merck, CHLB
Đức.
1.2.2. Phơng pháp nghiên cứu:
Các phơng pháp dùng để phân tích cấu trúc của cyclophosphamide tổng hợp
đợc là hiện đại và phù hợp nh phổ MS, LC/MS, IR và NMR (
1
H -,
13
C -
NMR) đợc thực hiện tại Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
Các phơng pháp tổng hợp đợc dựa theo patent của Đức, Liên minh Châu
Âu, Mỹ có kết hợp với các tài liệu tham khảo khác, đợc thực hiện tại trờng
ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội và Viện Hoá học, Viện KH và CNVN.
2
Các phơng pháp nghiên cứu về y dợc đợc sử dụng là những phơng pháp
quy chuẩn của Bộ Y tế, đợc thực hiện tại các cơ quan khoa học do Bộ Y tế
chỉ định nh Viện Kiểm nghiệm, xí nghiệp Dợc phẩm TW I và bệnh viện K
Hà Nội.
1.3. Các kết quả đã đạt đợc:
Đã tiến hành nghiên cứu và đề ra đợc quy trình khả thi có hiệu quả kinh tế
và ứng dụng quy trình này để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide.
Đã đa ra đợc bộ phổ chuẩn của cyclophosphamide tổng hợp đợc gồm: IR,
MS, LC/ MS,

tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoặc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O-
trimethylendiamidophosphat (I); công thức tổng là C
7
H
15
Cl
2
N
2
O
2
P. H
2
O, khối lợng
phân tử là 279,1.
Công thức cấu tạo là:
HN
P
O
O
N
H
2
C
H
2
C
Cl
Cl
. H

O
N
CH
2
CH
2
Cl
Cl
-H
+
+H
+
H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Cl
Cl
- Cl

H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Nu
Nu
H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
Nu
+ Nu

A
) đợc giải
thích qua dãy phản ứng bao gồm: đóng vòng nội phân tử; mở vòng nucleophil. Quá
trình này lặp lại hai lần dẫn đến sản phẩm cuối cùng đợc alkyl hoá hai lần
(
B
).
Tuy nhiên, cơ chế chính xác của quá trình alkyl hoá của chất
(
A
) vẫn là vấn
đề còn ít đợc biết. Các bớc theo trình tự trên bao gồm các chất azinidin trung gian
đã đợc minh chứng bằng các thí nghiệm đơtêrô hoá. Nhng liệu chất
(
A
) sẽ tham
gia phản ứng alkyl hoá nguyên vẹn hay liên kết P-N sẽ bị cắt trớc khi alkyl hoá thì
hiện vẫn còn tranh cãi [6].
Theo nguyên lý về ''dạng vận chuyển" (transport) và '' dạng hoạt tính '' (active
form) của một biệt dợc đối với các chất có tác dụng ankyl hoá thì một hoạt chất
cần đợc đa vào cơ thể ở ''dạng vận chuyển'' tức là ở dạng cha có hoạt tính. Dạng
này sẽ chuyển thành ''dạng hoạt tính'' trong cơ thể và nếu có thể thì ngay tại vị trí
5
cần điều trị có nghĩa là làm tăng độ chọn lọc của thuốc. Ví dụ: Đối với các chất dễ
bị loại nitơ thì hợp chất chứa nhóm oxit nitơ (NO) là một '' dạng vận chuyển''
thực thụ. Nguyên lý này đã đợc áp dụng với loại thuốc chữa ung th tiền liệt tuyến
là stilbeoestroldiphosphate.
Nh đã biết thì trong cơ thể ngời bệnh, tại bộ phận bị ung th có tồn tại một
enzym dạng phosphamidasa và phosphatasa có thể thuỷ phân đợc liên kết
phosphamide và este của axit phosphoric.

cyclophosphamide là rất khả quan về mặt dợc lý và lâm sàng [4].
Cơ chế biến đổi của cyclophosphamide trong cơ thể đã đợc C.L. Roux và
cộng sự tiếp tục nghiên cứu [6].
6
Một dẫn xuất khác của cyclophosphamide có nhóm thế ở mạch vòng cũng đã
đợc tổng hợp để nghiên cứu hoạt tính chống ung th [7, 8, 25].
Cyclophosphamide còn đợc sử dụng làm độc tố cho sơn chống hà dùng cho
các tàu biển [9].
Trong những năm gần đây, tính chất dợc lý của cyclophosphamide vẫn còn
đợc tiếp tục nghiên cứu [10,11,12].
Kể từ khi tìm ra cyclophosphamide vào năm 1956 và bản quyền sáng chế
(patent) đầu tiên đợc chấp nhận vào năm 1957 [26] cho đến nay vẫn luôn có các
bản quyền sáng chế mới về tổng hợp cyclophosphamide đợc đăng ký. Bản quyền
sáng chế gần đây nhất mà chúng tôi có đợc là của Ulf Niemeyer và cộng sự vào
cuối năm 2001 [28]. Nhìn chung các patent về tổng hợp cyclophosphamide đều dựa
theo sơ đồ nh sau:
Y
+
N
OH
R
4
R
3
Y
+
POCl
3
Triethylamin


stage one-pot reaction). Lợi thế của giải pháp kỹ thuật này là:
Hiệu suất tổng của phản ứng cao
Không phải tách sản phẩm trung gian
Chi phí cho thiết bị phản ứng thấp
Giảm thời gian sản xuất
Tiêu thụ ít nguyên liệu đầu
Không phải chạy sắc ký hoặc các bớc tinh chế khác
Giảm lợng chất thải gây độc hại tới môi trờng
Để thực hiện kỹ thuật này, ngời ta cho phosphoryl halogenid và hai chất
amin là bis 2- chloroethyl amin và n- propylamin- 3- ol tác dụng với nhau trong một
dung môi hữu cơ trơ với một chất kiềm hỗ trợ, tránh sự có mặt của nớc và alcol,
7
không cần tách các sản phẩm trung gian. Các tác nhân đợc cho lần lợt vào bình
phản ứng.
Điều đặc biệt quan trọng ở đây là hạn chế tối đa ảnh hởng của nớc hoặc
hơi ẩm đối với các tác nhân, đặc biệt là POCl
3
. Nếu có mặt nớc trong môi trờng
phản ứng thì sẽ có nhiều sản phẩm phụ và hiệu suất thu đợc cyclophosphamide bị
giảm nhanh chóng. Và nh vậy sản phẩm chỉ kết tinh đợc sau khi phải có thêm
bớc tinh chế ví dụ chạy sắc ký cột. Những quy trình tổng hợp cyclophosphamide
trớc năm 2001 cha đánh giá đợc hết mức độ ảnh hởng của nớc đối với phản
ứng này.
Ngoài nớc ra, thì các alcol cũng không đợc có mặt trong môi trờng phản
ứng. Ngời ta đã chứng minh đợc rằng: sự có mặt lợng vết methanol hoặc ethanol
trong dung môi sẽ tạo ra nhiều phản ứng phụ và làm giảm hiệu suất.
Phản ứng đợc thực hiện trong một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi
hữu cơ trơ. Có thể sử dụng các dung môi nh: dichlorometan, 1,2- dichloroetan,
chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran và toluen.
Nồng độ của hỗn hợp phản ứng, tức là tỷ lệ giữa các chất 1, 2, 3, với thể tích

C đến 10
o
C. Nhiệt độ có thể tăng tới 100
o
C sau khi đã phản
ứng đợc một nửa, hoặc tăng đến nhiệt độ sôi của dung môi nếu cần thiết bằng cách
đun nóng.
Trong một trờng hợp khác ngời ta cũng có thể tiến hành nh sau:
Bớc một: Cho chất bis- 2- chloroethylamin vào bình, sau đó cho từ từ
n- propylamin- 3- ol cùng với chất kiềm hỗ trợ (ví dụ: triethylamin) vào bình.
Chất n- propylamin- 3- ol có thể đa vào bình phản ứng ở dạng muối và trong
dung môi; chất bis- 2- chloroethylamin và kiềm hỗ trợ sẽ lần lợt đợc đa từ
từ vào bình, hoặc cũng có thể đợc cho chảy cùng một lúc vào bình từ hai
ngả sao cho chất kiềm hỗ trợ luôn luôn d so với bis- 2- chloroethylamin.
Bớc hai: POCl
3
có thể đợc cho từ từ cùng với chất kiềm hỗ trợ vào
hỗn hợp phản ứng của bớc một, hoặc ngợc lại, hỗn hợp của bớc một đợc
cho từ từ vào dung dịch POCl
3
và chất kiềm hỗ trợ.
Nhằm giảm thiểu tối đa lợng nớc trong hỗn hợp phản ứng thì tất cả các hoá
chất và thiết bị phản ứng đều phải khô tuyệt đối.
Ví dụ: phải sấy nóng thiết bị phản ứng để loại hơi nớc, làm khan dung môi
và các tác nhân trớc lúc phản ứng. POCl
3
phải cất lại trong điều kiện khô trớc khi
dùng. Hàm lợng nớc trớc lúc phản ứng không đợc vợt quá 0,5%, tốt hơn cả là
trong khoảng từ 0,001% đến 0,1%.
Các sản phẩm phụ sẽ đợc hạn chế nếu hỗn hợp phản ứng đợc xử lý với các

2.1.1.3. Tiêu chuẩn của cyclophosphamide đợc mô tả trong các Dợc điển
Trong Dợc điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 3, Nhà xuất bản Y học,
năm 2002 chúng tôi không thấy có cyclophosphamide.
Trong Dợc điển Anh BP 2001 trang 510, những tiêu chuẩn chính của
cyclophosphamide đợc mô tả nh sau:
Cyclophosphamide có hàm lợng không dới 98,0% và không quá
đơng lợng của 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino]
tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tính theo chất khan.
Là bột tinh thể màu trắng hoặc gần trắng, tan trong nớc, tan hoàn
toàn trong cồn, tan ít trong ete.
Điểm nóng chảy 51
o
C. Chênh lệch điểm nóng chảy không đợc quá 2
o
C.
10
pH: Dung dịch của 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml nớc đã
khử CO
2
sẽ có pH từ 4,0 đến 6,0, đo ngay sau khi pha.
Cl
-
(chlorid): Hoà tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml nớc
đã khử CO
2
. Hàm lợng ion Cl
-
của dung dịch vừa pha chế không đợc
vợt quá 330 ppm.
PO

đợc vợt quá 0,002%.
Dợc điển Nhật Bản JP XIII trang 314:
Cyclophosphamide có hàm lợng không dới 97,0%
Tinh thể trắng hoặc bột tinh thể.
Tan rất tốt trong axit acetic băng, tan hoàn toàn trong cồn, trong
anhydrit acetic và trong CHCl
3
, tan trong nớc và ete.
Điểm nóng chảy 45
o
C - 53
o
C.
Màu sắc dung dịch: Hoà tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml
nớc, dung dịch phải trong suốt và không màu.
Cl
-
: Kiểm tra với dung dịch của 0,40 gam cyclophosphamide ở nhiệt
độ không quá 20
o
C. Dung dịch chuẩn là: 0,40 ml 0,01 mol/ lit axit
HCl. Hàm lợng ion Cl
-
không quá 0,036%.
Kim loại nặng: Kiểm tra với 1,0 gam cyclophosphamide. Dung dịch so
sánh đợc pha với 2,0 ml dung dịch chì tiêu chuẩn. Hàm lợng kim
loại nặng không quá 20 ppm.
Nớc: Từ 5,7 đến 7,0% (0,5 gam, chuẩn độ trực tiếp).
Đóng thùng và bảo quản: Thùng kín, bảo quản ở dới 30
o

Cyclophosphamide có thể gây ra các tác dụng phụ. Tuy nhiên các tác dụng
ngoại ý thờng phụ thuộc vào liều dùng và hầu hết các trờng hợp bị tác dụng phụ
đều có thể hồi phục đợc.
Các tác dụng phụ có thể có của cyclophosphamide:
+ Về huyết học: Giảm bạch cầu kèm theo nguy cơ bị nhiễm trùng; giảm tiểu
cầu kèm tăng nguy cơ xuất huyết; thiếu máu kèm giảm Hemoglobine (trên
2g/ 100ml so với giá trị ban đầu).
13
+ Về tiêu hoá: Buồn nôn và ói mửa
+ Đờng niệu sinh dục: Viêm bàng quang
+ Đối với gan: ít gặp
+ Rụng tóc
2.1.1.5. Các dạng sản phẩm chính của cyclophosphamide và nhu cầu về
thuốc cyclophosphamide
Trên thị trờng trong nớc và quốc tế hiện nay có các thơng phẩm chính
chứa hoạt chất cyclophosphamide nh sau:
Endoxan dạng viên bao và dạng bột pha tiêm của hãng Asta Medica [17],
Cytoxan dạng viên nén và bột pha tiêm của hãng Bristol - Myers Squibb.
Neosar dạng bột pha tiêm của hãng Pharmacia & Upjohn.
Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm nớc ta có khoảng 150.000 ngời mới
mắc bệnh ung th cần đợc điều trị [16]. Số lợng bệnh nhân ngày càng tăng
do tỷ lệ sống kéo dài của những bệnh nhân ung th đã mắc từ 3 đến 5 năm.
Trong số đó khoảng 30% cần đợc điều trị tiếp ở giai đoạn cuối và giai đoạn
di căn.
Nh vậy, trong 1 năm có khoảng 50.000 bệnh nhân cần dùng
cyclophosphamide đơn độc hay phối hợp với các loại thuốc khác. Mỗi đợt điều trị
cần sử dụng 500mg/ m
2
da; trung bình cần 6 đợt điều trị cho một bệnh nhân. Diện
tích bề mặt da trung bình của ngời Việt Nam là 1,6m

M số: KC.10. 25
Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 1/ 1/ 2004 đến 31/ 12 / 2005)
Cấp quản lý: Nhà nớc
Kinh phí: Tổng số: 2.900 triệu đồng
Trong đó, từ Ngân sách SNKH: 1.900 triệu đồng
Thuộc chơng trình: Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp nhà n
ớc giai đoạn
2001-2005: "Khoa học và Công nghệ phục vụ bảo vệ và
chăm sóc sức khỏe cộng đồng".
Chủ nhiệm đề tài: Họ và tên: Trần Văn Sung
Học hàm/học vị: GS. TSKH.
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp (NCVCC)
Điện thoại: (CQ)/ 04-7564794; (NR) 04-8570894;
Fax: 04-8361283; Mobile: 0913210527
15
E-mail: [email protected]
Địa chỉ cơ quan: Viện Hoá học, Viện KH & CNVN
18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số nhà 35, Ngõ 198, phố Thái Hà, Hà Nội
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Điện thoại: 04-7564312; Fax: 04- 8361283
E-mail: [email protected]
Địa chỉ: 18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội
Mục tiêu của đề tài: Xây dựng đợc quy trình công nghệ tổng hợp và tinh chế
thuốc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn Dợc điển Anh
(BP- 2001).
Nội dung nghiên cứu:
+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế cyclophosphamide
+ Kiểm tra độ tinh khiết của các hoá chất, dung môi sử dụng
+ Tinh chế các hoá chất, dung môi sử dụng

- Các xét nghiệm cận lâm sàng ( phải có xét nghiệm mô bệnh học)
- Chẩn đoán xác định bệnh
- Chẩn đoán giai đoạn bệnh
- Các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
+ Tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I sau khi đã đợc sự cho phép của
Bộ Y tế.
- Tiến hành điều trị bệnh nhân theo phác đồ
- Đánh giá kết quả đáp ứng của bệnh
- Theo dõi các tác dụng phụ và độc tính của thuốc
- Báo cáo kết quả thử lâm sàng.
17
Tiến độ thực hiện
TT
Các bớc/công đoạn thực hiện Sản phẩm phải đạt Thời gian
1 2 3 4
1
Xây dựng thuyết minh chi
tiết của đề tài
Bản thuyết minh chi tiết
1/ 1/ 2004 -
15/ 1/ 2004
2
Nghiên cứu quy trình tổng
hợp giai đoạn I (chất VIII)
Quy trình tổng hợp giai đoạn I
1/ 2004 -
6/ 2004
3
Nghiên cứu quy trình tổng
hợp giai đoạn II (chất IX)

cyclophosphamide
Báo cáo kết quả
6/ 2004 -
1/ 2005
9
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
của cyclophosphamide
TCCS
8/ 2004 -
12/2004
10 Báo cáo sơ kết 12/ 2004
11
Đóng lọ thuốc bột và ống
nớc pha tiêm để thử lâm
sàng
Tiêu chuẩn GMP
12/ 2004 -
1/ 2005
12
Xây dựng đề cơng thử lâm
sàng
Hồ sơ
1/2005 -
3/2005
13
Thử lâm sàng giai đoạn I
Báo cáo kết quả
3/2005 -
11/2005
14

7
H
15
Cl
2
N
2
O
2
P. H
2
O
CAS [6055 - 19 - 2]

gram 4250g
-
Trọng lợng phân tử
C 30,12 % H 6,14 %
Cl 25,40 % N 10,04 %
O 17,20 % P 11,10 %
đơn vị
khối
279,10 279,10
- Điểm chảy
0
C 40-45 41-45
-
Độ tan
Trong nớc
g/l 40 40

trong suốt. Mối hàn ống không
đợc có vệt đen
ml 10 10
15.000
ống

NH
P
O
N
O
CH
2
CH
2
Cl
H
2
O
.
Cl
CH
2
CH
2
19
Kinh phí thực hiện đề tài phân theo các khoản chi
Đơn vị tính: Triệu đồng
Trong đó
TT Nguồn kinh phí Tổng số

2.2.1. Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide:
Qua công tác su tầm và tham khảo tài liệu về các phơng pháp tổng hợp
cyclophosphamide của các nhà khoa học trên thế giới [18 - 24], thì việc tổng hợp
cyclophosphamide dựa theo bản quyền sáng chế của các nhà khoa học Đức [22 - 24]
là tơng đối thuận lợi và có tính khả thi cao.
Các cán bộ khoa học của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam và của trờng Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đã
tiến hành nghiên cứu tổng hợp cyclophosphamide ở quy mô phòng thí nghiệm theo
một số quy trình tổng hợp sau:
Các quy trình tổng hợp cyclophosphamide đã đợc nghiên cứu:
Quy trình I
:
a/ Tổng hợp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride
NH
HOCH
2
CH
2
HOCH
2
CH
2
SOCl
2
+
CHCl
3
NH . HCl
ClCH
2

+
HO CH
2
CH
2
CH
2
NH
2
2 Et
3
N
CH
2
Cl
2
NH
P
O
O
Cl
+2 Et
3
N . HCl
(Sản phẩm trung gian I)

NH
P
O
O

2
CH
2
Cl
N
+
2 Et
3
N . HCl
(Cyclophosphamide)

+ Tổng hợp "Sản phẩm trung gian I"
Dung dịch gồm 76g (1 mol) 3-amino-1-propanol và 222g (2,2 mol) triethyl
amine trong 1000 ml CH
2
Cl
2
đợc làm lạnh tới -10
o
C bằng hỗn hợp đá muối. Sau
đó vừa khuấy vừa nhỏ vào dung dịch trên từng giọt dung dịch gồm 153g (1 mol)
POCl
3
trong 500 ml CH
2
Cl
2
đã

đợc làm lạnh trớc. Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong

O, để qua đêm ở + 5
o
C. Lọc, rửa kết tủa bằng nớc lạnh, thu đợc 218 g
(78%) cyclophosphamide sạch: Đnc = 41 - 45
o
C.