Báo cáo TH CNLM-MT
Bài 1: Lý thuyết chung
ĐỘNG HỌC LÊN MEN THU SINH KHỐI VÀ QUY TRÌNH CHUNG SẢN
XUẤT CHẾ PHẨM SINH KHỐI.
1. Động học lên men thu sinh khối:
1.1. Phương pháp nuôi cấy sản xuất sinh khối
- Nuôi cấy theo me
- Nuôi cấy liên tục
- Nuôi cấy theo me tiếp liệu liên tục
1.2. Phương trình động học nuôi cấy theo me
X= x0eµt ; N= N0 eµt ; OD= OD0 eµt
- Xác định x bằng phương pháp khối lượng
- Xác định N bằng phương pháp đổ/trải đĩa nếm khuẩn lạc
- Xác định OD bằng phương pháp đo độ đục

Hình 1.1.Đo OD canh trường bằng spectrophotometer
A) Mẫu trắng: môi trường trong suốt, cường độ ánh sáng đến được tế bào
quang điện được coi là cường độ lớn nhất và OD được chỉnh về 0 ở
bước sóng đo (thường 600 – 610 nm).
B) Khi trong cuvette có vi khuẩn, một phần ánh sáng bị phân tán và không
đến được tế bào quang điện, OD>0.

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 1


Báo cáo TH CNLM-MT
Chú ý: Chỉ đo OD trực tiếp nếu môi trường dinh dưỡng không màu hoặc
màu nhạt. Khi môi trường có màu nâu phải ly tâm mẫu, sử dụng môi
trường trong suốt hoặc nước muối sinh lý để đưa về thể tích ban đầu và làm
mẫu sáng.
Đối với một số VSV, OD chỉ tuyến tính với nồng độ tế bào khi nồng độ

Để có được đường cong tăng tưởng cần thực hiện đo OD như bảng sau:
Thời

Thời gian

OD

điểm
08:15

(min)
0

...
12:00
...

OD pha OD hc

logODh.c

loãng
0.055 n=1

loãng
-

0.055

-1.26

n=4
...

...

Hình 1.4. Đường cong tăng trưởng VSV trong nuôi cấy theo me (logOD theo t).
1.4. Các thông số từ đường cong tăng trưởng
- tlag, tlog
- μ = [ln(OD/ODo)]/(t-to)=log(OD/ODo)/[loge*(t-to)]
=(logOD-logODo)/0.434(t-to)= 2.303(logOD-logODo)/(t-to)
- μmax
- td = thời gian thế hệ = 2.303*log2/μmax = 0.69/μmax
- Để xác định năng suất sinh khối:

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 4


Báo cáo TH CNLM-MT
Năng suất R = (Xf-Xo)/(tf-to)
Cần xác định Xf, Xo hoặc Nf, N0
Muốn vậy cần thiết lập đường chuẩn tế bào
1.5.

Đường chuẩn tế bào: tương quan tuyến tính giữa OD (OD

độ tiệt trùng)

Nhân giống
(môi trường nhân giống)

Cấy giống

Lên men thu sinh khối

(tỉ lệ % thể tích, nồng độ -Xo

(t,oxy, lấy mẫu, thời gian)

Downstream processing

Sản phẩm

Tạo chế phẩm

Hình 1.5. Quy trình chung sản xuất sinh khối
1.7.

Chuẩn bị môi trường

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 7


Báo cáo TH CNLM-MT
Chú ý trong nhiều trường hợp có sự khác biệt giữa môi trường giữ giống thạch


Báo cáo TH CNLM-MT
Tiêu chuẩn chất mang:
-

Re
Sẳn có trên thị trường
Chứa hàm lượng chất hữu cơ cao
Không chứa chất độc
Có khả năng giữ nước tốt (>50%)
Dễ dàng sử dụng
1.11.2. Chế phẩm lỏng (liquid products)
Sinh khối thường được đưa về dạng trạng thái ngủ, tốt nhất trong trường hợp vi
sinh vật có kén, bào tử

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 9


Báo cáo TH CNLM-MT
BÀI 2: SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AZOTOBACTER SPP. (PHÂN BÓN CỐ
ĐỊNH ĐẠM)
I.1.

Lý thuyết:

Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vsv và dung làm
nguồn kiếm tạo tế bào. Các vsv cố định N sống tự do có nhiều trong đất, hay
sống cộng sinh trong nốt sần cây họ đậu. Nguồn N có thể là nitơ phân tử, cũng
có thể là muối amon, nitrate, nitrite, amoni acid. Tùy thuộc nồng độ các hợp
chất có nitơ này trong môi trường mà quá trình cố định nitơ phân tử sẽ bị ức chế

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 10


Báo cáo TH CNLM-MT
Thiết bị:
- Máy lắc
- Máy đo quang phổ
- Kính hiển vi
2. Tiến hành thí nghiệm:
2.1.
Giữ giống ( cấy truyền từ đĩa Petri vào thạch nghiêng)
giữ giống
Cấy truyền từ

mt thạch nghiêng Ashby (1) + gar -8ml/ống

đĩa Petri
nhân giống

mt lỏng Ashby (2)_50ml lắc 150v/ph

- Chuẩn bị 10 ống thạch nghiêng chứa Ashby (1) 8ml/ống. Chọn khuẩn lạc đặc
trưng từ đĩa petri cấy vào ống thạch nghiêng.
- Ủ 300 C, trong 48 giờ.
2.2.
Nhân giống:
- Chuẩn bị 4 bình tam giác môi trường lỏng Ashby (2) 50ml/1bình : lắc 150
vòng/phút.
- Kiểm tra OD sau 36 giờ


10 sucrose
0.5
0.5
0.2

0.2
0.2
0.1
0.2
5
15
7
300C
48 h
Thạch nghiêng
Cấy ria

0.1
10
7
300C
36 h
140v/ph
50 ml
5 ml

2.3. Xác định thông số động học:
- Chuẩn bị môi trường lên men chính (môi trường 3) để theo dõi thông số động
học trong 48 giờ.
- Cơ chất giớ hạn là đường khử phân tích theo phương pháp DNS.



Báo cáo TH CNLM-MT
Bảng 2.3: Thí nghiệm theo dõi các thông số động học
TG

OD

Hình

Bình Giờ (t)
OD1 OD2 TB
HSPL OD hc log OD
1 8h
0 0.266 0.325 0.2955
1 0.2955 -0.52944
2 10h
2 0.28 0.33 0.305
1 0.305
-0.5157
3 12h
4 0.286 0.34 0.313
10 3.13
0.495544
2.7
4 14h
6 0.146 0.134
0.14
15 2.1
0.322219

Từ bảng thí nghiệm trên ta vẽ được đường cong tăng trưởng của Azotobacter spp

Hình 2.1. Đồ thị đường công tăng trưởng của Azotobacter spp
Từ đường cong tăng trưởng trưởng trên ta thấy điểm thứ 2 và điểm thứ 3 có hệ số
góc là lớn nhất. Nên ta chọn 2 điểm đó để tìm
Ống

Giờ

TG

OD1

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 14

OD2

OD

.
HSPL OD hc log OD


Báo cáo TH CNLM-MT
2 10h
3 12h

2
4


2
3
4
5

Nước cất
10
9.8
9.6
9.4
9.2
9

Glucose
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1

OD 540
0
0.104
0.501
0.577
0.954
1.397

Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn glucose

16h
20h

OD 540
0.904
0.885
0.869
0.846
0.76
0.768
0.697
0.157
0.3745
0.5245
0.362

HSPL
20
20
20
20
20
19
19
25
20
20
18

OD HC


Từ bảng trên ta thấy 3 ống nghiệm 9,10,11 là sai vì : lượng đường là nguồn

cơ chất để cho azotobacter tiêu thụ. Tương ứng với thời gian càng lâu thì lượng
GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 17


Báo cáo TH CNLM-MT
đường càng giảm dần. Nhưng ở 3 ống nghiệm trên thì lượng đường lại tăng lên.
-

Tóm lại: Nhìn vào độ thi trên thì ta thấy lượng đường giảm dần theo thời

gian. Đều đó chứng tỏ là số lượng tế bào tăng dần theo theo thời gian
2.4. Sản xuất sinh khối:
Chuẩn bị môi trường lên men chính (3) 238ml + cấy 12ml/mẫu = 250ml.
1 bình lắc 150v/ph, khoảng 48 giờ và 1 bình lắc 250v/ph
2.5. Thiết lập đường chuẩn tế bào:
Từ 1 huyền phù tế bào, tiến hành pha loãng theo dãy thập phân (106, 107, 108, 109)
và tiến hành trải đĩa (mt Ashby agar), ủ 300C 24 giờ đếm khuẩn lạc.

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 18


Báo cáo TH CNLM-MT
Bảng 2.4: Thiết lập đường chuẩn tế bào
Huyền phù

nước muối sinh


10
0.078
0.5
3.5
10
0.039
Phường trình đường chuẩn để tính số lượng tế bào:

Cfu/ml
1.4.1010
1.225.1010
1.05.1010
0.875.1010
0.7.1010
0.525.1010
0.35.1010
0.175.1010

Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn tế bào.
Từ phương trình đường chuẩn tế bào của Azotobacter spp ta có thể xác định được
số lượng tế bào khi biết được OD của nó.
2.2.7. Phân tích chế phẩm
Sinh khối: pha loãng, trải đĩa , đếm khuẩn lạc, phải đạt 108cfu/g
 Khả năng cố định đạm: chuyển một khuẩn lạc vào môi trường Ashby lỏng
(8ml), ử nhiệt độ phòng 2-4ngày, thử NH4+ tạo thành bằng thuốc thử Nessler. Các
bước tiến hành như sau:
GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 19


Báo cáo TH CNLM-MT

Thông số
tlag
tlog
td
X0 , N0
X,N

Đơn vị
Min
Min
1/min
Min
Cfu/ml
Cfu/ml

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 20

Giá trị xác định, tính toán
120 ( 0 – 2giờ)
120 (2 – 4giờ)
0.019(1/ min) (1)
36.3 (2)
1,07.10-10
14,34.10-10


Báo cáo TH CNLM-MT
S0
S
Rmax= (X-X0)/(48)


OD0
X0
OD
X
S0
S
M chất mang
M sản phẩm
Mật độ tế bào trong sản phẩm
Khả năng cố định đạm
Khả năng sinh IAA

Cfu/ml
Cfu/ml
G
G
Cfu/g
+/+/-

Giá trị xác định, tính toán
15
5
1000
Khoáng vi lương:
8,842.10-3
Khoáng đa lượng: 1,554
15 ml
0,2955
1,07.10-10

 Hình 2.7. Hình thái tế bào Azotobacter spp:
khi nhuộn gram(âm) thì có màu hồng, hình
que, hình cầu.

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 22


Báo cáo TH CNLM-MT

 Hình 2.8. Hình thái tạo kén
Azotobacter spp: Hình giọt nước có
các tế bào kén màu trắng nâu
bóng,các kén nằm tập hợp thành từng
cụm.

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 23


Báo cáo TH CNLM-MT
Bài 3 . SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BACILLUS SPP. HỖ TRỢ XỬ LÝ NƯỚC
THẢI GIÀU PROTEIN VÀ TINH BỘT – SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ
BACILLUS SUBTILIS
I .lý thuyết
I.1 Vi khuẩn Bacilluas subtilis
Có nhiều hoạt tính sinh học :
_ Tiết enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase, chitinase …) xử lý nước
thải, giống sản xuất enzyme.
I.2 Sản xuất sinh khối
Sản xuất sinh khối dưới dạng bào tử lên men chìm hoặc lên men thể rắn.
I.3 Downstream processing

-

Thiệt bị:
+ Máy lắc
+ Máy spectrophotometer
+ Kính hiển vi quang học x 1000

II.2 Tiến hành thí nghiệm
II.2.1 Cấy truyền từ đĩa petri vào thạch nghiêng:
- Chuẩn bị chứa thạch nghiêng chứa môi trường giữ giống ( nutrient agar ) : 2
ống/nhóm. Chọn khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa petri cấy vào ống thạch
nghiêng.
- Ủ 300C, 48 giờ
II.2.2 Nhân giống
- Chuẩn bị môi trường lỏng ( mt nhân giống) 50 ml : lắc 150 vòng/ phút.
Kiểm tra OD sau 24 giờ. Tính toán lượng giống đủ cho lên men chìm và lên
men bề mặt.
Bảng 3.1 Thành phần môi trường giữ giống
Thành phần

Môi trường giữ giống

Môi trường nhân giống

g/l (1)

g/l (2)

30
5