chơng trình khoa học và công nghệ trọng điểm
cấp nhà nớc kc 04

bộ quốc phòng
viện pháp y quân đội

báo cáo tổng kết đề tài m số kc 04.23

nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật adn
trong việc giám định hài cốt liệt sỹ

chủ nhiệm đề tài: pgs.ts. nguyễn trọng toàn

6103
20/9/2006

hà nội - 2006


ADN

C¸c ch÷ viÕt t¾t
Axit deoxyribonucleic

Bp

Base pair

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate


Mitochondrial ADN

NucADN

Nuclear ADN

PA

Polyacrylamide

PCR

Polymerase chain reaction

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

STR

Short tandem repeat

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Themus aquaticus

xơng sọ bằng hệ thống gơng bán mạ hoặc bằng kỹ thuật vi tính tái tạo lại
khuôn mặt trên cơ sở phân tích hài cốt. Tuy nhiên các kỹ thuật này có độ
chính xác không cao, hơn nữa lại cần có những mẫu hài cốt còn khá nguyên
vẹn và có những đặc thù riêng nh có hồ sơ răng, ...
Các dẫn chứng khoa học đã chứng minh rằng ADN có thể tồn tại trong
các phần sót lại của cơ thể đã chết lâu năm, trong đó phần cơ thể tốt nhất để
nghiên cứu tách chiết ADN, nhân bản các gen là các mẩu xơng và răng. Sử
dụng các mẩu xơng ngời chết từ 500 đến 1200 năm về trớc các tác giả đã
tách chiết đợc các phân tử ADN nguyên vẹn bảo đảm cho việc nhân bản và
nghiên cứu các gen của ngời tiền sử (Hagelberg, 1989; Hanni, 1995,
Kalmar, 2000).
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học công nghệ, đặc biệt trong lĩnh
vực công nghệ sinh học, việc giám định và nhận dạng cá thể nhờ áp dụng kỹ
thuật ADN nh AFLP, RFLP, PCR... đã thu đợc những kết quả tốt với độ
chính xác cao, giải quyết đợc những trờng hợp mà các phơng pháp khác
không thể giải quyết đợc. Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các gen đặc
thù trong nhân hoặc trong các bào quan khác nh ti thể, lục lạp đã giúp cho
việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể cũng nh các nghiên cứu
khác về gen đạt nhiều kết quả tốt.
Sử dụng kỹ thuật ADN để phân tích trình tự nucleotide của vùng siêu
biến trong mtADN, các phòng thí nghiệm của Mỹ The Armed Forces DNA
2


Identification Laboratory (AFDIL) và The U.S.Army Central Identification
Laboratory, Hawaii(CILHI)... đã xác định phả hệ của các hài cốt đợc quy
tập từ các cuộc chiến tranh thế chiến thứ II, chiến tranh Triều tiên, chiến
tranh Việt nam (Stoneking et al., 1991; Holland et al., 1999).
Đối với Việt Nam, mỗi năm có tới hàng trăm các trờng hợp nạn nhân
trong các vụ án mạng, tai nạn, tự sát... cha rõ tung tích, đặc biệt khoảng

mtADN.
Thu thập, lu trữ, và quản lý tàng th các tài liệu liên quan tới liệt sỹ
vô danh cần giám định nhận dạng bằng phần mềm chuyên dụng phục
vụ cho việc truy cập thông tin, xác định phả hệ các liệt sỹ vô danh.
Thiết lập mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ của các liệt sỹ vô danh
tạo điều kiện thu thập mẫu sinh phẩm chuẩn xác phục vụ cho việc tách
chiết mtADN của các phả hệ có liên quan.
Nghiên cứu qui trình tách chiết mtADN từ các mẫu hài cốt, sinh phẩm.
Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn ADN vùng siêu biến
của mtADN từ các mẫu hài cốt, sinh phẩm.
Nghiên cứu qui trình nhân bản vùng siêu biến trong mtADN từ các
mẫu hài cốt, sinh phẩm. Tạo dòng các đoạn gen ADN để giải trình tự
vùng siêu biến.
Tiến hành phân tích mức độ tơng đồng và khác biệt giữa trình tự
vùng siêu biến các mẫu đã giải trình tự bằng phần mềm chuyên dụng
để xác định phả hệ cho các hài cốt liệt sỹ vô danh.
Xây dựng phần mềm quản lý cơ sở dữ liệu.

4


Các sản phẩm KHCN của đề tài
Quy trình thu thập và bảo quản mẫu hài cốt, mẫu sinh phẩm
Quy trình giám định kỳ đầu mẫu hài cốt
Quy trình tách chiết mtADN của các mẫu hài cốt, sinh phẩm
Quy trình nhân bản HV1, HV2 của mtADN từ mẫu hài cốt, sinh phẩm
Quy trình dòng hóa các đoạn gen đặc hiệu phả hệ
Quy trình giải trình tự các đoạn gen đặc hiệu phả hệ, phân tích kết
quả.
Phần mềm quản lý tàng th liệt sỹ, quản lý cơ sở dữ liệu nghiên cứu.

hai đầu

7



- Các tế bào xơng nằm giữa các lá xơng nên đợc bảo vệ rất tốt chống
lại những yếu tố bất lợi của môi trờng. Đây là nguồn cung cấp ADN cho
những giám định hài cốt.
Phơng pháp hình thái học dựa trên sự quan sát các đặc điểm hình thái:
Các đặc điểm mang tính lỡng hình giới tính của xơng sọ (ụ chẩm ngoài,
điểm Glabella, gờ trên ổ mắt, xơng chũm, xơng hàm dới...), xơng chậu
(vùng dới xơng mu, khuyết hông lớn, rãnh trớc diện nhĩ...) (Wilton
Marion, 1903). Các đặc điểm hình thái trong xác định tuổi của xơng sọ (độ
liền khớp xơng sọ), xơng chậu (bề mặt sụn tiếp hợp xơng mu, diện nhĩ
...), độ mòn răng (Jonathan Haas và CS, 1944). Cũng nh các đặc điểm đặc
biệt (chấn thơng, bệnh lý...) và các số liệu đo đạc trên các xơng dài nhằm
trả lời các câu hỏi:
+ Là xơng ngời hay xơng động vật ?
+ Chủng tộc nào?
+ Giới tính nào?
+ Tầm vóc bao nhiêu?
+ Tuổi chừng bao nhiêu?
+Số lợng cá thể ?
Tuy nhiên, phơng pháp này đòi hỏi hài cốt phải còn tơng đối nguyên
vẹn, với những hài cốt bị mủn, mục, gãy, nát thì gần nh không thể tiến hành
đợc. Mặt khác giá trị truy nguyên của phơng pháp này thấp, không chỉ rõ
đợc hài cốt này là của cá thể nào do vậy trong giám định nhận dạng hài cốt
nó chỉ có giá trị sàng lọc.
1.1.2 Phơng pháp nhận dạng hài cốt dựa trên hồ sơ răng

- 9-10 tuổi mọc răng cửa bé 1.
- 10-11 tuổi mọc răng nanh.
- 11-12 tuổi mọc răng hàm bé 2.
- 12-14 tuổi mọc răng hàm lớn 2.
- 16-30 tuổi mọc răng khôn( răng hàm lớn thứ 3).

10


Hình 3. Cấu trúc của răng
Enamel: men răng, dentin: ngà răng, dental pulp: tủy răng, cementum:
xơng răng, periodontal membrane: màng quanh răng. free gingiva: lợi,
alveolar bone: xơng ổ răng.
Có một tỷ lệ ngời nhất định không có răng khôn hoặc là răng khôn
không đầy đủ ( chiếm tỷ lệ 13% ) .
*Phân loại răng: (Hình 4)
+ Răng cửa: Gồm 4 răng cửa trên và 4 răng răng cửa dới. Răng cửa
hình cái xẻng, chân răng hình nón, thân răng dẹt, hơi lồi ở mặt trớc.
+ Răng nanh: Có 2 răng nanh trên, 2 răng nanh dới, hình tháp 4 cạnh.
Đỉnh của nó hơi nhọn, mặt trớc lồi, mặt sau lõm. Chân răng dài gấp 2 lần
thân răng, chân răng nanh trên dài hơn chân răng nanh dới.
+ Răng hàm bé: Thân có 2 mấu, một ở trong, một ở ngoài, đợc chia
cách nhau bởi một rãnh. Hai mặt bên lồi. Chỉ có 1 chân răng (có khi chân
răng tách đôi). Có 4 răng hàm bé trên và 4 răng hàm bé dới.
+ Răng hàm lớn: Có thân răng rất lớn và 4 mấu. Răng hàm trên thờng
có 3 chân (2 chân ngoài và 1 chân trong). Răng hàm lớn dới có 2 chân (1

11



1.1.5.1 Các mẫu dùng để tách chiết ADN:
* Máu:

Máu là một dịch lỏng hơi nhớt, vị mặn, chiếm khoảng 1/3 trọng lợng
cơ thể. Bình thờng độ pH của máu ngời đợc cố định ở trong khoảng 7,35
7,45. Tỷ trọng của máu là 1,051 1,060 (Phạm Phan Địch, Nguyễn Văn
Ngọc, Đỗ Kính, 1984) . Cấu tạo của máu gồm 2 thành phần: Huyết tơng và
huyết cầu. Huyết cầu gồm:
+ Hồng cầu
+ Tiểu cầu
+ Bạch cầu (có 2 loại):
- Có hạt: Bạch cầu trung tính, bạch cầu a a xít, bạch cầu a ba zơ
- Không hạt: Lim phô bào, bạch cầu đơn nhân.
Trong máu chỉ các tế bào bạch cầu mới có nhân do vậy tách ADN từ
máu thực ra là tách ADN từ bạch cầu. Trung bình 1 ml máu ngời có khoảng
7000-9000 bạch cầu, mỗi bạch cầu chứa khoảng 5-6 pg ADN, khi tách chiết
1ml máu có thể thu đợc từ 20-50 àg ADN.
* Lông, tóc:

Lông, tóc ngời gồm 2 phần: phần thân và phần chân. Cả 2 phần đều có
ADN, tuy nhiên việc tách chiết ADN từ phần chân của lông tóc (còn bao
gốc) thì dễ dàng hơn. Một gốc tóc chứa khoảng 250 ng ADN (Lorne T
Kirby, 1992) do vậy thậm chí chỉ cần 1 sợi tóc có bao gốc cũng đủ để tiến

13


hành phân tích ADN. Đối với phần thân tóc thì việc tách chiết ADN phức tạp
hơn.
* Tế bào niêm mạc miệng:

Bolsheviks xử bắn năm 1918. Phân tích ADN ty thể trên xơng còn đợc sử
dụng để nhận dạng hài cốt các quân nhân Mỹ bị mất tích trong chiến tranh
Việt Nam trong điều kiện các hài cốt đã chịu sự tác động khắc nghiệt của
môi trờng với thời gian vài chục năm.
Mối tơng quan giữa ADN tách từ xơng với hình thái học của xơng:
Đối với ADN tách từ xơng, ít có sự liên quan giữa mức độ thành công của
việc nhân bản ADN với tuổi của mẫu nhng có sự liên quan giữa sự thành
công của việc nhân bản với hình thái học của xơng cũng nh các đặc điểm
vi thể của tế bào xơng và vỏ xơng. Năm 1993 Hagberger Clegg đã nhân
bản ADN ty thể của 38 mẫu xơng, thành công 21 mẫu và nhận thấy rằng:
đối với những mẫu xơng đặc, chắc, có màu sáp ong tỷ lệ thành công rất cao.
Trong khi những xơng dòn, bị rỗ, màu nâu thờng là khó thành công.
* răng:

Răng với đặc điểm cấu trúc của nó (hình 3) đợc coi là nguồn cung cấp
ADN ty thể tốt bởi những lý do sau:
- Răng có khả năng chịu đựng cao và gần nh không bị ảnh hởng bởi
những tác động bất lợi của môi trờng (răng chỉ tiếp xúc duy nhất với môi
qua lỗ chân răng).
- Độ cứng và nồng độ muối phốt phát can xi ở ngà răng cao, sự làm khô
và khử nớc của mô tuỷ răng giúp cho việc bảo quản ADN tốt hơn cả xơng;
Degusta và cộng sự năm 1994 đã nhân bản mtADN từ rất nhiều răng
khảo cổ có độ tuổi 4700 năm với lợng chất liệu răng rất nhỏ, khoảng 0,01g.
1.1.5.2. Cấu trúc và vai trò của ADN
Ngời đầu tiên đặt nền móng cho cho ngành di truyền học là một tu sĩ
đồng thời là nhà thực vật học ngời Séc Johann Mendel (Phạm Thành Hổ,
2001). Năm 1865 trong khi lai tạo giống đậu Hà Lan và nghiên cứu kết quả
của các cuộc lai tạo đó đã chứng minh rằng các tính cách di truyền đã đợc
truyền lại thông qua trung gian là các yếu tố rất rõ ràng mà ngày nay ngời
15

16


.

H×nh 5. CÊu tróc ho¸ häc cña ph©n tö ADN

17


Các cặp nhiễm sắc thể này qui định các tính trạng khác nhau của cơ thể,
đợc bảo tồn, duy trì trong thế hệ và di truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác.
Con cái bao giờ cũng thừa hởng các đặc tính di truyền thông qua 23 nhiễm
sắc thể từ tinh trùng của bố và 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng của mẹ.
Sự khác nhau về trình tự của 4 loại nucleotid trong phân tử ADN của 23
đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định
gen để xác định cá thể. Tinh đa hình theo trình tự ADN có 2 dạng:
+ Đa hình theo trình tự: Sự khác nhau ngẫu nhiên giữa các nucleotide
trong đoạn ADN, ví dụ ở locus A:
Cá thể thứ nhất có trình tự: - AGACTGCTAG Cá thể thứ hai có trình tự: - AGCCTGCGAG
Nh vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 đã đợc thay thế A bằng C và T
bằng G.
+ Đa hình theo chiều dài (kích thớc): Một số gốc nucleotide đợc lặp
đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN.
Ví dụ: Cá thể thứ nhất :
- ATAT ATAT ATAT -

3 đoạn lặp ATAT

Cá thể thứ hai:

các locus ADN có tính đa hình cao nằm trên các nhiễm sắc thể trong nhân tế
bào (nucDNA). Một Locus ADN đợc xem là một locus có tính đa hình cao
nếu nh có một số lợng các Alen khác nhau đợc quan sát trong cộng đồng
dân c (ví dụ 5-10 hoặc hơn) ví dụ locus D1S80, D17S5, TH01, D5S818,
D9S820, D13S317 .... Theo nguyên lý, càng nhiều locus đợc phân tích thì
sự xác định nguồn gốc của sinh phẩm phát sinh từ một nguồn nào đó có độ
chính xác càng cao. Có 2 phơng pháp phân tích ADN nhân:
+ Phơng pháp so sánh chiều dài các đoạn ADN đợc cắt bằng enzym
giới hạn RFLP (Restriction Fragement Length Polymorphism)
+ Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phơng pháp PCR là phơng pháp đợc sử dụng phổ biến trong các
phòng thí nghiệm nhận dạng hiện nay.
1.1.5.5. Ti thể và hệ gen ti thể
19


a. Những nghiên cứu đầu tiên về ti thể
Năm 1890, Robert Altman quan sát thấy trong tế bào chất có các cấu
trúc dạng hạt dới mức tế bào có kích thớc tơng tự vi khuẩn hình que , do
vậy ông đã đặt tên là "Bioblast". Thuật ngữ ti thể (mitochondria) do nhà
nghiên cứu Bender C. đặt cho bào quan này vào năm 1898 khi quan sát các
bào quan trong tế bào bằng kính hiển vi quang học có độ phóng đại cao hơn .
Theo tiếng la tinh "mitos" có nghĩa là sợi dây mảnh, "chondros" có nghĩa là
hạt.
Năm 1900, Michaelis đã nhuộm ti thể bằng thuốc nhuộm Jenus Green
B, đây là một chất ôxy-hoá, nó cần oxy hoá để tạo mầu và Ông đã giả thuyết
rằng ti thể là một tác nhân ôxy hoá của tế bào. Có thể nhuộm ti thể bằng một
chất nhuộm khác, đó là chất nhộm huỳnh quang rôdamin 123 (chất nhuộm
này không gây chết tế bào). Bằng phơng pháp nhuộm mầu ti thể trong tế
bào sống ngời ta đã chứng minh đợc tính linh động của ti thể: Ti thể là một

21


Gian màng chứa các enzym tham gia vào việc chuyển ATP ra khỏi
khoang nền để photphoryl hoá các nucleotide khác (adenylate kinase,
nucleoside monophos-phokinase và nucleoside diphosphokinase).
- Màng trong ti thể (hình6) là màng không thấm ion (ion-impermeable):
chứa 20% lipid, 80% protein. Màng trọng cuộn lại tạo nên cấu trúc gọi là
Cristae(vách ngăn) vì thế diện tích của bề mặt màng trong tăng lên đáng kể.
Trong ti thể của tế bào gan diện tích bề mặt màng trong gấp 5 lần diện tích
bề mặt màng ngoài. Protein của màng trong thực hiện các chức năng sau:
Tiến hành nhiều phản ứng ôxy hoá của chuỗi hô hấp (chẳng hạn phức hệ
NADH dehydrogenase), số khác tham gia tổng hợp ATP (chẳng hạn phức hệ
F0F1ATPase hoặc ATP synthase). Các protein vận chuyển điều khiển sự luân
chuyển các chất trao đổi ra vào khoang khoang nền (chẳng hạn các chất
mang nucleotide adenine).
* Khoang nền của ti thể
Khoang nền của ti thể chứa ADN và hàng trăm enzym khác nhau với
nồng độ cao. Bình thờng một ti thể chứa vài nghìn bản sao ADN giống
nhau. Hệ phiên mã và dịch mã của ti thể (ribosom ti thể, các ARN vận
chuyển,...) đợc định vị ở khoang nền.
* Chức năng của ti thể:
Ti thể là bào quan chuyển hoá năng lợng tạo ATP cho tế bào. Do vậy,
ti thể là trạm năng lợng của tế bào. Ti thể là bào quan có mặt trong tất cả
các tế bào hô hấp hiếu khí. Ti thể có chức năng vô cùng quan trọng là trạm
chuyển hoá năng lợng từ các phân tử hữu cơ thành dạng năng lợng tích luỹ
trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lợng cần thiết cho tất cả các hoạt
động sống của tế bào. Ti thể có chứa ADN và nó là một hệ di truyền độc lập
so với với hệ di truyền của nhân tế bào. Trong ti thể có riboxom và các loại
ARN cần thiết do vậy ti thể có hệ thống tổng hợp protein riêng của mình.

intron nào, có một vùng 1121 bp không mã hoá, vùng D-loop, kéo dài từ vị
trí 16024 đến 00575. Vùng này còn đợc gọi là vùng điều khiển, bởi vì nó
23


chứa vùng khởi đầu sao chép cả 2 sợi ADN ti thể và vùng điều khiển sự nhân
bản và sao chép (Larsson và Clayton, 1995; Lightowlers và cs., 1997). Có
một số gen tiếp giáp hoặc chồng lên nhau trong ADN ti thể và không đầy đủ
các bộ mã kết thúc. Đầu 3'-của mARN đợc adenyl hoá tạo nên đuôi poly A.
Kích thớc hệ gen ti thể của ngời nhỏ và tất cả trình tự nucleotit của hệ gen
này đợc sử dụng để mã hoá cho các sản phẩm cụ thể. Hệ gen ti thể của
ngời và động vật không có vùng intron, trong khi đó lục lạp của một số thực
vật và nấm (fungi) lại có intron.
Phân tử ADN ti thể của ngời chứa 37 gen: Hai ARN riboxom 16S và
12S (16S rARN và 12S rARN) tìm thấy trong các riboxom ti thể đợc mã
hoá trong ADN ti thể, trong khi phần lớn protein của riboxom lại do các gen
trong nhân quy định. ADN ti thể cũng mã hoá cho 22-23 loại ARN vận
chuyển (tARN) và 10-12 loại protein có trong thành phần của màng ti thể.
Mã di truyền của ti thể không hoàn toàn giống mã di truyền trong nhân và
cũng không giống nhau ở các loài. Do đó không thể có mã di truyền chung
cho các bào quan này. So với mã di truyền của nhân, mã di truyền của ti thể
có tính linh hoạt cao hơn. Tính linh hoạt thể hiện ở chỗ nhiều tARN trong ti
thể có thể đọc cả 4 cụm mã trong một khung. Chính vì vậy chỉ cần có 22
loại tARN trong ti thể làm nhiệm vụ nhận biết 61 bộ ba (codon) mã hoá cho
các axit amin trong khi ở nhân cần tới 32 loại tARN. Sự xắp xếp các gen
trong ti thể của ngời đợc biểu hiện tại hình 7.
d. Đặc trng của hệ gen ti thể
Số lợng các bản sao ADN ti thể (mtADN) lớn và phân bố trong tế bào
chất là những khác biệt chủ yếu so với ADN nhân. Vùng điều khiển (còn gọi
là vùng thay thế, D-loop) chỉ là một đoạn ADN không mang gen mã hoá cho