BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ

PHẠM MINH TÂN

CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT QUANG CỦA
HẠT NANO SILICA CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM
ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH
Chuyên ngành: Vật lý chất rắn
Mã số:
62 44 01 04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ

HÀ NỘI, NĂM 2015


Công trình được hoàn thành tại: Trung tâm Điện tử Lượng tử, Viện Vật
lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Hồng Nhung
2. PGS.TS. Tống Kim Thuần
Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Hội, Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS. Lê Anh Tuấn, Viện Tiên tiến Khoa học và Công
nghệ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Phản biện 3: PGS.TS. Mai Anh Tuấn, Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học

nền silica, các chất màu được bảo vệ khỏi các ảnh hưởng của môi trường.
Mặt khác, do nền silica chứa rất ít oxy tự do nên phân hủy quang cũng được
giảm thiểu. Độ bền quang cao cho phép các hạt nano silica được sử dụng
trong các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài.
Hơn nữa, các hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản
ứng hoá học để tạo các nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các
phân tử sinh học như là amin (-NH2), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH).
Bằng cách điều chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước
hạt; số lượng tâm màu trong hạt cũng như loại tâm màu đưa vào, do đó
người ta có thể tạo ra một nhóm lớn các hạt phát quang với các tính chất
quang đa dạng dùng trong đánh dấu. Bản thân silica là chất thân thiện với
môi trường sinh học, do đó chúng có thể là các hạt đa chức năng: vừa phát
hiện và vừa mang thuốc trị bệnh. Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các
chất đánh dấu sinh học mới, hứa hẹn được sử dụng rộng rãi trong các phân
tích và đánh dấu sinh học. Do vậy, đề tài của luận án đã được chọn là: Chế


2
tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và
thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y - sinh.
Mục tiêu nội dung nghiên cứu của luận án: (i) Chế tạo và nghiên
cứu các tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ định
hướng ứng dụng làm chất đánh dấu sinh học. (ii) Ứng dụng các hạt nano
silica chế tạo được làm chất đánh dấu để phát hiện vi khuẩn E. coli
O157:H7 và tế bào ung thư vú bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang.
Nội dung nghiên cứu chính của luận án: Luận án được tiến hành
bằng phương pháp thực nghiệm với các nội dung sau: (i) Nghiên cứu chế
tạo hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ với các nhóm chức năng trên bề
mặt hạt bằng phương pháp sol-gel. (ii) Khảo sát cấu trúc hóa học trên cơ sở
phân tích phổ hấp thụ hồng ngoại. (iii) Thực hiện các phép đo khảo sát các

1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học

S2
τn ≈ ps

T2

ν
2
1
0

S1

τi ≈ ns

Hấp thụ
ν

S0

2
1
0

Huỳnh
quang

T1
Lân quang

tại một số nhược điểm đó là : (i) có nhiều lỗ xốp nên tính đồng nhất quang
học không cao, (ii) phân tử màu dễ bị thoát ra ngoài. Để khắc phục nhược
điểm này, người ta dùng nền ormosil (organically modified silicate) là nền
thủy tinh sol-gel có chứa thành phần hữu cơ liên kết với nguyên tử Si bằng
liên kết bền vững – liên kết cộng hóa trị. Nền loại này được điều chế bằng
phương pháp sol-gel từ các alkoxysilic có chứa một nhóm hữu cơ liên kết với
Si bằng liên kết bền (Si-C) không bị phân li trong quá trình thủy phân.
Các hạt nano silica sử dụng trong các ứng dụng y - sinh học thường được


5
tạo các nhóm chức năng amine, carboxyl hay thiol bằng cách sử dụng các
precursor có các nhóm hữu cơ NH2, COOH hay SH, đây là các nhóm chức
năng tương hợp sinh học.
1.2.3. Các phương pháp chế tạo
Các hạt nano silica chứa màu hữu cơ thường được tạo ra theo ba phương
pháp sau: phương pháp Stober, phương pháp micelle thuận và micelle đảo.
1.2.4. Các đặc trưng hóa lý
1.2.4.1. Vật liệu nền
Nền hạt nano silica có hai vai trò: thứ nhất là phân tán tâm màu trong các
lỗ xốp, thứ hai là bảo vệ tâm màu khỏi sự xâm nhập của môi trường bên ngoài
và khỏi sự phân hủy quang khi có ánh sáng kích thích do nền này có nồng độ
oxy tự do thấp hơn 3 bậc so với dung môi. Vì vậy, chất lượng nền là một yếu tố
quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng hạt nano silica trong vai trò là chất đánh
dấu huỳnh quang.
1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang
(i) Các hạt nano silica có độ chói rất cao do chúng có thể chứa một lượng
lớn các phân tử màu bên trong nền silica, vì vậy cường độ huỳnh quang của
một hạt nano silica nói chung có thể lớn gấp tới hàng nghìn lần cường độ
huỳnh quang của một phân tử màu cùng chất trong dung môi. Có thể điều

peptide…) để làm cầu nối nối phân tử sinh học và hạt nano. Chất này gồm hai
đầu tích cực: một đầu gắn với hạt nano và một đầu gắn với phân tử sinh học.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
Phương pháp sol-gel được sử dụng để chế tạo các mẫu hạt nano silica
chứa tâm màu hữu cơ (RB và FITC). Các hạt được chức năng hóa bề mặt với
các nhóm chức tương thích sinh học như: amine, carboxyl hay thiol bằng cách
sử dụng các precursor có các nhóm hữu cơ NH2, COOH hay SH liên kết với Si


7
trong phản ứng đồng trùng hợp với TEOS hoặc MTEOS. Bên cạnh đó, các hạt
nano silica cũng được chức năng hóa bằng cách bọc lên hạt một lớp vỏ
polyethylene glycol (PEG), protein như bovine serum albumin (BSA) hay
streptavidin (SA) vừa có tác dụng bảo vệ hạt, vừa có các nhóm chức năng
tương thích sinh học. Cấu trúc hóa học được khảo sát thông qua phép đo phổ
hấp thụ hồng ngoại. Hình thái, kích thước của hạt được khảo sát qua ảnh SEM,
TEM, phép đo DLS và FCS. Các tính chất quang của vật liệu được nghiên cứu
thông qua phổ hấp thụ (UV-Vis), phổ huỳnh quang, phép đo thời gian sống
phát quang. Các phương pháp ứng dụng trong y – sinh học được khảo sát thông
qua các thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy và kính hiển vi quang học.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau
trên bề mặt theo phương pháp micelle thuận
Các hạt nano silica chế tạo theo phương pháp micelle thuận được chức
năng hóa với các nhóm chức năng OH, NH2, SH thông qua phản ứng đồng
trùng hợp với MTEOS, đồng thời hạt cũng được bọc lớp vỏ PEG và protein
BSA, SA để vừa tạo các nhóm chức năng, vừa bảo vệ hạt trong môi trường
sinh học.
3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt: Các hạt nano silica chế tạo được có dạng
tựa cầu, kích thước từ 20 – 110 nm.

450

500

550

B­íc sãng (nm)

600

650

C­êng ®é huúnh quang chuÈn hãa

3.1.2.1. Hấp thụ và huỳnh quang
1: 4SBA30
2: 4SBA30DT
3: 4SBT30
4: 4SBA30PEG
5: 4SBO30
6: RB/H2O

1.0
0.8
0.6
0.4

2
6


Hiệu suất lượng tử (HSLT) Q và thời gian sống phát quang (TGSPQ) τ
của dãy mẫu này đều tăng so với phân tử RB tự do trong nước. Các số liệu
cũng cho thấy HSLT tăng chủ yếu do tốc độ HPBX Γr tăng và TGSPQ τ
tăng chủ yếu do tốc độ HPKBX Γnr giảm (Hình 3.10). Các kết quả này phù
hợp với quy luật của phân tử màu trong các môi trường lỏng, chứng tỏ các
nhóm chức không ảnh hưởng mạnh tới tính chất quang của các phân tử màu
trong hạt.


9
0.34
Q
Fit line

0.32

1.7

HiÖu suÊt l­îng tö Q

Thêi gian sèng ph¸t quang

1.8

1.6
1.5
1.4

0.30
0.28


Γr/Γnr

Hình 3.10. Mối liên hệ giữa TGSPQ và tốc độ HPKBX; HSLT và Γr/Γnr
3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo
phương pháp micelle thuận
Phổ hấp thụ và huỳnh quang của các mẫu hạt nano silica chứa chất
màu RB có dạng giống với phổ hấp thụ và huỳnh quang của chất màu RB
tự do trong nước nhưng đỉnh phổ hấp thụ dịch từ 1 nm đến 6 nm và đỉnh
phổ huỳnh quang dịch từ 4 nm đến 10 nm về phía sóng dài. Sự dịch đỉnh
này chứng tỏ sự tương tác của chất màu RB với nền silica là yếu, không ảnh
hưởng nhiều đến tính chất quang của chất màu RB trong hạt nano.
Từ các thông số của mẫu như phổ hấp thụ, huỳnh quang, số phân tử
màu trong một hạt nano, độ chói... đã được khảo sát Các kết quả cho thấy:
(i) Với cùng một độ hấp thụ, nghĩa là số phân tử tâm màu được kích thích là
như nhau trong tất cả các mẫu được khảo sát thì cường độ huỳnh quang của
các mẫu hạt nano đều cao hơn cường độ huỳnh quang của phân tử RB tự do
trong nước. Có nghĩa là hiệu suất phát quang của các phân tử màu trong hạt
nano cao hơn hiệu suất phát quang của các phân tử màu RB tự do trong
nước. Hiện tượng tăng cường cường độ huỳnh quang này được giải thích là
do trong nền silica, các phân tử màu được phân bố trong các lỗ xốp do đó
giảm thiểu được hiện tượng dập tắt huỳnh quang do va chạm và phân hủy
quang do tương tác với oxy. Cần nói thêm là độ hấp thụ và cường độ huỳnh


10
quang được đo ở nồng độ 5.10-5 mol/l đối với phân tử RB tự do trong nước,
và nồng độ ~10-2 mol/l đối với các phân tử RB trong các hạt nano. Đối với
chất màu RB tự do trong dung môi thì hiện tượng dập tắt huỳnh quang do
nồng độ bắt đầu xuất hiện khi nồng độ ~ 10-4 mol/l và huỳnh quang bị dập


650

C­êng ®é huúnh quang chuÈn hãa

do sự tăng của thời gian sống τ và tốc độ HPBX Γr.
1:2SBO20
2:4SBO30
3:5SBO40
4:6SBO60
5:RB/H2O

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
550

700

600

650

700

B­íc sãng (nm)


4.0

4.5

5.0

VËn tèc HPKBX (x108s-1)

5.5

6.0

0.3

0.4

0.5

0.6

Γr/Γnr

0.7

0.8

0.9

Hình 3.16. Mối liên hệ giữa TGSPQ và tốc độ HPKBX; HSLT và Γr/Γnr
Có thể kể ra các nguyên nhân gây ra HPKBX của các phân tử RB:


12
ethanol khác nhau cho thấy, khi tăng lượng ethanol thì độ hấp thụ tăng. Phổ
hấp thụ chuẩn hóa cho thấy, dạng phổ của FITC@APTES không thay đổi
khi lượng ethanol tăng. Có thể thấy rằng, số phân tử hợp chất
FITC@APTES tăng tỷ lệ thuận với lượng ethanol khi lượng này còn thấp
và tiến tới bão hòa khi lượng ethanol đạt 7 thể tích. Các dung dịch
FITC@APTES của thí nghiệm trên được đánh số theo thể tích ethanol lần
lượt

là:

FITC@APTES1,

FITC@APTES3,

FITC@APTES5,

FITC@APTES7 và FITC@APTES10.

§é hÊp thô (®vty)

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

600

B­íc sãng (nm)

650

700

0

2

4

6

8

10

L­îng ethanol

Hình 3.27. Phổ hấp thụ của chất màu FITC tự do và FITC@APTES. Sự phụ
thuộc của độ hấp thụ của FITC@APTES vào lượng ethanol
Khi lượng ethanol tăng, chỉ số PdI của dung dịch hạt nano silica tăng.
Khi lượng ethanol tăng lên bằng 7 thì bắt đầu có hiện tượng kết đám, với
lượng ethanol bằng 10 thì không tạo được các hạt riêng rẽ mà thành các
đám. Hiện tượng này được giải thích là khi lượng ethanol tăng lên thì lượng
nước còn dư trong dung dịch chứa hợp chất FITC@APTES cũng tăng lên,
tốc độ phản ứng thủy phân và ngưng tụ tăng dẫn đến kích thước hạt lớn,


0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
500

400

450

500

550

600

650

FITC-ethanol
SiO2 @FITC

1.0

700

550

600

FITC@APTES7 có cường độ phát quang cao nhất, sau đó là mẫu
FITC@APTES1, rồi tới các thành phần khác. Tuy nhiên, như đã trình bày ở
trên, mẫu FITC@APTES7 kích thước lớn và không đơn phân tán. Như vậy,
việc sử dụng hợp chất FITC@APTES1 cho hạt vừa có chất lượng quang
tốt, vừa có hình thái học tốt.
3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober
Cùng với việc chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC theo
phương pháp micelle đảo, chúng tôi cũng tiến hành chế tạo và khảo sát hình
thái, các tính chất quang của các hạt nano silica chứa tâm màu FITC theo
phương pháp Stober
3.5.1. Tính chất quang
Phổ hấp thụ và hấp thụ chuẩn hóa của phân tử màu FITC trong các hạt
nano silica được chế tạo theo phương pháp Stober cho thấy phổ hấp thụ có
dạng giống như trong hạt silica chế tạo bằng phương pháp micelle đảo,
chứng tỏ sự giống nhau của mạng nền SiO2 của hai phương pháp chế tạo.

§é hÊp thô (®vty)

1.6
1.2
0.8
0.4

ST900
ST1000
ST1100
ST1200
FITC@APTES

1.0

B­íc sãng (nm)

520

540

560

400

450

500

B­íc sãng (nm)

550

Hình 3.33. Phổ hấp thụ và hấp thụ chuẩn hóa của hợp chất FITC@APTES
trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau


15
Phổ huỳnh quang chuẩn hóa (Hình 3.34) cho thấy, dạng phổ huỳnh
quang của các phân tử màu FITC trong các hạt nano giống của phân tử màu
FITC tự do trong ethanol, tuy nhiên đỉnh phổ dịch từ 6 – 11 nm về phía

C­êng ®é huúnh quang (®vty)

1000


580

600

620

640

ST900
ST1000
ST1100
ST1200
FITC-Ethanol

1.0

520

540

560

580

B­íc sãng (nm)

600

620

Kích
Mẫu
Thế Zeta
Đường kính
thước
(mV)
thủy động học
PdI
TEM
(nm)
(nm)
ST1000

70

83

0,003

-11,2

ST1000NH2

-

109

0,044

-0,8

hạt được bảo quản tốt trong môi trường Tris. Có thể giải thích việc này như
sau: Tris là một loại amine bậc một, cấu tạo phân tử gồm một nhóm NH3+
và 3 nhóm OH trong nước. Các nhóm này đã giúp cân bằng điện tích trên
bề mặt hạt silica cũng gồm các nhóm OH- và NH3+, làm cho các hạt ổn định
không bị kết tụ.
3.5.2.2. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH
Luận án cũng đã trình bày các kết quả chức năng hóa hạt nano silica
với nhóm chức COOH trên bề mặt hạt. Khi lượng precursor C3H6Na2O5Si
(DDOS) được sử dụng để trùng hợp liên tiếp lên bề mặt hạt tăng thì thế
Zeta của mẫu hạt cũng tăng lên, hạt được chức năng hóa đến khi thế Zeta
của hạt đạt đến giá trị làm cho mẫu hạt ổn định và đơn phân tán trong môi
trường (ς > 30 mV).
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH
DẤU SINH HỌC
4.1. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp
miễn dịch huỳnh quang
4.1.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang
Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy các vi khuẩn E. coli
O157:H7 sau khi gắn kết với phức hệ SiO2RB@KT phát quang mạnh
(những điểm sáng đỏ - vàng, Hình 4.1.b). Hình 4.1.c cho thấy các hạt nano
silica bám đều trên bề mặt vi khuẩn Từ những ảnh cắt lớp tế bào vi khuẩn
(Hình 4.1.d) cho ta thấy hạt silica chỉ bám trên bề mặt vi khuẩn đích mà
không ở trong vi khuẩn, ảnh lớn cho thấy trên các thành vi khuẩn tín hiệu
huỳnh quang phát rất mạnh, bên trong vi khuẩn, hầu như không thấy tín
hiệu huỳnh quang, trong khi ảnh chụp trên bề mặt vi khuẩn (ảnh nhỏ) thì tín


18
hiệu phát rất mạnh. Như vậy phức hệ SiO2RB@KT chỉ gắn trên bề mặt
thành tế bào theo nguyên lý miễn dịch (kháng nguyên – kháng thể) với tỷ lệ

1.0x103CFU
7.5x102CFU
5.0x102CFU
2.5x102CFU

80
60
40

C­êng ®é huúnh quang (®vty)

C­êng ®é huúnh quang (®vty)

100

20
0
550

600

650

B­íc sãng (nm)

700

750

80

0.0

Ph­¬ng ph¸p ®Õm Ph­¬ng ph¸p phæ huúnh quang

Hình 4.4. So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp
đếm khuẩn lạc (trái) và phương pháp phổ huỳnh quang (phải)
4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú
4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang
Ảnh huỳnh quang của tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ
SiO2RB@HER2 (Hình 4.5.A) và với SiO2RB@BSA (Hình 4.5.B). Trên ảnh
hiển vi huỳnh quang (Hình 4.5.A) chúng ta có thể thấy các hạt silica (màu
đỏ) tập trung trên cả màng và vùng xung quanh nhân của tế bào KPL4.
Kiểm tra khả năng bám không đặc hiệu lên bề mặt màng tế bào hay không,
mẫu đối chứng là hạt SiO2RB@BSA (chỉ có nano silica bọc BSA, không có
kháng thể) được ủ với tế bào KPL4, kết quả cho thấy (Hình 4.5.B) gần như
không có silica bám trên tế bào KPL4, nghĩa là các hạt SiO2RB@BSA tự do
không có khả năng gắn lên màng tế bào.


21

Hình 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ
SiO2RB@HER2 (A) và với SiO2RB@BSA (B)
4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào
Sau khi tiến hành nhuộm với kháng thể phù hợp theo bố trí thí nghiệm,
chúng tôi tiến hành đếm tế bào trên máy flow cytometer FACS Canto (BD).
Đầu tiên, tiến hành chạy mẫu đối chứng chứa hai loại tế bào HeLa và
KPL4 với tỷ lệ 1:1 không ủ hoặc ủ với hạt nano silica SiO2RB@BSA,
không có kháng thể. Kết quả cho thấy hình dạng hai đồ thị giống nhau và có
đỉnh phổ huỳnh quang ở khoảng 2,5.103, đây được coi là đường nền. Tiếp

đã được chức năng hóa với các nhóm NH2 và COOH bằng phương pháp


23
đồng trùng hợp với các precursor thích hợp. Các khảo sát cho thấy hạt nano
được chức năng hóa bằng nhóm amine NH2 ổn định rất tốt trong Tris (PdI