BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN VẬT LÝ
PHẠM MINH TÂN CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT
QUANG CỦA HẠT NANO SILICA
CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM
ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ



Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRẦN HỒNG NHUNG
2. PGS.TS. TỐNG KIM THUẦN
HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới
PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần, những người thầy luôn
tận tụy hết lòng hướng dẫn tôi, tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong thời gian tôi học tập
và nghiên cứu ở Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Hồng Nhung đã
luôn giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần, tạo mọi điều kiện cho tôi có cơ hội học
tập, trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu ở trong và ngoài nước.
Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. Nghiêm Thị Hà Liên, TS. Vũ Thị Thùy
Dương, CN. Trần Anh Đức, ThS. Nguyễn Thị Vân, ThS. Trần Thu Trang, ThS.
Nguyễn Thị Thùy, PGS.TS. Đỗ Quang Hòa, TS. Vũ Dương, TS. Phạm Long và các
bạn đồng nghiệp trong nhóm NanoBiophotonics đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá
trình làm thực nghiệm và các trao đổi khoa học trong suốt quãng thời gian tôi học
tập, nghiên cứu ở Viện.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện
Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện
Luận án được hoàn thành bởi kinh phí của đề tài NAFOSTED
Mã số: 103.06.101.09
Và đề tài cấp Nhà nước
Mã số: 01/2/2011/HĐ-NCCBUD

MỤC LỤC
Tiêu đề Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN……………………… …… i
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………… ……iii
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ………………………………… …v
MỞ ĐẦU

1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN

10
1.1. Chất màu hữu cơ

10

1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil

19
1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ

20
1.2.3.1. Phương pháp Stober

20
1.2.3.2. Các phương pháp micelle

21
1.2.4. Các đặc trưng hóa lý

22

1.2.4.1. Vật liệu nền

22
1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang

23
1.2.4.3. Thế Zeta

24
1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh


35
1.3. Các đối tượng sinh học

36
1.3.1. Protein

36
1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA)

36
1.3.3. Strepavidin
(SA)

37
1.3.4. Kháng thể

37
1.3.5. Kháng nguyên

38
1.3.6. Vi khuẩn
Escherichia coli (E. coli)

39
1.3.7. Phản
ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể)

39
1.3.7.1. Khái niệm


49
2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
micelle đảo

50
2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với
APTES

50
2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC

51
2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober

53
2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng
xúc tác lên kích thước hạt

53
2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC

54
2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu

55
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt

55
2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM)

Hiệu suất lượng tử

65
2.2.5.4.
Thời gian sống phát quang

67
2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học

68
2.2.6.1. Kính hiển vi quang học

68
2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy

70
2.3. Kết luận chương 2

71
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ

73
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề
mặt theo phương pháp micelle thuận

73
3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt

73
3.1.2. Cấu trúc hóa học

92
3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp
FCS

93
3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA)

95
3.3.1. Hình dạng, kích thước

95

3.3.2. Tính chất quang

96
3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA)

98
3.4.1. Hình dạng, kích thước

98
3.4.2. Tính chất quang

98
3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước

98

3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt

108
3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH

110
3.7. Kết luận chương 3

112
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU
SINH HỌC

114
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh

114
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi
khuẩn E. coli
O157:H7 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang

114
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ
SiO
2
RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7

114
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO
2


115
4.1.2.4.
Sử dụng phức hệ SiO
2
RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4

116
4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy

116
4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474

116
4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể
HER2
(SiO
2
FITC@HER2)

116
2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO
2
FITC@HER2

116
4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli
O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch
huỳnh quang


TÀI LIỆU THAM KHẢO

133
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN

Ký hiệu Giải nghĩa
φ
Kích thước hạt (đường kính)
τ
Thời gian sống huỳnh quang
∆λ
HQ
Độ bán rộng phổ huỳnh quang
∆λ
HT
Độ bán rộng phổ hấp thụ
λ
HQ
Đỉnh phổ huỳnh quang
λ
HT
Đỉnh phổ hấp thụ
APTES Aminopropyltriethoxysilane
AOT Aerosol-OT
BSA Bovine serum albumin
C Nồng độ (mol/l)
COOH Nhóm carboxyl

PEG polyethylene glycol
PdI Polydispertion Index
PDT Photodynamic Therapy
Precursor Tiền chất
PTTMEOS 3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol
Q Hiệu suất lượng tử
R Bán kính
R6G Rhodamine 6G
RB Rhodamine B
SA Streptavidin
SEM Scanning Electron Microscope
SH Nhóm thiol
SiFITC Hạt nano silica chứa FITC
SiRB Hạt nano silica chứa RB
TCSPC Time-correlated single photon counting
TEM Transmission electron microscopy
TEOS Tetraethyl orthosilicate
TGSPQ Thời gian sống phát quang DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Độ ổn định của huyền phù theo thế Zeta 25
Bảng 2.1. Thí nghiệm xác định lượng BSA đủ để bọc hạt 47
Bảng 2.2. Dãy mẫu thay đổi nhóm chức năng 49
Bảng 2.3. Dãy mẫu thay đổi kích thước hạt 49
Bảng 2.4. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương
pháp micelle đảo

101
Bảng 3.8. Kết quả đo DLS và TEM của các mẫu hạt nano silica chứa FITC
với các kích thước khác nhau chế tạo bằng phương pháp Stober

105
Bảng 3.9. Các thông số của phổ hấp thụ và huỳnh quang
107
Bảng 3.10. Kết quả đo DLS và thế Zeta của các hạt nano silica có nhóm chức
NH
2
được chế tạo bằng phương pháp Stober

108
Bảng 3.11. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm
chức NH
2108
Bảng 3.12. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica được dập tắt
nhóm OH trên bề mặt

109
Bảng 3.13. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm
chức COOH

111

19
Hình 1.7. Sự phát xạ huỳnh quang của các hạt nano silica chứa các loại tâm
màu khác nhau 19
Hình 1.8. Các hệ micelle: Hệ micelle thuận (a) và Hệ micelle đảo (b)
21
Hình 1.9. Ảnh SEM của các mẫu hạt silica đơn phân tán với các kích thước
khác nhau 22
Hình 1.10. Tính chất của RuBpy pha trong hạt nano silica
24
Hình 1.11. Biểu diễn thế Zeta của một hạt
25
Hình 1.12. Các cách thường tiếp hợp phân tử sinh học với hạt nano
28
Hình 1.13. Các cách gắn kết đồng hóa trị thông thường giữa phân tử sinh
học và hạt nano 29
Hình 1.14. Mô tả cách gắn kết đặc hiệu của hạt nano silica với vi khuẩn lao
Mycobacterium 29
Hình 1.15. Hình ảnh các vi khuẩn E. coli
31
Hình 1.16. Mô tả thí nghiệm đánh dấu DNA xem kẽ dựa vào gắn kết sinh học
với hạt nano silica 32
Hình 1.17. Giản đồ phân tích đa kênh bằng hạt nano silica chứa hai loại tâm
màu với tỷ lệ nồng độ hai tâm màu khác nhau 33
Hình 1.18. Nguyên tắc hoạt động của máy đếm dòng tế bào (flow cytometry)
35
Hình 1.19. Cấu trúc của một phân tử kháng thể
38

Hình 2.13. Phản ứng đồng trùng hợp của FITC@APTES với TEOS để tạo
liên kết hóa trị của chất màu trong hạt silica 52
Hình 2.14. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober 53
Hình 2.15. Phản ứng tạo nhóm chức NH
2
trên bề mặt hạt nano
54
Hình 2.16. Cấu trúc hóa học của Disodium 3-
[dihydroxy(oxido)silyl]propanoate (a) và phản ứng tạo nhóm chứ
c COOH
trên bề mặt hạt nano (b) 55
Hình 2.17. Các trạng thái năng lượng của phân tử hai nguyên tử
59
Hình 2.18. Phổ hấp thụ của RB và R6G
65
Hình 2.19. Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời
gian 68
Hình 2.20. Sơ đồ nguyên lý hệ đếm Flow cell
71
Hình 3.1. Ảnh TEM của hạt nano SiO
2
-NH
2
&OH (a), SiO
2
-NH
2
(b), SiO
2

77
Hình 3.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO
2
-SH………………
77
Hình 3.8. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica
với các nhóm chức khác nhau 80
Hình 3.9. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt
nano silica với các nhóm chức khác nhau 80
Hình 3.10. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và
Γ
r
/
Γ
nr

(b)………………………………………………………………………………………… 82
Hình 3.11. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có nhóm chức khác
nhau………………………………………………………………………………………
84
Hình 3.12. Phân bố kích thước hạt theo cường độ của phương pháp DLS:
SiO
2
-NH
2
&OH (a), SiO
2
-NH
2
(b), SiO

-OH trước khi bọc BSA
96
b) Ảnh TEM của các hạt nano silica SiOH
2
-OH sau khi bọc BSA….
Hình 3.21. a) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong nước
b) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong PBS………… 96
Hình 3.22. a) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong nước
b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO
2
-OH@BSA trong PBS…… 97
Hình 3.23. a) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong nước
b) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong PBS 97
Hình 3.24. Ảnh SEM của SiO
2
-OH@SA@BSA
98
Hình 3.25. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của SiO
2
-OH
bọc SA trong nước…………………………………………………………………… 99

Hình 3.33. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của hợp chất
FITC@APTES trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước
khác nhau………………………………………………………………………………
106
Hình 3.34. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và
trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau………………………….
106
Hình 3.35. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu
trong môi trường Tris………………………………………………………………….
110
Hình 3.36. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu
hạt nano có nhóm chức năng COOH với lượng DDOS khác nhau……………
112
Hình 4.1. Hình ảnh các tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7………………………
118
Hình 4.2. Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn đánh dấu bằng hạt nano
silica pha RB với các nồng độ vi khuẩn khác nhau………………………………
119
Hình 4.3. a) Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 với
nồng độ khác nhau đánh dấu bằng hạt nano silica chứa tâm màu RB
b) Đường cường độ huỳnh quang theo số lượng vi khuẩn (đường màu đỏ) và
đường fit (màu xanh, Y = 0,008.X)…………………………………………………
120
Hình 4.4. So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp đếm
khuẩn lạc (trái) và phương pháp phổ huỳnh quang (phải)……………………….
121
Hình 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiRB@HER2

MỞ ĐẦU
Vật liệu phát huỳnh quang ứng dụng trong sinh học có sự tăng trưởng vượt
bậc trong 20 năm trở lại đây do phép phân tích sử dụng huỳnh quang có độ nhạy
cao, không phá hủy mẫu và không độc [162]. Các phương pháp, thiết bị đo huỳnh
quang hiện nay được sử dụng trong giám sát môi trường, hóa học lâm sàng, sàng lọc
DNA và các phép phân tích gen bằng lai hóa huỳnh quang tại chỗ… Sự phát triển
này có phần đóng góp của ngành hóa học chế tạo các chất đánh dấu huỳnh quang
gồm các chất màu hữu cơ và các protein tự phát quang.
Số lượng các phân tử chất màu sử dụng trong các nghiên cứu y – sinh lên
tới hàng trăm loại [134]. Tuy có rất nhiều ưu điểm nhưng các chất màu hữu cơ có
nhược điểm là độ bền quang kém, dễ bị phân hủy dưới ánh sáng kích thích (hiện
tượng tẩy quang), dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường. Phổ hấp thụ của các chất màu
hẹp nên đối với mỗi loại chất màu đòi hỏi một nguồn laser kích thích phù hợp, vì
vậy các kính hiển vi huỳnh quang hiện đại thường được trang bị tới 3 – 4 laser khác
nhau và các phép phân tích đa kênh sẽ khó thực hiện với các chất màu. Ngoài ra, sự
phát triển của sinh học phân tử đòi hỏi nghiên cứu các quá trình sinh học diễn ra ở
mức phân tử, nội tế bào trong khoảng thời gian dài. Vì vậy độ bền quang kém của
phân tử màu hữu cơ là một trở ngại cho những nghiên cứu này. Đặc biệt đối với
việc hiện ảnh cắt lớp 3D thì trở ngại lớn nhất là sự phân hủy quang của các chất
phát quang trong quá trình thực hiện cắt lớp liên tiếp theo trục z; sự phân hủy quang
này làm ảnh hưởng tới việc dựng ảnh cấu trúc 3D. Do đó việc tìm kiếm các loại
chất đánh dấu sinh học mới vẫn là vấn đề thời sự trong các nghiên cứu của khoa học
vật liệu trên thế giới.
Trong những năm vừa qua có những cải tiến lớn trong các chất đánh dấu
sinh học bằng sự ra đời của các chất đánh dấu trên cơ sở vật liệu nano với các ưu
điểm nổi trội so với các chất đánh dấu cổ điển như: độ bền quang, độ tương phản
cao và bền trong môi trường sinh học. Các ưu điểm đó của các chất đánh dấu nano
tạo ra khả năng phát hiện các đích sinh học với độ nhạy cao trong các điều kiện
khác nhau: từ chẩn đoán in vitro cho tới hiện ảnh in vivo
[45,52,82,110,141,145,150,153,155,157]. Có thể liệt kê một số loại hạt nano thường

các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài. Hơn nữa, các
hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá học để tạo các
nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử sinh học như là amin (-
NH
2
), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH) [87,88,93,100,112,115]. Bằng cách điều
chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước hạt; số lượng tâm màu
trong hạt cũng như loại tâm màu đưa vào, do đó người ta có thể tạo ra một nhóm
lớn các hạt phát quang với các tính chất quang đa dạng dùng trong đánh dấu. Bản
thân silica là chất thân thiện với môi trường sinh học, do đó chúng có thể là các hạt
đa chức năng: vừa phát hiện và vừa mang thuốc trị bệnh
[26,52,55,57,62,63,81,84,92,106]. Vì vậy, các hạt silica nằm trong thế hệ các chất
đánh dấu sinh học mới, hứa hẹn được sử dụng rộng rãi trong các phân tích và đánh
dấu sinh học.
Các hạt nano silica chứa các phân tử màu (tâm màu) hữu cơ thường được
chế tạo bằng 3 phương pháp: Stober, micelle thuận và micelle đảo. Điểm cốt lõi của
việc chế tạo là tạo các phản ứng sol-gel của các alkoxit silic trong các trung tâm
phản ứng kích thước nano có chứa tâm màu, từ đó hình thành các mạng nền SiO
2

3
xốp kích thước nano với các tâm màu nằm trong các lỗ xốp hoặc được gắn với
mạng nền bằng liên kết đồng hóa trị. Kích thước của hạt phụ thuộc vào kích thước
của trung tâm phản ứng. Có hai cách để kết hợp tâm màu với nền silica. Cách thứ
nhất sử dụng liên kết cộng hóa trị của phân tử màu với mạng nền silica
[80,135,136], cách thứ hai là bẫy các phân tử chất màu vào trong mạng nền silica
(bằng tương tác tĩnh điện, Van der Waals…) [159]. Tùy thuộc vào tính chất của tâm
Sử dụng phương pháp micelle đảo, Weihong Tan và cộng sự đã chế tạo
được các hạt nano silica chứa các tâm màu khác nhau như : Tris(2,2 0-
bipyridyl)dichlororuthenium(II) (RuBpy), tetramethylrhodamine (TMR), TMR-
dextran hay fluorescein-dextran [116,118,130,163]. Ngoài ra còn một số loại chất
màu khác cũng được sử dụng để đưa vào trong hạt nano như: methylene blue (MB)
[29], rhodamine 6G (R6G) [130], tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)
[75] và rhodamine bisothiocyanate (RBITC) [136]. Đối với các chất màu kỵ nước,
để người ta thường liên kết chúng với nhóm dextran – là nhóm ưa nước, sau đó đưa
các chất màu này vào trong hạt nano silica bằng phương pháp micelle đảo, ví dụ
như fluorescein, Alexa Fluor 647.
Sử dụng phương pháp micelle thuận, Qian và cộng sự [103] đã chế tạo các
hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ kị nước Nile Red, Prasad và cộng sự đã chế
tạo hạt nano ORMOSIL chứa chất màu rhodamine 6G và một số chất màu khác
[22,65].
Một trong các ứng dụng quan trọng nhất của các hạt nano trong y - sinh là
đánh dấu cả in vitro và in vivo tế bào ung thư [33,41-
43,54,56,58,69,71,86,90,94,105,107,114,117,142,143,148-152,164]. Nhóm của
Santra đã chế tạo được hạt nano silica kích thước 70 nm chứa chất màu FITC bằng
phương pháp micelle đảo, sau đó được biến đổi bề mặt để có thể thâm nhập vào
màng tế bào và mô [117]. Các hạt nano chế tạo được có hiệu quả cao trong việc
đánh dấu các tế bào ung thư phổi (A549). Kết quả cũng cho thấy, có thể sử dụng hạt
nano này để chấn đoán và điều trị trong não thông qua thí nghiệm thành công trong
não chuột. Ông và cộng sự đã sử dụng hạt nano silica pha tâm màu FITC để nhận
biết các tế bào ung thư như tế bào ung thư ở miệng [121], tế bào ung thư phổi
[76,119,122]. Weihong Tan và đồng nghiệp đã sử dụng hạt nano silica kích thước
60 nm chứa Rubpy đánh dấu các tế bào bạch cầu người [102,118,120]. Tương tự
như vậy, ông và cộng sự đã báo cáo một phương pháp để nhận biết các tế bào ung
thư gan HEPG sử dụng hạt nano silica pha chất màu FITC [46]. Zhao và cộng sự đã