Y GIÁO
TẾ DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID
CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc
Mã số: 62.73.15.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
Công trình được hoàn thành tại:

1.

Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ

6.

họp tại:

7.

Vào ……. giờ ……. ngày ……. tháng …… năm …….

-

Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM
Thư viện Đại học Y Dược TPHCM

Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Quang Anh Nguyet (2011),
“Influence of pH on the separation of Crinum latifolium alakloids by thin
layer chromatography and column chromatography”, Conference
proceeding, the 2nd analytica Vietnam conference 2011, pp 213-216.
Nguyen Huu Lac Thuy, Nguyen Dang Khoa, Nguyen Thi Ngoc Yen, Vo Thi
Bach Hue (2011), “Extraction and preliminary screening for AChE inhibitor
activity of Crinum latifolium L. leaves extracts”, Conference proceeding, The
2nd Analytica VietNam Conference 201, pp 249-254.
Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Le Quang Hanh Thu (2011),
“Antioxidant activity of extracts from Crinum latifolium L.,
Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on
Pharmaceutical Sciences, pp 607-611.

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Có thể tìm hiểu luận án tại:


5. Các chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm bột lá TNHC:
- Hai chỉ tiêu cần thiết của một tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu là
chỉ tiêu định tính bằng phương pháp dấu vân tay và chỉ tiêu định lượng
bằng phương pháp HPLC với các CĐC đánh dấu đặc trưng cho TNHC.

KIẾN NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu đạt được là cơ sở khoa học để thực hiện các
nội dung nghiên cứu sâu hơn cho dược liệu TNHC:
1. Từ kết quả các chất đối chiếu đã được thiết lập, các quy trình
phân tích đã được thẩm định và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm đã
được báo cáo trong nội dung của luận án là những cơ sở khoa học
để tiến hành xây dựng “Chuyên luận dược liệu TNHC” cho Dược
điển Việt Nam trong lần xuất bản sắp tới.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả chiết xuất bằng
phương pháp SFE trên mẫu bột lá TNHC. Từ đó tiến hành các thử
nghiệm tối ưu hóa các điều kiện chiết để cho hiệu quả chiết xuất
cao nhất.
3. Khảo sát tác dụng sinh học in vitro và in vivo các hợp chất tinh
khiết đã được phân lập để khẳng định thêm công dụng của TNHC
ngoài các công dụng kháng khối u, tăng cường miễn dịch v.v…
đã được công bố trước đây.

1. Đặt vấn đề
- Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) là
dược liệu đang được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng, hoặc
dạng bào chế thuốc để điều trị các dạng u xơ tử cung, u tuyến tiền liệt.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây TNHC được nhiều
tác giả quan tâm và có nhiều công trình đã công bố. Tuy nhiên các
nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn. DĐVN IV hiện

một số chất đánh dấu trong thành phần TNHC. Hệ thống kiểm nghiệm
quốc gia chưa cung cấp bất kỳ CĐC nào có nguồn gốc từ TNHC.
Tuy nhiên, thực tế thì cây TNHC đang được sử dụng rất phổ biến. Vì
vậy các kết quả nghiên cứu của luận án có thể giải quyết được bất cập
trong công tác quản lý và đảm bảo chất lượng của dược liệu cũng như
các sản phẩm có thành phần TNHC.

Đây là ưu điểm của tiêu chuẩn kiểm nghiệm vì HPLC là phương pháp
có độ chính xác cao, được khuyến khích ứng dụng vào kiểm nghiệm
các mẫu đa thành phần như mẫu sinh học hay mẫu từ dược liệu.
Phương pháp dấu vân tay với các chi tiết đặc trưng cho thành phần
hoạt chất của TNHC sẽ góp phần đánh giá chặt chẽ hơn chất lượng của
dược liệu này.

3. Những đóng góp mới của luận án:
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình
nghiên cứu cho cây TNHC như sau:
1. Ứng dụng phương pháp SFE vào chiết alcaloid từ TNHC.
2. Phân lập đươc 17 hoạt chất từ các bộ phận của TNHC.
Trong đó có một alcaloid mới, cấu trúc là 6-ethoxyundulatin. Các hợp
chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin và isoquercitrin được phân
lập lần đầu tiên từ cây TNHC.
3. Thiết lập 6 CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin,
hippadin, astragalin và isoquercitrin. Hiện tại, các CĐC này đều chưa
được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia.
4. Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 4 quy trình phân tích
alcaloid hoặc flavonoid bằng HPLC và CE. Các quy trình này đều chưa
được công bố bởi bất cứ công trình nào trong nước và thế giới.
5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm TNHC. Hiện tại DĐVN IV và Dược điển các nước đều

3

tiến hành đánh giá về quy trình chiết xuất, phân lập để thiết lập CĐC.
Các bước thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình
thiết lập CĐC hóa học.
- Bên cạnh đó, lycorin và hippadin cũng được thiết lập CĐC do 2 hợp
chất này có độ tinh khiết cao và hiệu suất phân lập lớn. Lycorin là
alcaloid có nhiều hoạt tính sinh học và là chất đại diện cho nhiều loài
trong chi Crinum.
Hiện tại hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp các CĐC này
trên thị trường. Kết quả này có thể đóng góp thêm vào danh mục các
CĐC có nguồn gốc từ dược liệu vốn đang khan hiếm.

NỘI DUNG LUẬN ÁN

4.4 Các quy trình định tính – định lượng alcaloid hoặc flavonoid:
Alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC có thể được định tính – định
lượng bằng HPLC hoặc CE đều cho kết quả không sai biệt.
- Với quy trình định lượng alcaloid bằng HPLC: nên chú ý pH pha
động ảnh hưởng lớn đến AF và Rs của các pic định lượng. Với mẫu
flavonoid cần chú ý đến ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên độ bất
đối AF của 2 pic cần định lượng, acetonitril hiệu quả hơn methanol.
- Với quy trình định lượng alcaloid CE: cần chú ý mẫu thử alcaloid
nên được pha trong acid, kỹ thuật rửa giải MEKC ảnh hưởng nhiều
đến kết quả phân tích. Trong khi đó mẫu flavonoid chỉ cần kỹ thuật
CZE là đáp ứng các yêu cầu phân tích.
- Phương pháp dấu vân tay: có thể ứng dụng để tiêu chuẩn hóa dược
liệu và sản phẩm từ dược liệu khi nguồn cung cấp CĐC chưa đầy đủ.
4.5 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC
- Chỉ tiêu định tính hai nhóm hoạt chất chính alcaloid hoặc flavonoid


4

21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu là các alcaloid và flavonoid trong cây TNHC.

điều chỉnh, lượng mẫu nhỏ, hiệu suất chiết cao hơn các phương pháp
khác; thời gian, các bước tiến hành và thiết bị phổ biến trong các PTN.
- Chiết cao nguyên liệu từ lá để làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng:
nguyên liệu lá được lựa chọn vì năng suất thu hoạch lớn hơn thân hành
hay rễ đồng thời bảo tồn được nguồn giống, phương pháp chiết ngấm
kiệt thông dụng ở qui mô công nghiệp, trang thiết bị và cách vận hành
đơn giản và có thể thiết kế phù hợp để chiết trên nhiều cỡ mẫu.

2.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Các phương pháp chiết xuất:
- Chiết ngấm kiệt, chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các
điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu.
- Chiết bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (SFE): khảo sát các yếu tố áp
suất, thời gian, tỷ lệ dung môi hỗ trợ.
2.2.2. Phương pháp phân lập chất tinh khiết:
- Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển.
- Biện giải cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR.
2.2.3. Phương pháp HPLC, CE và dấu vân tay:
Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định tính, định lượng
alcaloid và flavonoid trong cây TNHC. Quy trình phải đạt các yêu cầu
về thẩm định.

alcaloid đại diện cho các loài trong chi Crinum.
4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết TNHC:
- Sau quá trình nghiên cứu, nhận thấy crinamidin, 6-hydroxycrinmidin
là 2 alcaloid; astragalin, isoquercitrin là 2 flavonoid có thể được chọn
làm các chất đánh dấu cho dược liệu TNHC. Vì vậy các chất này được


20

5

Cách tiến hành:
Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký đối
với dung dịch đối chiếu. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương
đối của thời gian lưu và diện tích pic astragalin và isoquercitrin không
được lớn 2,0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Dựa
vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch
đối chiếu và nồng độ astragalin (C21H20O11) và isoquercitrin
(C21H20O12) đối chiếu, tính hàm lượng của hai flavonoid astragalin và
isoquercitrin trong dược liệu.
Đánh giá: dược liệu phải chứa ít nhất 250 µg/g astragalin (C21H20O11)
và 100 µg/g isoquercitrin (C21H20O12) tính trên dược liệu khô kiệt.

UV-Vis, % diện tích của các pic đặc trưng. Xác định DVT– HPLC của
hai nhóm hoạt chất chính của TNHC.
2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC:
Thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập
CĐC hóa học thứ cấp.
2.2.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm

chiết đến khi âm tính với TT Dragendorff và TT FeCl3 1%. Tỷ lệ dung
môi/dược liệu là (10 : 1). Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc.
- Chiết flavonoid: cao cồn được siêu âm với HCl 1%. Lắc với ethyl
acetat đến khi âm tính với TT FeCl3 1%. Gộp các dịch chiết ethyl
acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid.
- Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng
amoniac 25% đến pH 9-10. Lắc với cloroform đến khi âm tính với TT
Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid.


6

19

Chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp:
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp SFE: thiết bị là hệ
thống chiết bằng lưu chất CO2 do Đài loan sản xuất với ba bình chiết
lắp song song, thể tích 20 lít/bình. Điều kiện SFE: áp suất 200 bar,
nhiệt độ 50 oC, thời gian chiết 2 giờ, 15% cồn 96%. Dịch SFE được
thu hồi dung môi (cao L-SFE). Cao L-SFE được hòa tan với HCl 1%.
Dịch acid được chiết flavonoid FL-SFE và alcaloid AL-SFE.
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau
khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70%. Dịch chiết
cồn được chiết flavonoid FL-NK và alcaloid AL-NK.

đối của thời gian lưu và diện tích crinamidin và 6-hydroxycrinamidin
không được lớn 2,0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Dựa
vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch
đối chiếu và nồng độ crinamidin (C17H19NO5) và 6-hydroxycrinamidin

nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần. Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội,
acid hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch acid hydrocloric 1% (TT) đến
pH 3 – 4. Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy flavonoid bằng cách lắc
hỗn hợp trong bình lắng với 30 ml ethyl acetat (TT) (x 3 lần). Cô dịch
chiết ethyl acetat đến cạn dung môi, thu được cắn flavonoid. Hòa tan
phần cắn này trong bình định mức 10 ml với dung môi là pha động,
thêm dung môi đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Điều kiện sắc ký:Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) được
nhồi pha tĩnh C8 (5 µm).
Detector: PDA, bước sóng 265 nm.
Rửa giải isocratic.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Thể tích tiêm: 10 µl.


18

7

B. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao: các bước tiến
hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.
Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và
flavonoid.
Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

3.3 Thiết lập chất đối chiếu
- Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là
chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC.
- 6 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin,
6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin; 2 flavonoid là astragalin và

độ cột: 40 oC; detector PDA; tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Mẫu thử: nguyên liệu CĐC được pha 100 μg/ml trong pha động.
- Thành phần pha động của mỗi chất được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.13 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh
khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.
Tên chất khảo sát

Thành phần và tỷ lệ pha động

Crinamidin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65)

6-hydroxycrinamidin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65)

Lycorin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (10 : 90)

Hippadin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (70 : 30)

Astragalin

Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75)

Isoquercitrin

Isoquercitrin:
ŷ = 17244x
R2 = 0,9991
Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R2 > 0,998).
- Độ chính xác:
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.2. RSD% độ tinh khiết sắc
ký của các pic chính < 2%.
Như vậy, các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các CĐC đạt yêu
cầu về độ chính xác.
Bảng 3.15 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng HPLC.
Tên chất đối chiếu

Độ tinh khiết sắc ký (%)

Crinamidin

98,71%

(RSD% = 0,02)

6-hydroxycrinamidin

96,78 %

(RSD% = 0,08)

Lycorin

99,99%

2
3
4
5
6

diện
tích (%)
9,0 ± 0,5 (6-hydroxycrinamidin)
21,9
10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin)
17,8
13,5 ± 0,5 (crinamidin)
13,7
18,0 ± 0,5 (6-hydroxybuphanidrin)
20,8
20,5 ± 0,5 (6-hydroxyundulatin)
18,3
23,5 ± 0,5 (undulatin)
7,6
Thời gian lưu (phút)

Phổ UV-Vis
Các pic alcaloid
đều có phổ UV
tương tự:
λmax = 214 nm
vai ở 281 nm

3.5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm

- Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN IV-Phụ lục 6.7.
- Định tính: bằng các phương pháp phổ nghiệm
Phổ UV-Vis: mẫu được hòa tan trong methanol, nồng độ 10
µg/ml. Quyét phổ trong khoảng bước sóng từ 200 – 800 nm.
Phổ MS: xác định pic cơ bản (m/z).
Phổ IR: dập viên KBr. Xác định các dao động đặc trưng.
Phổ NMR: xác định độ dịch chuyển của proton và carbon.
Dữ liệu phổ của CĐC criamidin:

Phương pháp DVT – SKLM:
Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254; chiều dài 10 cm; chiều rộng giữa
các vết khoảng 1cm; khai triển một lần ở nhiệt độ phòng.
Dung môi:
Mẫu thử alcaloid:
cloroform – methanol – dd amoniac (5 : 1 : 0,05)
Mẫu thử flavonoid:
cloroform – methanol – acid formic (3 : 1 : 1)
Tiến hành: chấm riêng biệt trên bản mỏng khoảng 20 μl dung dịch thử
và đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10
cm. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu bằng TT Dragendorff
(alcaloid) hoặc TT FeCl31% (flavonoid).
Phát hiện: đèn UV 254 hoặc 365 nm hoặc TT Dragendorff.
Đánh giá: sắc ký đầy DVT – SKLM alcaloid TNHC phải có ít nhất 6
vết có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng.
Phương pháp DVT – HPLC
Điều kiện: điều kiện sắc ký, các bước tiến hành xác định DVT alcaloid
như Mục 3.4.2; xác định DVT flavonoid TNHC như Mục 3.4.3.
Đánh giá: chọn các pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% tại λ = 214 nm
(alcaloid); λ = 265 nm (flavonoid) để ghi nhận thời gian lưu tương đối,
% diện tích pic và phổ UV.

41,7 (C-10b); 52,6 (C-12); 53,8 (C-1); 56,5 (C-2); 58,5 (C-6); 59,1
(C-14); 61,0 (C-4a); 65,2 (C-3); 96,5 (C-10); 100,7 (C-13); 117,5 (C6a); 133,4 (C-8); 138,7 (C-10a); 141,1 (C-7); 148,2 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC 6-hydroxycriamidin:
- UV/methanol: max (nm) 212 và 286.
- IR (KBr): υmax (cm-1) 3508 (-OH); 1616 (C=C); 1286 (-OCH3); 1037
(-OCH2O-).
- ESI-MS (+): m/z = 334,38 [M+H]+ ]+, M phù hợp với công thức
nguyên C17H19NO6.


10

15

- 1H-NMR (500 MHz, CDCl3+MeOD): δH (ppm) 1,52 (1H; m; H-4β);
1,60 (1H; m; H-4α); 1,77 (1H; m; H-11); 2,35 (1H; m; H-11*); 2,70
(1H; m; H-12); 3,12 (1H; m; H-12*); 3,28 (1H; brt; H-2); 3,68 (1H;
dd; J = 13,5; 10 Hz; H-4a); 3,74 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-1); 4,05 (3H; s;
H-14); 4,43(1H; d; J = 2 Hz; H-3); 5,19 (1H; s; H-6); 5,90 (2H; d; J =
1 Hz; H-13); 6,65 (1H; s; H-10).
- 13C-NMR (125 MHz, CDCl3+MeOD): δC (ppm) 28,7 (C-4); 35,5 (C11); 42,1 (C-10b); 46,3 (C-12); 53,7 (C-1); 54,6 (C-4a); 56,4 (C-2);
59,7 (C-14); 64,9 (C-3); 85,2 (C-6); 96,7 (C-10); 101,2 (C-13); 119,3
(C-6a); 134,4 (C-8); 139,2 (C-10a); 142,9 (C-7); 149,8 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC lycorin:

3.4.5 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng CE
- Điều kiện điện di: các điều kiện điện di tương tự quy trình định lượng
alcaloid. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 45 mM; điều chỉnh đến
pH 9,0 bằng acid boric, phối hợp với methanol để được dung dịch điện
di nền có 10% methanol.

(RSD = 2,16%)
(RSD = 4,07%)
µ = 112,1 ± 3,2
µ = 115,4 ± 4,4
6-hydroxycrinamidin
(RSD = 2,68%)
(RSD = 4,76%)
µ = 345,9 ± 9,5
µ = 339,7 ± 13,1
6-hydroxypowellin
(RSD = 2,63%)
(RSD = 4,81%)
µ = 421,1 ± 9,9
µ = 420,7 ± 14,8
6-hydroxybuphanidrin
(RSD = 2,24%)
(RSD = 4,38%)
µ = 77,6 ± 2,6
µ = 75,7 ± 2,36
Undulatin
(RSD = 3,17%)
(RSD = 3,90%)
µ = 286,4 ± 7,1
µ = 285,3 ± 8,5
6-hydroxyundulatin
(RSD = 2,35%)
(RSD = 3,71%)
Bảng 3.31 Kết quả định lượng flavonoid trong lá TNHC (n = 6).

Astragalin

hydrocloric đến pH 3 – 4. Chiết với 30 ml ethyl acetat (x3 lần). Gộp
toàn bộ dịch ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cắn flavonoid FL-SA.
3.4.2 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC

- ESI-MS (+): m/z = 286,31 [M+Na]+, M phù hợp với công thức
nguyên C16H9NO3.
- 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 6,16 (2H; s; H-12); 6,90 (1H;
d; J = 3,5 Hz; H-4); 7,47 (1H; t; J = 8 Hz; H-2); 7,64 (1H; s; H-11);
7,74 (1H; d; J = 8 Hz; H-3); 7,91 (1H; d; J = 8 Hz; H-1); 7,97 (1H; s;
H-8); 8,04 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-5).
- 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 101,7 (C-11); 102,3 (C-12);
108,4 (C-8); 110,8 (C-4); 116,7 (C-11a); 118,4 (C-1); 122,6 (C-3);
122,6 (C-11b); 123,5 (C-5); 124,0 (C-2); 128,4 (C-3a); 131,0 (C-11c);
131,7 (C-7a); 148,6 (C-10); 152,6 (C-9); 158,2 (C-7).
Dữ liệu phổ của CĐC astragalin:

- Các điều kiện sắc ký: cột C8 Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; 5 m),

- IR (KBr): υmax (cm-1) 3284 (OH); 1654 (C=O); 1068 (C-O).
- ESI-MS (+): m/z = 471,31 [M+Na]+, M phù hợp với công thức
nguyên C21H20O11.
- 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 3,08 (2H; br s; H-3” và H4”); 3,18 (1H; m; H-2”); 3,21 (1H; m; H-5”); 3,32 (1H; m, H-6”a);
3,56 (1H; dd; J = 11,5; 5 Hz, H-6”b); 5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”);
6,21 (1H; d; J = 2 Hz, H-8); 6,43 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,88 (2H; d;
J = 9 Hz, H-3’, H-5’); 8,04 (2H; d; J = 9 Hz, H-2’, H-6’); 10,19 (1H;
s; 4’-OH); 10,87 (1H; s; 7-OH); 12,62 (1H; s; 5-OH).
- 13C-NMR (125 MHz, DMSO): δC (ppm) của phần đường 60,8 (C6”); 69,9 (C-4”); 74,2 (C-2”); 76,4 (C-5”); 77,5 (C-3”); 100,9 (C-1”);
phần aglycon 93,63 (C-8); 98,7 (C-6); 104,0 (C-10); 115,1 (C-3’ và
5’); 120,9 (C-1’); 130,9 (C-2’ và 6’); 133,2 (C-3); 156,3 (C-5); 156,4
(C-2); 159,9 (C-4’); 161,2 (C-9); 164,10 (C-7); 177,46 (C-4).

- 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δH (ppm) 3,08 (2H; overlapped; H3” và H- 4”); 3,24 (1H; overlapped; H-5”); 3,24 (1H; overlapped; H2”); 3,32 (1H; overlapped, H-6”); 3,58 (1H; d; J = 11,5 Hz, H-6”); 5,46
(1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”); 6,20 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,40 (1H; d; J
= 2 Hz, H-8); 6,84 (1H; d; J = 9 Hz; H-5’); 7,57 (1H; overlapped, H6’); 7,58 (H; overlapped, H-2’);12,62 (1H; s; 5-OH).
- 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): phần đường δC (ppm) 61,0 (C-6”);
69,9 (C-4”); 74,1 (C-2”); 76,5 (C-5”); 77,5 (C-3”); 100,9 (C-1”); phần
aglycon δC (ppm) (C-5’); 116,2 (C-2’); 121,1 (C-1’); 121,5 (C-6’);
144,8 (C-4’); 148,4 (C-3’); 93,5 (C-8); 98,6 (C-6); 103,9 (C-10);
115,2; 133,3 (C-3); 156,2 (C-5); 156,3 (C-2); 161,2 (C-9); 164,1 (C7); 177,4 (C-4).

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của CĐC sau khi đóng gói.

- Xác định độ tinh khiết sắc ký: thực hiện phương pháp HPLC.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: các quy trình đều đạt yêu cầu.
Kết quả đánh giá độ tinh khiết sắc ký của các CĐC: kết quả được trình
bày ở Bảng 3.2. Các nguyên liệu CĐC có độ tinh khiết sắc ký ≥ 95%.
3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá các CĐC:
Các CĐC khảo sát được xây dựng tiêu chuẩn đánh giá như CĐC hóa
học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng.
3.2.4 Đóng gói và đánh giá đồng nhất:
Đóng gói: các CĐC được đóng trong các lọ thủy tinh nâu trong tủ đóng
ống Glove-box. Các ống CĐC được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 oC.
Đánh giá đồng nhất lô: các lọ CĐC đồng nhất trong quá trình gói.
Đánh giá đồng nhất liên phòng thí nghiệm: độ tinh khiết của các CĐC
không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá, các lọ CĐC đồng nhất.

TT
1
2
3
4

96,73
99,99
100,00 98,30
98,13
98,73
96,74
99,93
100,00 98,30
98,09
98,76
96,75
99,95
99,99
98,29
98,10
98,70
96,72
99,91
100,00 98,31
98,15
98,74
96,76
99,98
100,00 98,25
98,11
98,71
96,75
99,93
99,99
98,27

98,74
96,75
99,99
99,98
98,28
98,15

s*
0,023
0,017
0,009
0,020
0,115
0,018

µx
0,007
0,006
0,003
0,006
0,037
0,005

X%
98,74
96,74
99,99
99,98
98,25
98,16