ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ Ý NHI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIMONOID
CỦA LÁ CÂY NEEM AZADIRACHTA INDICA A. JUSS
TRỒNG Ở NINH THUẬN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Tp. Hồ Chí Minh-Năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ Ý NHI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIMONOID
CỦA LÁ CÂY NEEM AZADIRACHTA INDICA A. JUSS
TRỒNG Ở NINH THUẬN

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01

Phản biện 1: GS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG
Phản biện 2: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẠNH
Phản biện 3: PGS.TS. TRẦN HÙNG



LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến:
- GS.TS. Trần Kim Qui, Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trên con đường học tập và nghiên
cứu khoa học trong nhiều năm qua.
- PGS.TS. Trần Lê Quan đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều
kiến thức chuyên môn, Thầy luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành luận án này.
- GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng đã quan tâm, động viên và dành thời gian
sửa chữa, đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp cho tôi hoàn thành luận án này.
- GS.TSKH. Nguyễn Công Hào, PGS.TS. Trần Công Luận đã quan tâm và
đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho các chuyên đề tiến sĩ và luận án.
- PGS.TS. Trần Hùng, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh, GS.TS. Nguyễn
Minh Đức, PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến
quý báu cho luận án.
- TS. Tôn Thất Quang đã động viên, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu
trong quá trình thực hiện luận án này.
- Tất cả quý Thầy Cô trong Bộ Môn Hóa Hữu Cơ đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi thực hiện luận án.
- Phòng NMR thuộc Viện KHCN Hà Nội, Phòng Phân Tích Trung Tâm và
phòng Hợp chất Thiên nhiên thuộc trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM
- Phòng Sau Đại Học trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM
- Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, luôn bên cạnh động
viên, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án này.
Nguyễn Thị Ý Nhi


MỤC LỤC

i


3.2.7. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 25.................................... 73
3.2.8. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 3...................................... 75
3.2.9. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 19.................................... 78
3.2.10. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 20.................................. 80
3.2.11. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 22 ................................. 83
3.2.12. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 5.................................... 88
3.2.13. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 1.................................... 90
3.2.14. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 17 ................................. 93
3.2.15. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 4.................................... 96
3.2.16. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 35 ................................. 98
3.2.17. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 14 ............................... 100
3.2.18. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 30 ............................... 102
3.2.19. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 28 ............................... 103
3.2.20. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 34 ............................... 108
3.2. NHẬN XÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM PHỔ NMR CỦA CÁC TRITERPEN THUỘC
AZADIRACHTA INDICA.................................................................................... 111
3.3. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC ........................................ 119

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ...................................................................................... 124
KIẾN NGHỊ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................. 126
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ............................................................... 127
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 128
PHỤ LỤC

ii



J

: hằng số ghép (coupling constant)

SKC

: sắc ký cột

SKLM

: sắc ký lớp mỏng

RP-18

: Reversed Phase C-18

LC-MS

: sắc ký lỏng ghép khối phổ
(Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy)

HR-ESI-MS

: Khối phổ ion hóa bằng kỹ thuật phun điện phân giải cao
(High Resolution-Electro Spray Ionization-Mass Spectrometry

UV

: Ultraviolet Spectroscopy


DMSO

: DiMetyl SulfOxid

TMS

: TetraMetylSilan

Ac

: Acetyl

Bz

: Benzoyl

Cin

: Cinnamoyl

Me

: Metyl

Meth

: Methacryloyl

Sen



2

Hình 1.2.

Dạng khung sườn euphol và tirucallol

5

Hình 1.3.

Các protolimonoid (1-8) và apo-protolimonoid (9-11)

9

Hình 1.4.

Mononortriterpenoid

10

Hình 1.5.

Dinortriterpenoid

10

Hình 1.6.

Trinortriterpenoid


Hình 1.12. Các limonoid mở vòng C với nhánh -hydroxybutenolid

22

Hình 1.13. Limonoid mở vòng C với nhánh -hydroxybutenolid

24

Hình 1.14. Một số pentanortriterpenoid

24

Hình 1.15. Một số hexanortriterpenoid

25

Hình 1.16. Một số octanortriterpenoid

25

Hình 1.17. Một số nonanortriterpenoid

26

Hình 1.18. Phân loại bệnh đái tháo đường

36

Hình 1.19. Cấu trúc phân tử các hoạt chất trong các thuốc trị đái tháo đường


65

Hình 3.6.

Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 33

65

Hình 3.7.

Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 31

69

v


Hình 3.8.

Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 31

70

Hình 3.9.

Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 23

71


83

Hình 3.18. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 22

85

Hình 3.19. Một số tương quan trong phổ NOESY của NEEM 22

85

Hình 3.20. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 5

89

Hình 3.21. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 1

92

Hình 3.22. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 1

92

Hình 3.23. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 17

94

Hình 3.24. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 17

95


106

Hình 3.33. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất NEEM 34

109

Hình 3.34. Tương quan NOESY của hợp chất NEEM 34

110

Hình 3.35. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất
limonoid không mở vòng C và hợp chất mở C.

vi

112


Hình 3.36. Các nhóm thế thường gặp trong các hợp chất limonoid

113

Hình 3.37. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất có
nối đôi liên hợp dạng en-on trong vòng A.

114

Hình 3.38. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất có
liên kết eter giữa C-6 với C-28 và C-7 với C-15.



DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1. Sinh tổng hợp các limonoid trong cây neem Azadirachta indica

6

Sơ đồ 1.2. Con đường sinh tổng hợp protolimonoid được đề nghị

7

Sơ đồ 1.3. Sự chuyển vị -Apo

8

Sơ đồ 1.4. Cơ chế đề nghị cho dạng khung sườn azadirone (G1)
và homoazadirone (H)

12

Sơ đồ 1.5. Cơ chế đề nghị cho những dạng khung sườn vilasinin (I)
và gedunin (J)

15

Sơ đồ 1.6. Cơ chế đề nghị cho sự tạo thành các triterpen mở vòng C
với vòng hemiacetal và khung sườn của azadirachtin

18




DANH MC BNG BIU
Trang
Bng 2.1. Sc ký ct trờn cao etyl acetat

44

Bng 2.2. Baỷng theồ tớch sửỷ duùng trong qui trỡnh thửỷ hoaùt tớnh
49

c ch -glucosidase
Bng 3.1. So sỏnh s liu ph NMR ca NEEM 8 v odoraton

57

Bng 3.2. So sỏnh s liu ph NMR ca NEEM 24 v 23-deoxyazadirachtolid 60
Bng 3.3. S liu ph 1H-NMR ca NEEM 39, NEEM 33 v NEEM 31

66

Bng 3.4. S liu ph 13C-NMR ca hp cht NEEM 39, NEEM 33 v NEEM 31

67

Bng 3.5. So sỏnh s liu ph NMR ca hp cht NEEM 23 v azadirachtolid 72
Bng 3.6. S liu ph NMR ca hp cht NEEM 25 v NEEM 3

76



3.15.
3.16.
Bng 3.17.

50

acarbose
t v cao phõn on

50
50

120
120

cỏc hp cht limonoid

phõn lp t cao etyl acetat

121

ix


MỞ ĐẦU
Cùng với những thành quả mà ngành hóa học hữu cơ đạt được, hóa học các hợp
chất tự nhiên cũng ngày càng khẳng định vị trí của mình với những đóng góp vượt
trội trong đời sống con người. Từ xưa con người đã biết sử dụng các loại thảo mộc
để làm thuốc trị bệnh, chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian. Chính vì vậy, việc

Tên khoa học: Azadirachta indica A. Juss còn gọi là Melia indica (A. Juss),
Melia azadirachta L.
Các tên gọi khác theo các nước: lianshu, kulian, lian zao zi (Trung Quốc); yin
du lian shu (Đài Loan); mind (Indonesia); cha-tang, sadao (Thái Lan); sầu đâu (Việt
Nam); margosa, neem, chinabery, neem tree (Anh); niembaum, nimbaum (Đức);
balnimb, nim, nind (Hindi); bevinmar (Canada); veppu (Malaysia); nim (Nepal) …

Hình 1.1. Azadirachta indica A. Juss
Cây to cao từ 15-20 m, ở điều kiện thích hợp có thể cao tới 40 m. Lá kép hình
lông chim lẻ, mọc so le, gồm 6-7 đôi chét lá mọc đối, hình mác, dài 3-8 cm, rộng 23 cm, phiên lệch, nhẵn, đầu nhọn, mép khía răng (lá non có mép nguyên). Cụm hoa
mọc ở kẽ lá, ngắn hơn lá, gồm nhiều hoa kết thành những xim nhỏ, hoa màu trắng
giống hoa xoan, thơm, dài 5-6 mm, rộng khoảng 8-11 mm, mặt ngoài có lông, tràng
năm cánh thuôn hẹp, uốn cong, phình ở gốc, hơi thắt lại ở đầu. Quả hạch (hình bầu
dục) dài khoảng 2 cm chứa một hạt, nhân hạt màu trắng, thịt đắng. Rễ gồm có rễ
cọc ngắn và nhiều rễ bên mọc khá dài.

2


1.2. VÙNG PHÂN BỐ28,101
Cây neem (A. indica) là cây đặc biệt ưa sáng, chịu hạn, có thể phát triển trong
những vùng bán khô hạn, bán sa mạc, có lượng mưa trung bình hằng năm từ 4001200 mm. Cây thích hợp ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có nhiệt độ trung
bình hằng năm từ 21-32 oC. Cây có thể chịu được nhiệt độ cao nhưng không thể
chịu được nhiệt độ dưới 4 oC. Cây neem có thể phát triển trên nhiều loại đất, nhưng
tốt nhất là trên vùng đất cát. Neem là loài cây sinh trưởng tốt, kể cả những miền
duyên hải khô cằn, những vùng đất phía nam, và cả những vùng đất dốc khô.
Cây neem được xem là có nguồn gốc ở vùng tiểu lục địa Ấn Độ-Pakistan. Ngày
nay, nó được tìm thấy ở khu vực phía nam Châu Á như ở Ấn Độ, Pakistan, Bangla
Desh, Burma và vùng khô cằn của Sri Lanka. Ở Đông Nam Á, đặc biệt tập trung ở
Thái Lan, miền nam Malaysia và Indonesia. Nó cũng được tìm thấy ở một số nước

trinortriterpenoid,
hexanortriterpenoid,

tetranortriterpenoid

(limonoid),

heptanortriterpenoid,

pentanortriterpenoid,

octanortriterpenoid

và

nonanortriterpenoid.
Ngoài ra, các hợp chất loại isoprenoid khác cũng đã được nghiên cứu từ cây
neem như sterol (isopren cải biến) và các diterpenoid.48,59,81,101
- Thành phần các hợp chất không-isoprenoid là các hợp chất như polyphenol
(flavonoid và coumarin), carbohydrat, protein, hydrocarbon, acid béo và các ester
của nó cũng đã được nghiên cứu.81,101

● Thành phần các triterpen theo sự sinh tổng hợp
Theo Connolly và Taylor,23,98 các limonoid (tetranortriterpenoid) trong cây
neem được phân loại theo quá trình sinh tổng hợp (sơ đồ 1.1). Khởi đầu từ triterpen
bốn vòng hay còn gọi là protolimonoid hoặc protomeliancin hoặc melian (nhóm 1)
và từ đó chuyển hóa thành nhiều limonoid khác nhau và có thể chia thành các nhóm
khác nhau như apo-protolimonoid hay còn gọi là apo-tetracylic triterpen (nhóm 2,
sơ đồ 1.1), tetranortriterpenoid với nhánh là vòng -hydroxybutenolid (nhóm 3a, sơ


Buchanan (1970)21 và S. Siddiqui (1986)85 cho rằng limonoid là
tetranortriterpenoid được hình thành khi mạch nhánh tại C-17 mất đi bốn nguyên tử
carbon, sau đó đóng vòng thành vòng -hydroxybutenolid (nhóm 3a) hoặc vòng
furan (nhóm 3b).
Trong khi đó, Kraus (1980)49 và Connolly (1983)23 cho rằng sinh tổng hợp
limonoid với vòng furan (nhóm 3b) có thể được tạo trực tiếp từ apo-protolimonoid
(nhóm 2), còn vòng -hydroxybutenolid (nhóm 3a) được tạo ra sau nhờ quá trình
oxy hóa vòng furan của các limonoid tương ứng.
5


21

H

18
11
19
1
A
3

C

9
10

24

H

Apo-tetracylic triterpen (Nhóm 2)

Tetracylic triterpen (Nhóm 1)

O

O

O
OH

OH

OH

Nortriterpen năm vòng với vòng
furan (Nhóm 3b)

Nortriterpen năm vòng với vòng
-hydroxybutenolid (Nhóm 3a)

O

O

OH

21

O

O

14

8

10

D

15

O

A

B

O
O

7
6

C-seco nortriterpen với vòng
-hydroxybutenolid (Nhóm 4a)

C-seco nortriterpen với
vòng furan (Nhóm 4b)


(C)
Euphol (20-H )
Tirucallol (20-H )

Lanosterol (B)

HO
Butyrospermol (D)

Sơ đồ 1.2. Con đường sinh tổng hợp protolimonoid được đề nghị56,81

7


Qua các nghiên cứu in vitro,28,38,80 protolimonoid (1-8) là các triterpen có 30
carbon và có chứa một mạch nhánh 8 carbon tại C-17 (dẫn xuất của euphan hoặc
tirucallan), nó được xem là tiền chất sinh tổng hợp các limonoid.
Epoxysqualen (A) hoặc chất sinh tổng hợp tương đương (A1) có thể biến đổi
thành lanosterol (B) hoặc tiền chất sinh tổng hợp (C) của các triterpen và các sterol,
trong khi đó tiền chất của các limonoid (meliacin hay tetranortriterpenoid), được
cho là butyrospermol (D) thì lại được hình thành qua chất đồng phân 7 của euphol
bằng cách chuyển dời liên kết đôi28,32,52 (sơ đồ 1.2).
1.3.1.2. Apo-protolimonoid (nhóm 2, sơ đồ 1.1)
Dẫn xuất epoxid D1 của butyrospermol bị sắp xếp lại bằng cách mở vòng
epoxid, theo sau sự di chuyển nhóm 14 -metyl đến vị trí C-8 và hình thành nhóm
hydroxy ở vị trí C-7 cấu hình , cùng với một liên kết đôi ở C-14 (sơ đồ 1.3), đưa
đến sự hình thành khung sườn apo-protolimonoid (E).28,52,74

14




-hydroxybutenolid xảy ra sau sự sắp xếp lại phần khung vòng apoprotolimonoid.28,80,81
OH

OH

O

HO

O
H

HO

O

O

OH

CH2OH

O

O

Meliantriol (1)



O

HO
O
HO
OH

O

O

Melianon (7)

OH

O

OAc

Naheedin (9)

Ordoraton (8)

OH
HO

O

HO

carbon, chỉ còn bảy carbon.
Chỉ duy nhất một hợp chất melianol (12) được cô lập từ lá.78
O

O

OH

MeOOC

O
O
O
O

Melianol (12)
Hình 1.4. Mononortriterpenoid

1.3.3. Dinortriterpenoid: mạch nhánh tám carbon trên C-17 giảm đi hai carbon,
chỉ còn sáu carbon.
Đã có hai hợp chất loại này được cô lập từ vỏ quả là acid azadirolic67(13),
azadiradionol81 (14).
HO
COOH
O

O

OH


CH2OH

HOH 2C

OH
H3C

O

OH

CH3
O
AcO
HOH 2C

OH

Limbonin (15)

H H
O C C C
O

O

Meliacinolactol (16)

O


HO

O

O

H

H

HO

O

23

21

HO

OH

OH

Apo-protolimonoid (F)

HO

OH


Hợp chất nimonol (20) và nimocinol28,84 (21) có cùng một công thức cấu tạo và
một số tài liệu cho rằng hai hợp chất này là một. Tuy nhiên, hợp chất nimonol với
vòng furan ở C-17 có cấu hình , còn hợp chất nimocinol với vòng furan ở C-17 có
cấu hình , nên còn được gọi là 17-epi-nimonol.83
Hợp chất 1 ,2 -epoxy-17 -hydroxyazadiradion (22) cô lập từ dầu hạt neem35
là hợp chất đại diện cho các limonoid có chứa nhóm 1,2-epoxy và nhóm 17hydroxy.
Vilasinin (23) và 1,3-diacetylvilasinin (24) mang nhóm hydroxyl ở C-7 và liên
kết eter giữa C-6 và C-28 đã được công bố từ hạt neem.81 Các dẫn xuất 6-hydroxyl
của azadiron có thể được xem là tiền chất phù hợp cho khung sườn cơ bản (I) của
12