BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
----------

HÀ THỊ MINH TÂM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM SÁNG DA CỦA
CHIẾT XUẤT TỪ CỦ BÁCH BỘ Stemona cochinchinensis
VÀ LÕI GỖ MÍT Artocarpus heterophyllus
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (Sinh lý học người và động vật)
Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Phương Hoa

Hà Nội – 2014
LỜI CẢM ƠN


Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn cô giáo –
TS.Lê Thị Phương Hoa đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa Sinh và Tế
bào học, Bộ môn Sinh lý Người và Động vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội đã chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi làm đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ tận tình từ TS. Đặng Ngọc Quang – Phòng
Hóa hợp chất thiên nhiên, Khoa Hoá học. Đồng thời tôi cũng chân thành cảm
ơn sự giúp đỡ từ cô Phạm Thùy Linh, Phòng Thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa
học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam cùng các bạn sinh viên,
học viên cao học Bộ môn Hoá sinh và Tế bào học, Khoa Sinh học.


: Cao phân đoạn Ethyl acetate

FBS

: Huyết thanh thai bò (Fetus bovine serum)

GAE

: Đương lượng acid gallic (Gallic acid equivalent)

H2O

: Cao phân đoạn nước

n –Hex

: Cao phân đoạn n – Hexane

IC50

: Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory
concentration)

L-DOPA

: Dihydroxyphenylalanine

MIC


những vấn đề về thẩm mỹ và bệnh học đối với da.
Bức xạ mặt trời có các tia cực tím có bước sóng ngắn có thể xuyên sâu
vào da gây tổn thương cho các tế bào da. Tuy nhiên, việc tia cực tím chiếu
vào da sẽ kích thích sự sản sinh sắc tố da melanin từ các tế bào sinh melanin
(melanocyte) – tế bào nằm ở lớp màng đáy của biểu bì, và các bào quan sinh
melanin (melanosome) trong các tế bào sừng (keratinocyte) để bảo vê da. Sự
tăng sinh và tích lũy melanin trong da gây nên sạm da, nám, tàn nhang, làm
mất đi vẻ thẩm mĩ của làn da. Hơn nữa, việc nám da lâu dài cũng có thể dẫn
đến ung thư da.
Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm ra các chất ức chế sinh tổng hợp
melanin có ý nghĩa quan trọng. Nhiều nghiên cứu đã tìm ra một số chất có tác
dụng ức chế sinh tổng hợp melanin, sử dụng làm thành phần mỹ phẩm làm
sáng da như hydroquinone, acid kojic, arbutin, acid azelaic... Tuy nhiên,
chúng có thể gây ra một số tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe. Do đó, việc
tìm kiếm những chiết xuất và chất có tác dụng làm sáng da có nguồn gốc từ
thiên nhiên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu và bước
đầu đem lại những kết quả khả quan.
Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có đa dạng các loài thực vật
trong đó có nhiều loài dược liệu quí có hoạt tính sinh học phong phú. Những
loài thực vật đó đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan
tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay có rất ít công trình công

1


bố về khả năng làm sáng da của thực vật ở Việt Nam. Vì vậy chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng làm sáng da của chiết xuất từ củ bách bộ
Stemona cochinchinensis và lõi gỗ mít Artocarpus heterophyllus”.
2. Lịch sử nghiên cứu
2.1. Tình hình nghiên cứu về khả năng làm sáng da của các chiết xuất

bào khối u ác tính B16 của chuột lang. Kết quả nghiên cứu cho thấy thành
phần glabridin chiết xuất từ cam thảo có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng
hợp melanin thông qua ức chế hoạt động của tyrosinase ở nồng độ 0,1-1,0
µg/ml. Thí nghiệm còn cho thấy tình trạng ban đỏ ở da của những con chuột
thí nghiệm do tiếp xúc với tia UVA, UVB giảm đi khi bôi tại chỗ kem chứa
0,5% glabridin. Bên cạnh đó nghiên cứu còn chứng minh được glabridin
không chỉ ức chế hình thành melanin mà còn có tác dụng chống viêm da [50].
Năm 2003, K.T. Lee và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng ức chế
tyrosinase và quá trình hình thành melanin trên tế bào khối u B16 của
dịch chiết từ cành dâu Ramulus mori. Kết quả cho thấy hợp chất 2,3',4,5'
-tetrahydroxystilbene(2-oxyresveratrol) tinh sạch từ dịch chiết cành dâu
tằm có khả năng ức chế tyrosinase với IC 50, nồng độ ức chế 50%, = 0.23
µg/ml. Đồng thời khi nghiên cứu trên chuột lang, các nhà khoa học còn
thấy rằng dịch chiết từ cành dâu có tác dụng làm giảm hàm lượng melanin
ở chuột lang. Ngoài ra, thử nghiệm chiết xuất từ cành dâu trên da không
gây dị ứng, thậm chí chiết xuất này còn không gây kích ứng khi tiếp xúc
với mắt, không gây độc qua đường tiêu hóa [26].
Cũng trong năm này, SJ. Kim và cộng sự đã tìm ra được các ba
flavonoid từ dịch chiết ethanol của cây khổ sâm (dã hòe) Sophora
flavescens. Đó là sophoraflavanone G, kuraridin, và kurarinone. Các hợp
chất này có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh hơn acid kojic. Cụ thể đối
với acid kojic thì giá trị IC 50 = 20,5 µM, còn đối với ba hợp chất

3


sophoraflavanone G, kuraridin, và kurarinone thì giá trị IC 50 lần lượt là
6,6; 0,6 và 6,2 µM [22].
Năm 2007, O¨. O¨zer và cộng sự đã tách chiết và chứng minh được
một hợp chất polyphenol, acid ellagic từ các dịch chiết methanol của một số

trình hình thành melanin trong melanocyte B16. Các hoạt tính của dịch chiết
được cho là do một số thành phần có trong dịch chiết như afzelin và
naringenin – một loại flavanone [35].
Cũng trong năm nay, nhóm các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản gồm Y.
Yamashita – Higuchi và cộng sự đã tìm ra được dẫn xuất của arbutin mới từ
dịch chiết trong methanol của lá cây ngân hoa (Grevillea robusta). Các dẫn
xuất này tên gọi là grevilloside J – Q có khả năng làm sáng da và ức chế tốt
sự hình thành vết nám trên da [48].
2.2. Tình hình nghiên cứu về khả năng làm sáng da của các chiết xuất
thực vật tại Việt Nam
Mặc dù Việt Nam là nước có các loài thực vật phong phú nhưng từ
trước đến nay chưa có công trình khoa học nào công bố về khả năng làm sáng
da của các chiết xuất thực vật. Những thực vật có tác dụng làm sáng da ở Việt
Nam mới chỉ được thống kê dựa trên kinh nghiệm truyền thống từ xa xưa và
đã được GS. Đỗ Tất Lợi chỉ ra trong cuốn Những cây thuốc và vị thuốc Việt
Nam, ví dụ như bạch chỉ, đỗ xanh, bí đao…[1]. Tuy nhiên, gần đây, cũng có
một số công trình về khả năng ức chế tyrosinase của chiết xuất thực vật và
chất tinh sạch.
Năm 2012, các nhà khoa học thuộc khoa Hóa học, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã công bố hoạt tính ức
chế quá trình sinh tổng hợp melanin của chất tinh sạch từ dịch chiết methanol
của lá cây mít Artocarpus heterophyllus [3].

5


Năm 2013, Hà Mạnh Tuấn và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh
được hoạt tính ức chế tyrosinase của acid vanillic phân lập từ củ mài [2].
Năm 2013, công ty Dược Saman cho sản phẩm Trắng bền Saman có tác
dụng làm trắng/sáng da, gồm hỗn hợp các chiết xuất từ một số thảo dược như:

cao phân đoạn củ bách bộ.
- Xác định khả năng ức chế sinh trưởng dòng tế bào SK-MEL2 melanoma của chiết xuất củ bách bộ và lõi gỗ mít.
- Xác định khả năng ức chế tyrosinase và hấp thụ tia UVB, UVA của
các chất tinh sạch từ lõi gỗ mít.
- Phân tích khả năng ức chế sinh tổng hợp melanin trên chuột thí nghiệm.
6. Đóng góp mới của đề tài
Đưa ra dẫn liệu đầu tiên về hoạt tính ức chế sinh tyrosinase, khả năng
hấp thụ tia UVB, UVA của các chiết xuất từ củ bách bộ Stemona
cochinchinensis, khả năng ức chế dòng tế bào SK-MEL-2 melanoma của chiết
xuất củ bách bộ và lõi gỗ mít Artocarpus heterophyllus, tác dụng làm sáng da
của chiết xuất lõi gỗ mít trên chuột thí nghiệm.
7. Phương pháp nghiên cứu
7.1. Phương pháp thực nghiệm
- Phương pháp tách chiết và phân đoạn
- Phương pháp khảo sát thành phần một số hợp chất thứ cấp
+ Sắc ký bản mỏng
+ Xác định hàm lượng phenol tổng số
+ Xác định hàm lượng flavonoid tổng số
- Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học
+ Hoạt tính chống oxy hóa
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật
- Phương pháp phân tích khả năng làm sáng da
+ Hoạt tính ức chế tyrosinase
+ Khả năng hấp thụ các tia UVB và UVA

7


+ Khả năng ức chế dòng tế bào SK – MEL- 2 melanoma
+ Khả năng làm sáng da trên mô hình chuột thí nghiệm


Hạ bì

Hình
tạo da
[56, 57]
Da là lớp
bao1.1.
phủCấu
bề mặt
củavàcơmelanocyte
thể, là cơ quan
thực hiện nhiều chức
năng khác nhau như: bảo vệ cơ thể chống lại những tác động có hại, chức
năng cảm giác, bài tiết, điều hòa thân nhiệt và trao đổi khí. Da được cấu tạo
gồm ba lớp: lớp biểu bì, lớp bì hay còn gọi là hạ bì và lớp mỡ dưới da [5].
+ Lớp biểu bì (epidermis)
Đó là lớp ngoài cùng của da, cấu tạo bởi nhiều tầng tế bào của mô
thượng bì. Trên cùng là lớp sừng gồm các tế bào biểu mô đã chết, thường
được bóc ra khỏi da cùng lớp bụi và vi khuẩn bám vào nó.
Bên dưới lớp sừng là các tế bào sống. Tầng sâu nhất của biểu bì có khả
năng sinh sản ra tế bào mới gọi là tầng sinh trưởng (tầng Malpighi) hay gọi là
tầng đáy. Ở tầng này có khoảng 10% các tế bào sắc tố - melanocyte có dạng

9


hình sao có thể sản sinh ra các sắc tố melanin khi có tác động của tia cực tím.
Bên trong melanocyte có nhân, thể golgi, màng lưới nội chất tham gia tổng
hợp nên tyrosinase, enzyme xúc tác quá trình tổng hợp melanin. Xung quanh

gồm một loạt các phản ứng oxi hóa khử [12, 38].
Bước đầu tiên của quá trình hình thành sắc tố là tyrosinase oxi hóa
acidacid amin tyrosine có sẵn trong da thành dopaquinone. Đây là bước quan
trọng trong sinh tổng hợp melanin vì các bước còn lại của chuỗi phản ứng có
thể được tiếp tục diễn ra một cách tự động trong điều kiện pH của cơ thể
[12,38].
Bước tiếp theo: dopaquinone được tự động oxi hóa chuyển thành
DOPA (dihydroxyphenylalanine). DOPA là cơ chất của tyrosinase và lại được
oxi hóa ngược lại thành dopaquinone dưới tác dụng của tyrosinase [12].
Dopaquinone cũng được oxi hóa chuyển thành leukodopachrome rồi tự
động chuyển thành dopachrome là một chất trung gian có màu da cam. Sau đó
dopachrome tự động mất nhóm CO2 để thành DHI (5,6-dihydroxyindole).
Đồng thời dưới tác dụng của enzyme gắn protein TRP (tyrosinase-related
protein) thì dopachrome được chuyển thành DHICA ( 5,6-dihydroxyindole
-2-carboxylic acid). Cuối cùng, eumelanin được tạo thành qua một chuỗi các
phản ứng oxi hóa khử từ DHI và DHICA [12].
Trong điều kiện với sự có mặt của cysteine, acid amin chứa lưu huỳnh
hoặc glutathione, một tripeptide

được tổng hợp từ 3 acid amin là L –

glutamate, L-glycine, L– cysteine thì dopaquinone được tự động chuyển
thành cysteinyldopa hoặc glutathioyldopa rồi tạo thành pheomelanin [12].
Ngoài eumelanin và pheomelain, có một loại melanin khác gọi là
allomelanin được tạo thành dựa trên sự trùng hợp các monophenolic khác từ
tyrosinase [12].

11




DHI

TRP
ICAQ

DHICA

TYR

IQ
EUMELANINS
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp melanin [12].
TYR: Tyrosinase; TRP: Tyrosinase-related protein; IQ: Indole – 5,6 –
quinone; HBTA: 5 – hydroxyl – 1,4 – benzothiazinylalanine
1.1.3. Tác dụng của các tia UV đến sự hình thành sắc tố da

13


Tia tử ngoại (UV) là các tia không nhìn thấy của năng lượng từ mặt
trời, có bước sóng từ 200 ~ 400nm. Có ba loại tia tử ngoại với các bước sóng
khác nhau: UVA (320 – 400nm), UVB (280 – 320nm) và UVC (200 –
280nm) [43].
Trong số ba loại tia UV thì tia UVC là tia bức xạ rất nguy hiểm đối với
cơ thể, kể cả khi tiếp xúc trong thời gian ngắn. Nó cực kì có hại đối với làn
da. Tuy nhiên, các tia UVC được hấp thụ gần như hoàn toàn bởi tầng ozone
trong khí quyển của trái đất và không có tia bức xạ nào có bước sóng dưới
290 nm có thể xâm phạm được vào không gian của trái đất [19].
Tia UVA chiếm 95% trong số các loại tia UV chiếu xuống trái đất. Đây

1.2. Một số hoạt chất có tác dụng làm sáng da
Các hoạt chất được dùng trong mỹ phẩm làm sáng da có tác dụng làm
ức chế quá trình sinh tổng hợp melanin thông qua ức chế hoạt tính tyrosinase.
Trên thế giới đã có một số hợp chất được sử dụng rộng rãi trong công nghệ
làm đẹp da như hydroquinone, arbutin, acid kojic, acid azelaic [12,20,37,30].
Bên cạnh đó, với nền khoa học tiên tiến hiện nay, các nhà khoa học cũng đã
tìm ra một số lượng lớn các hợp chất mới có tác dụng ức chế tyrosinase như
polyphenol, các dẫn xuất benzaldehyde và benzoate, một số steroid và lipid
mạch dài [12, 30].
1.2.1. Các hợp chất phổ biến làm sáng da
1.2.1.1.Hydroquinone
Là một hợp chất hydroxyphenolic được dùng rộng rãi để điều chế mỹ
phẩm làm sáng da, và điều trị các bệnh liên quan đến rối loạn tăng sắc tố da
như nám, tàn nhang. Hydroquinone có tác dụng gây độc đối với tế bào
melanocyte thông qua ức chế hoạt động trao đổi chất của tế bào melanocyte.
Cụ thể, nó ức chế quá trình tổng hợp ADN và ARN. Từ đó gây ảnh hưởng
đến quá trình sinh tổng hợp tyrosinase làm giảm hoạt tính của tyrosinase. Tác
dụng này dẫn đến sự ức chế quá trình chuyển từ DOPA thành melanin. Kết

15


quả là số lượng tế bào melanin và melanosome giảm đi làm da trở nên sáng
hơn, giảm nám, tàn nhang [21, 38].
Các nghiên cứu còn cho thấy hydroquinone có thể phá hủy cấu trúc
màng tế bào melanocyte, thậm chí phá hủy cả tế bào melanocyte làm giảm số
lượng tế bào sinh melanin trong da. Điều này là tiềm năng cho việc chữa trị
bệnh nám, tàn nhang và giảm nguy cơ tái phát [16].
Bên cạnh những hydroquinone tổng hợp, các nhà khoa học còn tìm
thấy các hidroquinone tự nhiên trong nhiều thực vật như: cà phê, chè [38].

vi chứa tế bào melanin [38].
Việc sử dụng acid kojic có khả năng gây kích ứng da kèm theo viêm
da. Tuy nhiên, khi dùng kết hợp với corticosteroid thì sẽ làm giảm đáng kể
kích ứng da [38].
1.2.1.4. Arbutin
Arbutin là một dẫn xuất dạng β-glucopyranoside của hydroquinone
được chiết xuất từ thực vật như quả tươi của cây dẻ ngựa Aesculus californica
[16, 38]. Arbutin có tác dụng ức chế quá trình oxi hóa DOPA thành
dopaquinone dưới tác dụng của tyrosinase. Hơn thế nữa, arbutin được đánh
giá là ít có tác dụng phụ hơn so với hydroquinone và được khẳng định rằng
khá an toàn đối với người sử dụng [16]. Do đó, arbutin là một hợp chất có
hiệu quả cao trong việc ức chế sự hình thành melanin và được sử dụng phổ
biến trong điều trị bệnh tàn nhang, nám da… [38, 16]. Thậm chí các nhà khoa
học còn chứng minh được là hiệu quả ức chế hình thành melanin của arbutin
còn mạnh hơn cả acid kojic [21].

1.2.2. Một số hợp chất làm sáng da khác
1.2.2.1. Polyphenol
Polyphenol là một nhóm gồm các hợp chất đa chức năng chứa phenol
được phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có khả năng ức chế tyrosinase

17


hiệu quả. Trong số lượng lớn các polyphenol thì nhóm flavonoid được xem là
tốt nhất. Flavonoid thường có mặt ở lá, hạt, vỏ, và hoa của thực vật. Đồng
thời chúng cũng có nhiều ở trong rượu vang, trong những loại quả có màu đỏ
như cà chua, và trong các loại rau xanh. Sự có mặt của các flavonoid trong
thực vật có ý nghĩa quan trọng đó là bảo vệ cây chống lại tác động của tia
UV, các mầm bệnh và động vật ăn cỏ [12].

xuất từ một số loài thực vật như rễ của cây mao lương (Pulsatilla cernua), lá
cây nhân sâm (Panax ginseng)… có hiệu quả trong việc ức chế hoạt động của
tyrosinase [12].
Hầu hết các hợp chất benzaldehyde ức chế tyrosinase đều không tìm
thấy ở thực vật nhưng lại có mặt ở nấm. Protocatechualdehyde là hợp chất
được tách chiết từ loài nấm thượng hoàng ( Phellinus linteus) có hiệu quả
làm sáng da gấp 7 – 8 lần so với acid kojic [12].
Đối các hợp chất benzoate, chúng ức chế tyrosinase bằng việc tạo phức
càng cua với nhân đồng của enzyme. Trong số các hợp chất benzoate thì acid
gallic (3,4,5-trihydroxybenzoate), đặc biệt là các dẫn xuất ester của nó có hoạt
tính ức chế tyrosinase. Các nghiên cứu đã cho thấy các este mạch ngắn
(<C10) bị oxi hóa bởi tyrosinase, nhưng các ester mạch dài (>C10) lại ức chế
được enzyme mà không bị oxi hóa nhưng khả năng ức chế tyrosinase của nó
rất thấp, thấp hơn 30 lần so với acid kojic [9]. Tuy nhiên, có một số dẫn xuất
hydroxy flavonoid của acid galic được chiết xuất từ lá trà xanh lại có hiệu quả
ức chế enzym tyrosine cao như GCG ((+)gallocatechin-3–O–gallate) và
EGCG ((-)-epigallocatechin-3-O-gallate) [12, 30].
1.2.2.3. Các lipid và steroid mạch dài
Gần đây, các nhà khoa học đã tìm thấy một số lipid mạch dài nhưng
kém hiệu quả ức chế tyrosinase như glycosphingolipid, β-glucopyranose được
chiết xuất từ lá cây bồ hòn (Guioa villosa) có tác dụng ức chế hoạt động
tyrosinase nhưng khả năng ức chế chỉ bằng một nửa của acid kojic. Thậm chí,
khả năng ức chế hoạt động của tyrosinase của acid trans-geranic được tách

19


chiết từ cây sả (Cymbopogon citrates) chỉ bằng 1/10 của acid kojic. Duy chỉ
có lipit mạch dài trilinolein là có hiệu quả ức chế tyrosinase tương tự acid
kojic bằng cách tạo phức càng cua với nhân đồng của enzyme [12].

Hình 1.3. Cây và củ bách bộ Stemona cochinchinensis [4].
1.3.2. Cây mít
1.3.2.1. Phân loại
Tên thường gọi: Mít
Tên khoa học: Artocarpus heterophyllus
Chi Artocarpus, họ Moraceae, bộ Rosales, ngành Angiospermae, giới
Plantae [1].
1.3.2.2. Nguồn gốc và sự phân bố
Cây mít có nguồn gốc từ Ấn Độ và được phân bố rộng rãi khắp các tỉnh
trong nước ta [1].
1.3.2.3. Đặc điểm hình thái và tác dụng của cây mít
Thân gỗ lớn, cao đến 20 m. Cành non có long mềm. Lá nguyên hình
trái xoan, rộng, phiến dày, bóng, màu lục đậm, có gân nổi rõ. Hoa đơn tính.
Cụm hoa đực sau khi truyền phấn thì thui đi. Cụm hoa cái thường mọc ngay
trên thân hay trên cành già, gồm nhiều hoa, mỗi gai ở ngoài mặt cụm hoa cái
tương ứng với một hoa cái. Quả phức to, vỏ ngoài nhiều gai nhọn, gồm nhiều
quả thịt mềm, có hạt lớn [1].

21


Hình 1.4. Cây mít Artocarpus heterophyllus [49].
Múi mít thơm, ngon ngọt có thể ăn được. Ngoài ra một số nghiên cứu
còn cho thấy chiết xuất lá mít có khả năng chống oxi hóa, làm chậm sự lão
hóa tế bào, ngoài ra mít cũng được sử dụng trong y học dân gian để ngăn chặn
các bệnh về da, bao gồm cả mụn trứng cá và viêm da… [1, 3]
1.4. Tình hình nghiên cứu về khả năng làm sáng da của các chiết xuất từ
các loài bách bộ và mít trên thế giới và Việt Nam
1.4.1. Tình hình nghiên cứu khả năng làm sáng da của các chiết xuất các
loài bách bộ và mít trên thế giới