TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH
TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY LAN NHẤT ĐIỂM HỒNG
(Dendrobium draconis)

Giảng viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ DUNG

TRẦN HOÀNG NAM

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


TÓM TẮT
Đề Tài : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa
đến quá trình nhân giống in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng.
Giáo viên hướng dẫn : TS.Trần Thị Dung
Đề tài được tiến hành tại Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm nghiên cứu và phát
triển nông nghiệp công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện : tháng 9/09 đến tháng 12/09
Nội dung đề tài thực hiện gồm 4 thí nghiệm:

Kết quả thu được: Sự kết hợp giữa nồng độ BA = 1 mg/l và NAA = 0,5 mg/l
trong môi trường cho kết quả về sự hình thành chồi tối ưu nhất, với thời gian hình
thành chồi ngắn nhất ( 13,22 NSC), số chồi đạt cao nhất ( 3,28 chồi).


Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ từ

cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro. Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định nồng
độ NAA tốt nhất cho quá trình hình thành rễ in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng.
Kết quả thu được: Nồng độ NAA = 1 mg/l bổ sung vào môi trường MS
thích hợp nhất cho sự hình thành rễ của cây lan Nhất Điểm Hồng với số rễ nhiều
nhất (3 rễ), thời gian ra rễ nhanh (17,22 NSC).

iii


MỤC LỤC

Trang tựa .....................................................................................................
Lời cảm ơn ..................................................................................................

i

Tóm tắt ........................................................................................................

ii

Mục lục .......................................................................................................

iv


5

2.1.3 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và trong nước.....................

7

2.1.4 Đặc điểm của cây lan Nhất Điểm Hồng.....................................

10

2.2 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật.......................

11

2.3 Các phương pháp nhân giống in vitro...........................................

12

2.3.1 Nhân giống bằng chồi nách .......................................................

12

2.3.2 Nhân giống bằng chồi đỉnh .......................................................

12

2.3.3 Nhân giống bằng chồi bất định..................................................

13


20

2.4.2.5 Nước dừa ...............................................................................

20

iv


2.4.2.6 Agar .......................................................................................

20

2.4.2.7 Các chất điều hoà sinh trưởng ................................................

21

2.5 Các công trình nghiên cứu về Dendrobium ..................................

22

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................

24

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................

24


3.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA
đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng ................

28

3.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA
đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng ................

29

3.4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến
khả năng hình thành rễ từ cây lan Nhất Điểm Hồng ...........................

30

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................

31

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................

46

PHỤ LỤC

v


NSC :

Ngày sau cấy

ĐC

Đối chứng

:

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của Dendrobium..................

7

Hình 2.2. Hoa lan Nhất Điểm Hồng (Dendrobium draconis)........................

8

Hình 3.1 Cách bố trí cây trong chai nước biển .............................................

26

Hình 4.1 : Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa
đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro ...............


Bảng 3.2: Các nồng độ BA được sử dụng trong thí nghiệm..........................

28

Bảng 3.3: Các nồng độ BA và NAA được sử dụng trong thí nghiệm............

29

Bảng 3.4: Các nồng độ NAA được sử dụng trong thí nghiệm.......................

30

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa
đến khả năng hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro. ..............

31

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng
hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro.....................................

34

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng
hình thành chồi từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro.....................................

37

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng
hình thành rễ từ cây lan Nhất Điểm Hồng in vitro.........................................

trình nhân giống in vitro cây lan Nhất Điểm Hồng ” .

1


1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Xác định môi trường thích hợp cho quá trình nhân giống in vitro cây
lan Nhất Điểm Hồng.

1.2.2 Yêu cầu
- Xác định nồng độ nước dừa đến khả năng hình thành chồi của cây lan Nhất
Điểm Hồng.
- Xác định nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi và
hình thành rễ của cây lan Nhất Điểm Hồng.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium
Dendrobium là loài lan sống trên các cành cây nhưng không cộng sinh, phân
bố nhiều ở Âu Châu và Nam Thái Bình Dương, được tìm thấy nhiều ở Úc Châu,
Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam và dãy núi Himalaya. Dendrobium được trồng
phục vụ cho lan chậu và lan cắt cành. Hiện nay thị trường Dendrobium ngày càng
đa dạng và phong phú do các loại lan lai có nguồn gốc khác nhau. Dendrobium là
loại hoa cắt cành phổ biến ở Thái lan như: Dendrobium Anna, Blue, Bangkok Land,
Big White, Candy, Candy Kiss, Casablanca, Caesar, Channel, Chidchom, Intuwong,
Juliana, Madame Pompadour, Marco Polo Madame Pompadour, Mary Mak,

thường rụng hết lá khi ra hoa như Long tu (Dendrobium primulinum), Ý thảo
(Dendrobium gratio sissimum)
- Nhóm giả hành to ngắn, tận cùng thường có 2-3 lá dai, bền, không rụng.
Phát hoa tập trung ở phần này tạo thành chùm đứng hay thòng như: Thủy tiên
trắng (Dendrobium farmeri), Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum), Vảy cá
(Dendrobium lindleyi)
- Nhóm cá giả hành rất mảnh mai, dài hay ngắn, có lá dọc theo chiều dài của
chúng, dai bền không rụng. Hoa thường cô độc ở nách như Hương duyên
(Dendrobium revolutum)
Việt Nam có hàng trăm loài phong lan, trong đó có Dendrobium là giống
sinh trưởng, phát triển tốt, cho hoa đẹp, có thể sử dụng làm nguồn gen quý cho công
tác lai tạo giống hoa lan mới của nước ta trong thời gian tới. Giống lan Dendrobium
được chia thành nhiều nhóm tùy theo hình dạng và trục phát hoa, nhưng nhìn chung
Dendrobium thuộc dạng đa thân, có nhiều đốt, sống phụ (chỉ bám vào cây làm giá
thể, không ký sinh), và ra hoa từ các đốt trên thân; trong đó có hai nhóm chính:
nhóm Callista và nhóm Dendrobium. Nhóm Callista với chùm hoa rũ xuống
(pendulous) như Den. chrysotoxum, Den. farmeri, Den. thyrsiflorum. v.v...

4


2.1.2. Điều kiện sinh thái
 Nhiệt độ
Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang
hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên
gấp đôi. Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch Câu
Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6 0C trong vài giây thì 9
ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt. Ở 18,50C Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng
mà không ra hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 130C hay thấp hơn.
Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm

Thời kỳ sinh trưởng độ ẩm cần từ 60 đến 70%. Thời kỳ nghỉ cần giảm thích
đáng.

 Ánh sáng
Dendrobium là loài lan ưa sáng (60 - 70%), rất thích hợp với ánh sáng mạnh,
có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90%. Nhờ đó mà chúng phát triển được các
giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể làm cháy
lá. Do đặc tính này nên việc nuôi trồng trong nhà hoặc dùng ánh sáng nhân tạo thực
tế không thuận tiện, dễ dàng.

 Nhu cầu phân bón
Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều
phân bón và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác

nhau.

Còn các

loại

Dendrobium thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng.
Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu
bò khô có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt
từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được
phóng thích qua quá trình tưới nước. Các loại phân vô cơ được dùng thường có
công thức 30-10-10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít. Trong suốt
mùa tăng trưởng, ta bón phân 10-20- 30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng
cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta
thay phân 30-10-10 bằng phân 10-20- 20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa
tàn.

bão. Vì vậy, vấn đề sản xuất, kinh doanh hoa ở miền Bắc chỉ thích hợp với việc
trồng các loại hoa tươi và cây cảnh, đối với hoa lan chủ yếu là khai thác từ rừng
hoang và việc nuôi trồng với số lượng ít để trưng bày thưởng thức, còn việc nuôi
trồng theo quy mô công nghiệp không thích hợp do có mùa bão, dẫn đến giá thành
sản xuất hoa cao, hiệu quả kinh tế kém.
Hiện nay, mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước
ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt, Tp. Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng
50-60 ha trên một doanh nghiệp. Một vài địa phương khác phong lan chỉ mới trồng
7


ở quy mô hộ gia đình trên diện tích từ vài m 2 đến vài nghìn m2, cá biệt mới có vài
hộ trồng từ 1- 2 ha. Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam bước đầu cũng đã có
những thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ được
chuyển giao từ Thái Lan. Một số địa phương khác như Sapa, Phú Yên đã bước đầu
khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhân giống hoàn thiện quy trình sản xuất
phong lan.
Nhìn chung tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh
mẽ
ở các tỉnh phía nam, đăc biệt là ở Đà Lạt và TP Hồ Chí Minh. Và một thực tế còn
tồn tại hiện nay là mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan
từ các nước láng giềng để đáp ứng nhu cầu nội địa. Trong những tháng đầu năm
2007, mặc dù kim ngạch nhập khẩu hoa lan cắt cành đã giảm đáng kể so với những
tháng trước nhưng vẫn ở mức khá cao. Theo số liệu thống kê của tổng cục hải quan,
kim ngạch nhập khẩu phong lan cắt cành qua đường chính ngạch của nước ta trong
tháng 2/2007 là 26,515 nghìn USD, giảm 20,17 % so với tháng 1/2007 nhưng vẫn
tăng 51,76% so với tháng 12/2006. Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của
Việt Nam trong thời gian qua là ở Thái Lan với gần 100% lượng lan cắt cành.

8


2.1.4 Đặc điểm của cây lan Nhất Điểm Hồng
Lan Nhất Điểm Hồng thuộc:
Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Liliopsida

Lớp phụ

: Liliidae

Bộ

: Orchidales

Họ

: Orchidaceae

Giống

: Dendrobium

Tên khoa học : Dendrobium draconis
D. draconis (Nhất Điểm Hồng) là một giống phong lan cao chừng 40 cm có
7-9 đốt với vỏ bọc đầy lông đen. Hoa nở vào mùa xuân, màu trắng trong họng có

có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin
(B1),
Pyridoxin (B6) và Nicotinic acid. Đồng thời cũng trong thời gian này, R.J.
Gautheret đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng một số cây gỗ (cây
liễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu
tiên này không vượt quá 8 tháng. Năm 1939, Gautheret thông báo các kết quả đầu
tiên của ông với Viện Hàn Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy vô hạn các mô của
cà rốt (Daucus carote L.). Sau thế chiến thứ II, lĩnh vực này phát triển đặc biệt
nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông lâm nghiệp được công
bố.

11


2.3 Các phương pháp nhân giống in vitro
2.3.1 Nhân giống bằng chồi nách
Chồi nách nhô lên từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng
phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính. Tùy theo các loại cây riêng
biệt chỉ có một số giới hạn đỉnh sinh trưởng nách lá phát triển, phần lớn bị ức chế
bởi ưu thế ngọn. Khi các mẫu cấy là chồi được cảm ứng giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn
tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay cả ở nách lá bắc. Như thế sẽ dẫn tới một số
lượng lớn chồi con có thể tách ra và cấy chuyền hoặc tăng sinh chồi mẹ hơn nữa
hoặc tạo rễ và sớm hình thành cây con. Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất
hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm, kết quả của sự
phân nhánh sớm này dẫn tới sự phát triển chồi bậc hai, bậc ba…trong sự tăng sinh
cụm chồi. Khi các cụm chồi như vậy phát triển chúng có thể được phân chia thành
những cụm chồi nhỏ hơn hay các chồi được tách ra để hình thành cụm chồi giống
như vậy khi cấy chuyền trong môi trường mới.
Tiến trình phân chia có thể tiếp tục không hạn định. Ví dụ: Các chồi tăng
sinh của vài loại cây đã duy trì tới 10 - 15 năm mà không có biểu hiện bị hủy hoại

bao gồm lá, vẩy, cuống lá( cây tái sinh từ những dãy biểu bì hoặc những lớp tế bào
bên trong) ở Begonia (thu hải đường) và một số cây cảnh khác - tử diệp, trục hạ
diệp ở Conifers (thông tùng) - căn hành ở Gladiolus - các phần của hoa ở Lilium
(Lily), Narcissus (thủy tiên), Chrysanthemum (cúc), các chồi mới có thể phát triển
trực tiếp trên mẫu cấy, bắt đầu từ tế bào nhu mô ở vị trí bên trong biểu bì hay ngay
dưới bề mặt của thân, một số những tế bào này trở thành nhu mô phân sinh và phát
triển thành những tế bào nhỏ, dày đặc theo dạng mô phân sinh, chúng biểu hiện
nguồn gốc từ một tế bào duy nhất. Mặt khác, các chồi mới cũng có thể phát triển
gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy. Chồi nhô lên từ ngoại biên
của callus và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy. Sự hình thành chồi
bất định có thể cho kết quả cao về tốc độ nhân giống nói chung cao hơn tốc độ nhân
giống từ chồi nách. Tuy nhiên, chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây biến dạng. Khi
sử dụng phương pháp này, cây trồng sản xuất phải được đánh giá cẩn thận về tính
biến dị (Harmann và Kester,1983).

2.3.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus
Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan
hay phôi) là phương pháp nhân giống in vitro có khuynh hướng cho giá trị thấp.
13


Điều này do ảnh hưởng của thể bội không hoàn chỉnh và thể đa bội đôi khi đã tập
hợp chung với mô hoặc cây tái sinh được từ đỉnh hay các dạng mô phân sinh. Nuôi
cấy callus và tế bào đơn có tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. Điều
này không có nghĩa là nhân giống in vitro qua trung gian callus không có khả năng
tạo dòng tái sinh đồng nhất. Trong những trường hợp nào đó, có thể phân biệt
những dòng tái sinh biến dạng ở bước đầu tiến trình nhân giống khi phân tách chồi
lấy từ mô sẹo. Đôi khi chồi biến dạng có thể phân biệt bởi biểu hiện hóa thủy tinh
hay trong suốt của chúng mà điều này có thể giảm được ở những bước nhân giống
kế tiếp. Callus đạt được có thể tái sinh cây trồng có kiểu gen đồng nhất cho tới 10 14 năm.

- Vết thương: mẫu cấy có nhiều vết thương sẽ hấp thụ nhiều chất dinh dưỡng
và kích thích sinh trưởng, đồng thời cũng sản xuất nhiều ethylene.

 Khử trùng mẫu cấy:
Trên nguyên tắc, có 4 nguồn gây nhiễm: cây trồng (bên trong và bên ngoài),
môi trường dinh dưỡng (không tiệt trùng hoàn toàn), không khí và người cấy (thao
tác không chính xác). Quan trọng nhất là cây trồng, mẫu cấy phải được khử trùng
tốt trước khi cấy. Trước khi khử trùng, loại bỏ đất và các thành phần chết trên cây,
nên rửa nước đối với các loại rễ củ nằm trong đất, khử trùng bằng cách: Nhúng mẫu
vào cồn 70% trong vài giây, rồi khử trùng bằng NaOCl 1% trong 10-30 phút, sau đó
rửa sạch bằng nước khử trùng (thường là 3 lần) . Bắt đầu cắt mẫu cấy trong tủ cấy
laminar với dụng cụ khử trùng. Nếu mẫu cấy vẫn bị nhiễm sau khi khử trùng,
nguyên nhân là do:
- Nguồn nhiễm bên trong.
- Thao tác không đúng (không rửa tay, không lau sạch bàn với cồn 96%,
không khử trùng dao kéo, dĩa petri, giấy và môi trường dinh dưỡng không được tiệt
trùng hoàn toàn, áo blouse dơ…). Sử dụng mặt nạ, bao tóc, găng tay sẽ ít bị nhiễm
hơn.
- Tủ cấy laminar không hoạt động tốt. Cần được kiểm tra hàng năm. Phin lọc
của tủ cấy phải được thay mới định kỳ.
- Cồn ngâm dụng cụ cấy bị nhiễm, cần được thay mới thường xuyên.
- Ống nghiệm, bình đựng môi trường dinh dưỡng không được lau sạch bên
ngoài. Sau khi khử trùng môi trường dinh dưỡng phải bảo quản trong điều kiện
sạch.
15


- Sàn nhà không được khử trùng. Phải xử lý đèn UV vào ban đêm hoặc thổi
không khí sạch vào phòng.
- Quá nhiều khách đến phòng nuôi cấy làm nhiễm sàn nhà và không khí.


nồng độ agar thấp. Cytokinin cao, nhiệt độ cao, bức xạ ánh sáng yếu, khử trùng
mạnh làm tăng thủy tinh thể.

2.4.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm
một số thành phần cơ bản sau:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
- Các vitamin
- Các amino acid
- Nguồn carbon: một số các loại đường
- Các chất điều hoà sinh trưởng
- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai
tây, bột chuối khô...
- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)
Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự
sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.
Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ
thuộc vào một số yếu tố:
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về
thành phần môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo
mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi
nhân giống…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).

2.4.2.1 Các nguyên tố đa lượng
 Nguồn carbon (C)
Đường sucrose là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên
trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh