1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Luciferase xúc tác phản ứng giữa luciferin, oxy và nước để tạo ra dung
dịch phát quang. Enzym được biết đến với những ứng dụng rất rộng rãi
trong hóa sinh và sinh học phân tử. Như phương pháp phát quang sinh
học sử dụng hệ thống enzym – cơ chất.
Luciferase chiết suất từ tự nhiên chưa đáp ứng được nhu cầu vì vậy
việc tạo Luciferase từ vi khuẩn là hướng đi đầy triển vọng. Do đó chúng
tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tách chiết và tinh sạch enzym luciferase từ vi khuẩn
tái tổ hợp E. Coli MC 1061 (pT 0031)”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu được quy trình tách chiết và tinh sạch luciferase từ vi
khuẩn tái tổ hợp E. Coli MC 1061 và xác định đặc tính làm nền tảng
cho ứng dụng.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Tách tinh sạch thu chế phẩm luciferase
- Xác định một số đặc tính của luciferase
1.4. Ý nghĩa của đề tài
Tách chiết và tinh sạch được enzym luciferase có ý nghĩa trong việc
chế tạo test phát hiện nhanh dựa trên phương pháp phát quang sinh học sử
dụng hệ thống enzym – cơ chất.


2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1. Tổng quan về luciferase

3.1.2. Môi trường sử dụng
- Môi trường LB chứa kháng sinh
- Môi trường Mac Conkey
3.1.3. Dung dịch và đệm sử dụng
Bảng 3.1.Danh sách các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
1
2
3
4
5

Dung dịch Folin gốc 1N
Dung dịch A
Dung dịch B1
Dung dịch B2
Dung dịch C

10
11
12
13
14

6

15

7

Đệm điện di protein

cho luciferase

3.1.4. Thiết bị nghiên cứu
Box cấy an toàn cấp 2 Model: LCB 1801V (Daihan - Hàn Quốc),
Máy đo cường độ sáng cầm tay Lumitester PD-20 (Kikoman - Nhật Bản),
Máy đo quang ABOATOX (Phần Lan), Tủ ấm nuôi cấy vi sinh IC 402
(YAMOTO - Nhật Bản), Máy nuôi lắc ổn nhiệt KS 4000 (KIA - Đức), Hệ


4
thống máy điện di protein và phân tích ảnh (Biorad - Mỹ), Cân phân tích
BL 150S (Thụy Sỹ), Nồi hấp khử trùng HV-110 (HIRAYAMA - Nhật
Bản), Cột sắc ký His-trap columns (Armesham), Cột sắc ký XK 9/16
(Armesham)…
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
3.2.1. Địa điểm: Viện Hóa Học - Môi Trường Quân Sự
3.2.2. Thời gian: Từ ngày 18/03/2013 - / /2013
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Tăng sinh chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031)
3.3.1.1. Hoạt hoá chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031)
3.3.1.2. Đánh giá tính ổn định và xác định khả năng phát triển của chủng
vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) trên các môi trường khác nhau.
3.3.1.3. Khả năng tổng hợp luciferase trên các môi trường khác nhau
3.3.2. Tách và tinh sạch luciferase từ E.coli MC 1061 (pT 0031)
3.3.2.1. Tách luciferase từ sinh khối chủng vi khuẩn E. coli MC 1061
(pT 0031)
3.3.2.2. Tinh sạch luciferase bằng sắc ký lọc gel kết hợp sắc ký trao đổi
ion
3.3.2.3. Tinh sạch luciferase bằng sắc ký trao đổi ion kết hợp sắc ký ái lực
3.3.3. Ảnh hưởng một số yếu tố đến hoạt độ luciferase

Hoạt độ theo thể tích (RLU/ml) = (Es – E0)xdf
0,1ml
Hoạt độ riêng (RLU/mg) = RLU/mlx1/C
Trong đó:
+ df: tỷ lệ pha loãng của mẫu
+ C: nồng độ protein trong mẫu
3.4.4.2. Đánh giá độ sạch của luciferase
Độ sạch của enzym qua các công đoạn tinh sạch được đánh giá
bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
3.4.4.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry


6
Protein tổng số thu được qua các bước của quá trình tách và tinh
sạch enzym được xác định theo phương pháp Lowry sử dụng tinh thể
Albumin huyết thanh bò (BSA) để xây dựng đường chuẩn.
3.4.5. Xử lý số liệu thực nghiệm
Các số liệu thu được được xử lý bằng các hàm toán học và phần mềm
chuyên dụng.


7

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sinh trưởng của vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031)
4.1.1. Nuôi cấy
Chủng vi khuẩn E. coli MC 1061 (pT 0031) được hoạt hóa và nuôi
cấy tăng sinh trên môi trường LB lỏng, tiếp tục cấy chuyển sang môi
trường LB đặc.
Tiến hành xác định một số đặc điểm sinh hóa và hình thái chủng vi

0031) bng phng phỏp kt ta phõn on bng mui (NH 4)2SO4 kt
hp vi phng phỏp thm tớch thu nhn luciferase t dch sinh khi
tỏch luciferase.
4.2.2. Tinh sch luciferase bng sc ký lc gel kt hp sc ký trao i
ion
Sau khi thu c dch enzym qua cỏc bc ó trỡnh by trờn, tin
hnh chy sc ký lc gel v sc ký trao i ion tinh sch luciferase.
4.2.3. Tinh sch luciferase bng sc ký trao i ion kt hp sc ký ỏi
lc
Sn phm ca quỏ trỡnh thm tớch s dng chy sc ký trao i
ion v sc ký ỏi lc vi gel Chelating Sepharose.
4.3. Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố đến hoạt độ và độ bền
của luciferase tái tổ hợp
4.3.1. nh hng ca nng c cht
4.3.2. Nhit ti u cho phn ng
4.3.3. pH phn ng ti u
4.3.4. bn nhit
4.3.5. nh hng ca mt s cht hot ng b mt
4.3.6. nh hng ca dung mụi hu c
4.3.7. nh hng ca mt s ion kim loi n hot tớnh luciferase


9

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
5.2. Đề nghị


10