Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ABA

Abcisis acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

ATP

Adenozin triphosphata

ATP-ase

Enzym phân giải ATP

cDNA

Sợi DNA bổ sung ñược tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym
phiên mã ngược (Complementary DNA)

AS
A. tumefaciens
BAP

MES
MS
NAA
nptII
OD
P5CS
P5CDH
P5CR
PDH

deoxynucleoside triphosphate
Ethylene diamine tetraacetic acid
Escherichia coli
Gibberellic acid
Germination medium – môi trường nảy mầm hạt
β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)
Indoleacetic acid
Indole-3-butyric acid
Isopropylthio-beta-D-galactoside
kilo base
Luria Bertani
Least significant difference = ñộ lệch chuẩn
Late embryogenesis abundant
2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid
Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
α-Naphthaleneacetic acid
Neomycin phosphotransferase gene
Optical density
pyroline-5-carboxylate synthetase


TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

v/p
X-gluc
X-gal

vòng/phút
5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

YEP

Yeast extract peptone

1

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỤC LỤC
MỞ ðẦU................................................................................................................ 0

.............................................................................................................................. 27
1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ðIỀU KHIỂN HOẠT ðỘNG CỦA GEN
DƯỚI ðIỀU KIỆN KHÔ HẠN
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

29
29


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học
30
1.4.3. Promoter rd29A
32
1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ðẬU
TƯƠNG................................................................................................................ 32
1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây ñậu tương bằng phương pháp ñột biến thực
nghiệm .................................................................................................................. 32
1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng ñậu tương chịu hạn ..... 33
1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen ñể nâng cao khả năng chịu hạn của cây ñậu tương
.............................................................................................................................. 35
1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .................................................. 35
1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây
ñậu tương chịu hạn................................................................................................ 37
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 38
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ............................................................. 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 39

3.1.2. Kết quả ñánh giá khả năng chịu hạn của các giống ñậu tương nghiên cứu ... 55
3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ðỘT BIẾN ðIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC ..... 58
3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS ......................................................................... 58
3.2.2. Kết quả khuếch ñại, tách dòng và xác ñịnh trình tự gen P5CS ..................... 58
3.2.3. Tạo ñột biến ñiểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây ñậu tương..... 69
3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ðỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG
KHÔ HẠN rd29A ................................................................................................. 72
3.3.1. Phân lập promoter rd29A............................................................................. 72
3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A ............................................................... 73
3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A ........................................ 75
3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS.......................... 75
3.4. KẾT QUẢ ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM .......................................... 78
3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM.......................... 78
3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM ....................... 81
3.4.3. ðánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen ................... 82
3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ðẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN.................................. 84
3.5.1. Kết quả tái sinh tạo ña chồi ở giống ñậu tương DT84 .................................. 84
3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt .................................................................. 84
3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP ñến khả năng tạo ña chồi từ lá mầm hạt chín ........... 87
3.5.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA3 tới khả năng kéo dài chồi ................... 89
3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA ñến hiệu quả tạo rễ ................................................... 91
3.5.1.5. Xác ñịnh giá thể thích hợp cho ra cây in vitro.......................................... 93
3.5.2. Kết quả bước ñầu chuyển gen GUS vào cây ñậu tương DT84...................... 94
3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào ñậu tương .................................. 96
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 102

2



Bảng 1.5

Cây chuyển gen mang gen P5CS

29

Bảng 2.1

Thành phần dung dịch ñệm tách chiết

45

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng PCR

46

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng OE -PCR

46

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng

47

50

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101

51

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM

52

Bảng 3.1

Các giống ñậu tương ñịa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La

53

Bảng 3.2

Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống ñậu

57

tương nghiên cứu
Bảng 3.3

Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi ñặc hiệu gen P5CS

58

Bảng 3.4


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Bảng 3.8

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen ñến khả năng

85

nảy mầm ñậu tương DT84
Bảng 3.9

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo ñến khả năng

86

nảy mầm ñậu tương DT84
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo ña chồi

88

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của GA3 ñến khả năng kéo dài chồi

90

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA ñến khả năng tạo rễ

92

Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn


Hình 2.1

Sơ ñồ thí nghiệm tái sinh cây ñậu tương

42

Hình 2.2 Sơ ñồ chuyển gen vào cây ñậu tương qua nách lá mầm

43

Hình 2.3

Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A

49

Hình 3.1

ðồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương ñối của một số giống

56

ñậu tương ñịa phương và giống DT84
Hình 3.2

Sản phẩm tách RNA

59



67

ñậu tương
Hình 3.8

Mức ñộ tương ñồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của

68

các giống ñậu tương.
Hình 3.9

Sơ ñồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức ñộ tương ñồng

68

của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống ñậu
Hình 3.10 ðiện di sản phẩm PCR

70

Hình 3.11 Phản ứng nối hai ñoạn gen theo phương pháp OE-PCR với

70

cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS
Hình 3.12 ðiện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới

71


75

Hình 3.19 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc lá

76

Hình 3.20 Biểu hiện gen GUS trên cây chuyển gen

77

Hình 2.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen
mang promoter rd29A dưới ñiều kiện hạn nhân tạo

78

Hình 3.22 Các sản phẩm cắt ñồng thời bằng enzym BamHI và SacI

79

Hình 3.23 ðiện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT

80

rd29A::/P5CSM
Hình 3.24 Kết quả colny PCR chọn dòng trong A. tumefaciens

81

Hình 3.25 Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A


94

Hình 3.33 Biểu hiện của gen GUS

95

Hình 3.34 Sơ ñồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây ñậu tương qua nách lá

96

mầm
Hình 3.35 Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen

97

Hình 3.36 Kiểm tra cây ñậu tương T0 chuyển gen bằng PCR

98

Hình 3.37 Cây ñậu tương T0 chuyển gen

98

6

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

năng chịu hạn kém. Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống ñậu tương có khả năng sống
trong ñiều kiện bất lợi về nước ñang là hướng nghiên cứu rất ñược quan tâm của các
nhà chọn giống. Ở Việt Nam, nhiều giống ñậu tương có khả năng chống chịu hạn ñã
ñược chọn tạo thành công và ñang ñược triển khai canh tác ở một số ñịa phương. Có
thể kể ñến các giống DT96, DT2008 do các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông
nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo. Dòng ñậu tương ML48,
ML61 do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo có khả năng chịu hạn cao [15]. Tuy nhiên
các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có
quần thể ñủ lớn và không ổn ñịnh. Những nhược ñiểm của phương pháp truyền thống
có thể ñược khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học. Kỹ
thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñã ñược
các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng và ñạt ñược những kết quả rất có triển vọng
trên cây ñậu tương. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện
nghiên cứu lúa ðồng bằng sông Cửu Long ñã thành công trong việc tạo ra các giống
ñậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh [9]. Tuy nhiên, cho ñến nay công trình
nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây ñậu tương vẫn chưa ñược quan tâm ñúng
mức. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành ñề tài luận án tiến sĩ là: “Phân
lập, tạo ñột biến ñiểm ở gen P5CS liên quan ñến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây ñậu tương Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của giống ñịa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt
và giống ñậu tương DT84. Tạo ñược ñột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi
prolin.
2.2. Tạo ñược vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan ñến tính chịu hạn ở cây ñậu


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ðẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L. MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ
VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây ñậu tương là một trong những loài cây trồng ñược biết ñến từ rất sớm.
Các bằng chứng về lịch sử, ñịa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng ñậu tương có nguồn
gốc từ Trung Quốc. Cây ñậu tương ñược thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở
Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên. Cây ñậu tương ñược
truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, du nhập vào nhiều nước Châu
Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn ðộ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau ñó.
Cây ñậu tương ñược trồng ở Châu Âu vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ thế kỷ XVIII .
Cây ñậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ ñậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm
Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill. Tuy nhiên
theo Hymowit và Newell (1984) thì ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja. Chi
Glycine ñược chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong ñó có loài
ñậu tương trồng Glycine max L. Merrill (Ngô Thế Dân và ñtg, 1999) [6], (Trần Văn
ðiền, 2007) [8].
1.1.2. ðặc ñiểm sinh học
ðậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn
non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây
cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân
có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím ñỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo
giống.
Cây ñậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá ñơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3
thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của lá thay

hoàng trong các cây họ ñậu vì giá trị rất toàn diện của nó (Trần Văn ðiền, 2007) [8].
Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong ñậu tương cao hơn trong cá, thịt và
cao gấp 2 lần các loại ñậu ñỗ khác, protein trong hạt ñậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ
thuộc vào giống và ñiều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần
tạo cholesteron. ðậu tương còn ñược xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng,
lipit ñậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm
khoảng 18%. Trong hạt ñậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, ñáng kể là các vitamin
5

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và
các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa.
Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, ñậu tương là cây ñứng ñầu về cung
cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu ñậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu ñậu tương
khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt ñộ ngưng tụ -15 ñến -180C và từ dầu người ta
có thể làm nến, xà phòng, nilon,…ðậu tương còn là nguyên liệu của nhiều ngành công
nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất ñốt
lỏng,…
Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây ñậu tương cả khi tươi và khô ñều có thể dùng
làm thức ăn cho gia súc. ðậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo ñất trồng, một ha
ñậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ ñể lại trong ñất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá
với hàm lượng ñạm cao có thể dùng ñể bón cho ñất thay cho phân hữu cơ. Việc luân
canh ñậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo ñất trồng hữu hiệu.
1.1.4. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Trên thế giới: Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây ñậu tương nên ñây ñược
xem là một trong những loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ ñứng

Việt Nam

Năm 2006
15,13
22,05
9,30
8,33
0,58
0,14
30,19
0,19

Diện tích gieo trồng (triệu ha)*
Năm 2007
Năm 2008
15,98
16,39
20,57
21,06
8,75
9,13
8,88
9,52
0,46
0,59
0,13
0,12
25,96
30,22
0,19


40,54

47,48

46,24

30,99

Brazil

52,46

57,86

59,24

56,96

Trung Quốc

15,50

12,73

15.55

14,50

Ấn ðộ


87,00

72,86

80,75

91,42

Việt Nam

0,26

0,28

0,27

0,21

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

[107].
Trong bốn năm trở lại ñây năng suất cao nhất ñạt ñược vào năm 2007 là 24,3 tạ/ha
và thấp nhất là năm 2009 là 22,4 tạ/ha. Trong số các quốc gia trồng cây ñậu tương hàng
ñầu thế giới chỉ duy nhất Hoa Kỳ vẫn duy trì ñược năng suất cây ñậu tương thậm chí có
7

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn



28,22
28,13
28,13
14,54
17,03
12,35
10,40
12,91
13,12
15,93
15,99
28,07
26,72
14,70
14,03

Năm 2009
18,48
26,18
16,48
10,64
13,48
16,33
29,58
14,61

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

[107].
Có thể kể ñến nhiều nguyên nhân làm cho năng suất và sản lượng ñậu tương

2007

2008

2009

Hà Nội

2,1

2,1

43,9

11,8

Hà Tây

47,7

51,7

Vĩnh Phúc

10,2

6,4

10,5


2,7

Hưng Yên

8,4

7,9

6,9

5,8

Thái Bình

12,4

13,8

14,0

16,8

Hà Nam

11,1

12,0

13,0


4,1

Bắc Kạn

2,9

2,8

3,6

4,0

Tuyên Quang

3,2

4,1

4,5

3,9

Lào Cai

4,7

5,4

4,9


3,0

ðiện Biên

10,7

11,2

13,0

11,7

Lai Châu

1,7

1,8

2,1

2,4

Sơn La

11,1

11,5

10,0


10,4

ðắk Nông

26,7

30,3

30,5

33,2

ðồng Nai

3,2

3,2

2,1

1,5

ðồng Tháp

14,0

16,6

13,7


Kết hợp với những số liệu thống kê cụ thể về sản lượng ñậu tương ở các quốc
gia trên thế giới và ñánh giá tình hình sản xuất ñậu tương tại Việt Nam trong vòng 4
năm trở lại ñây có thể khẳng ñịnh rằng, vấn ñề nâng cao khả năng kháng hạn trở nên
cấp thiết ñối với cây ñậu tương. Thêm vào ñó những nghiên cứu này hoàn toàn mới
ñối với tình hình nghiên cứu cây ñậu tương tại Việt Nam và phù hợp với xu thế chung
trên thế giới.
1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ðẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ðẬU
TƯƠNG
Khi gặp các ñiều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng ñể có thể
thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá ña dạng nhưng có thể chia
thành ba cơ chế chủ ñạo bao gồm: cơ chế trốn thoát ñiều kiện hạn (drought escape),
cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).
Cơ chế trốn thoát ñiều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình
trong giai ñoạn ñược cung cấp ñủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống ñậu tương
ngắn ngày ñược trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này
ñể thích ứng với các ñiều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt
ñầu nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này
có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước
xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. ðối với cơ chế tránh hạn thì các giống ñậu tương sẽ có
các cơ chế ñể duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai ñoạn hạn thông qua việc
tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận
khác nhau của cây. Ở các giống ñậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có
thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao ñổi chất có
10

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


11

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

ñược chia thành VE ñến VN, trong giai ñoạn VN ñỉnh sinh trưởng xuất hiện và các
giai ñoạn VN ñược ñánh số phụ thuộc số lượng lá bánh tẻ xuất hiện. Giai ñoạn R ñược
chia thành các giai ñoạn từ R1 ñến R8. Trong hai giai ñoạn ñầu R1 và R2 hình thành
hoa, giai ñoạn R3 và R4 là sự hình thành quả ñậu tương, các giai ñoạn chín và làm
chắc hạt là từ R5 tới R8. Ở cây ñậu tương, khi hạn hán xảy ra ở các giai ñoạn sớm hay
muộn của giai ñoạn sinh trưởng sinh sản làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, ñặc biệt là
hệ thống rễ ở các lớp ñất sâu. Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi
hạn hán xảy ra ở giai ñoạn R4 và R5 (Hoogenboom và ñtg, 1987) [43]. Trong một
nghiên cứu khác cho thấy cây ñậu tương khi bị xử lý hạn ở giai ñoạn trước khi ra hoa
sẽ cho năng suất hạn cao những cây ñậu tương bị xử lý hạn ở giai ñoạn sau khi nở hoa,
ñiều này ñược giải thích là do chúng ñã phát triển bộ rễ ñầy ñủ ñể thích ứng với ñiều
kiện hạn trước khi nở hoa (Hirasawa và ñtg, 1994) [39]. Các kết quả này cho thấy nếu
khi cây ñậu tương phát triển bộ rễ lớn ở những giai ñoạn sớm của quá trình sinh trưởng
sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các ñiều kiện hạn.
Các kết quả từ các nghiên cứu ñược trình bày trên ñây cho thấy những tính
trạng bộ rễ có thể sử dụng ñể cải thiện tính chịu hạn ở cây ñậu tương bằng các phương
pháp nhân giống thông thường. Tuy nhiên, các phương pháp ño ñạc các tính trạng liên
quan ñến bộ rễ thường rất khó thực hiện. Thay vào ñó các phương pháp phân tử sẽ là
công cụ hỗ trợ cho các phương pháp truyền thống ñể nghiên cứu các tính trạng về rễ.
Quá trình chọn lọc các gen liên quan ñến các tính trạng về rễ bao gồm các nghiên cứu
sàng lọc gen từ các cơ sở dữ liệu, thiết kế mồi ñể nhân bản gen, xác ñịnh sự ña dạng,
phát triển phương pháp phân tích hệ gen, xác ñịnh quần thể nghiên cứu. Phương pháp
này ñã thành công trong việc xác ñịnh nhiều gen quý quy ñịnh các tính trạng rễ ở lúa

có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới ñiều kiện hạn ở giai ñoạn sinh
trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất
hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong
những chỉ tiêu ñể sàng lọc các dòng cây ñậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn
trong ñiều kiện khô hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng ñậu tương dựa
vào chỉ tiêu này, 8 dòng ñậu tương có khả năng cố ñịnh nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt
hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng ñậu tương này, Sinclair và ñtg (2007) [86] tìm ra
rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên
cứu. Giống ñậu tương Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố ñịnh nitơ cao, ñã
ñược dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai ñể tạo ra giống ñậu tương có năng suất cao
ở các ñiều kiện hạn. Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt ñược dùng ñể
cải thiện khả năng cố ñịnh nitơ và năng suất trong các ñiều kiện ngập úng (Sinclair và
13

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

ñtg, 2007) [86]. Cho ñến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích ñược liệu khả
năng cố ñịnh nitơ trong ñiều kiện hạn có ñược ñiều hòa ở mức ñộ cơ thể của cây ñậu
tương hay không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta ñã biết
rằng, tín hiệu ñiều hòa quá trình cố ñịnh nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen
feedback mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá. King và Purcell (2005)
[56] ñề xuất giả thiết là sự kết hợp ure và axit aspartic ở nốt sần và quá trình vận
chuyển một số các axit amin từ lá có thể tham gia vào cơ chế ức chế phản hồi ở cây
ñậu tương. Gần ñây một nghiên cứu trên hệ thống rễ phân tách ở ñiều kiện hạn cho
thấy hoạt tính cố ñịnh nitơ ñược ñiều khiển ở mức ñộ khu trú (local) hơn là ở mức ñộ
tín hiệu nitơ hệ thống (Marino và ñtg, 2007) [64]. Nhiều nghiên cứu cũng ñang ñược
thực hiện theo hướng này ñể hiểu hơn bản chất phân tử các nhân tố hạn chế và ñiều

Khi so sánh các loài cây họ ñậu khác với cây ñậu tương cho thấy, cây ñậu xanh, ñậu
ñen và ñậu ñũa có khả năng ñiều khiển sự ñóng mở khí khổng tốt hơn khi cây bị mất
nước. Các nghiên cứu khác cũng ñã chứng minh rất rõ ràng rằng cường ñộ thoát hơi
nước của khí khổng giảm tỉ lệ thuận với sự mất nước ở cây ñậu tương (Liu và ñtg,
2005) [62]. Khả năng ñiều khiển cường ñộ thoát hơi nước của khí khổng dưới ñiều
kiện hạn là một ñặc tính sinh lý tốt ñể phát hiện các giống ñậu tương chịu hạn do các
phương pháp ño ñạc chính xác ñã ñược phát triển. Tuy nhiên, khả năng di truyền tính
trạng này cũng là một yếu tố rất quan trọng cần ñược quan tâm.
1.2.2.2. Cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì
ðặc tính sinh lý thứ hai của lá cũng có thể ñược sử dụng ñể ñánh giá và xác
ñịnh khả năng chịu hạn và khả năng sinh trưởng của cây trồng trong ñiều kiện hạn ñó
là cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì của lá (Epidermal conductance). Cường ñộ
thoát hơi nước tổng số của lá ñược tính bằng tổng của cường ñộ thoát hơi nước của khí
khổng và của mặt biểu bì. Khi khí khổng mở, quá trình thoát hơi nước của biểu bì
thường không ñược tính ñến khi tính toán cường ñộ thoát hơi nước tổng số của lá. Tuy
nhiên, khi lá bị thiếu nước hay bị bóng tối, trong các ñiều kiện này thì khí khổng
thường ñóng, thì hệ thống thoát hơi nước ở bề mặt biểu bì có thể vượt qua cả cường ñộ
thoát hơi nước của khí khổng. Trong những ñiều kiện thiếu nước nghiêm trọng khi khí
khổng ñóng hoàn toàn, cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì ñược dùng ñể xác ñịnh
lượng nước mất mát của mô lá. Nhiều loại thực vật sống trong môi trường khô có
cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì rất thấp (Riederer và ñtg, 2001) [77], và những
loài cây trồng có cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì thấp thường duy trì khả năng
sống tốt và dài hơn trong những ñiều kiện khô hạn (Jovanovi và ñtg, 1996) [52].
Nghiên cứu trên 74 giống ñậu tương thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau cho thấy
sự khác nhau ñáng kể về cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì ở các giống này và có
quan hệ chặt chẽ với môi trường mà các giống nghiên cứu sinh sống. ðiều ñang quan
15

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


giảm hiện tượng nhiễm bệnh gây ra bởi virus khảm ñậu tương. Tuy nhiên, mật ñộ lông
tơ ñược ñiều khiển bởi hai allen là Pd1 và Pd2, tăng lên sẽ tạo ra những hiệu ứng có lợi
16

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn