I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM

DNG TH HUYN

Tờn ti:

NGHIÊN CứU CáC YếU Tố ảNH HƯởNG ĐếN QUá TRìNH
THU NHậN CHế PHẩM INVERTASE Từ NấM MEN BIA

KHóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC

H o to

: Chớnh quy

Chuyờn ngnh

: Cụng ngh Thc phm

Lp

: K42 - CNTP

Khoa

: CNSH - CNTP

Khúa hc

: 2010-2014

Thái nguyên, ngày 06 tháng 06 năm 2014
Sinh viên thực hiện đề tài

Dương Thị Huyền


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số enzyme quan trọng trong nấm men ..................................... 15
Bảng 4.1. Kết quả hoạt tình enzyme thu được theo thiết kế Box- Behnken
(BBD), 3 cấp độ, 4 nhân tố , 3 điểm trung tâm, 27 thí nghiệm ............ 34
Bảng 4.2. Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình hoạt tính enzyme........... 35
Bảng 4.3. Bảng điều kiện của các nhân tố để thu được hoạt tính enzyme cao
nhất ....................................................................................................... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo mặt cắt của vi khuẩn gram âm và gram dương có chứa
periplasmic ................................................................................................ 5
Hình 2.2. Cấu tạo tế bào nấm men ................................................................... 8
Hình 4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men và dung môi trong quá trình tự phân
đến hoạt tính enzyme .............................................................................. 29
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tự phân đến hoạt tính enzyme ................. 30
Hình 4.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu của mẫu nấm men tự phân đến hoạt tính
enzyme .................................................................................................... 31
Hình 4.4. Ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hoạt tính chế phẩm enzyme
thu nhận từ nấm men bia ......................................................................... 33
Hình 4.5. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của nhiệt độ và tỷ lệ nấm men/ dung môi
đến hoạt tính enzyme invertase thu được trong dịch tự phân ................. 39
Hình 4.6. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hoạt tính
enzyme invertase thu được trong dịch tự phân ....................................... 39

1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu .........................................................................................2
1.2.1. Mục đích ........................................................................................................2
1.2.1. Yêu cầu ..........................................................................................................2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .........................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ...........................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...........................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................3
2.1. Khái quát về enzyme ........................................................................................3
2.1.1. Khái niệm ......................................................................................................3
2.1.2. Các đơn vị hoạt độ enzyme ...........................................................................3
2.1.3. Khu trú của enzyme .......................................................................................4
2.1.4. Nguồn nguyên liệu thu enzyme .....................................................................5
2.2. Giới thiệu chung về nấm men ..........................................................................6
2.2.1. Thành phần hóa học, hình dạng và kích thước nấm men ..............................6
2.2.2. Cấu tạo tế bào nấm men ................................................................................7
2.2.3. Nguồn thức ăn chủ yếu cho nấm men .........................................................11
2.2.4. Sự hấp phụ chất dinh dưỡng của tế bào nấm men. ......................................11
2.3. Nấm men trong công nghệ sản xuất bia .........................................................12
2.3.1. Nấm men chìm và nấm men nổi. .................................................................12
2.3.2. Quá trình lên men đường tạo rượu ethylic và CO2 ......................................13
2.3.3. Các hướng tận dụng nấm men bia. ..............................................................14
2.3.4. Các enzyme thủy phân glucid đơn giản chính trong tế bào nấm men ........15
2.4. Khái quát về enzyme invertase .......................................................................15
2.4.1. Enzyme invertase.........................................................................................15
2.4.2. Qúa trình chuyển hóa đường sucrose thành đường nghịch đảo ..................16
2.4.3. Invertase trong tế bào nấm men ..................................................................17
2.4.4. Thu nhận chế phẩm enzyme invertase thô từ nấm men bằng phương pháp
tự phân. ..................................................................................................................18
2.4.5. Ứng dụng của invertase trong công nghệ thực phẩm ..................................19

5.1 Kết luận ...........................................................................................................42
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm men là một nhóm vi sinh vật đơn bào được con người sử dụng từ
hàng nghìn năm nay để sản xuất đồ uống có cồn (rượu, bia,…), bánh mì và
nhiều ứng dụng khác. Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào có chứa hàm lượng
protein cao, nhiều vitamin, và các acid amin không thay thế…
Trong công nghệ sản xuất bia, nấm men sau mỗi mẻ lên men sẽ tăng
lên về sinh khối một cách đáng kể, người ta chỉ thu hồi và sử dụng một
phần men để tiếp cho mẻ sau, phần còn lại thường ở dạng lỏng hoặc sệt sẽ
được thải ra ngoài môi trường.
Lượng nấm men thải ra ngoài môi trường này có chứa một lượng lớn tế bào
nấm men, khi phân hủy sẽ gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc thu hồi và
tận dụng lượng nấm men này không những có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế mà còn
giải quyết được vấn đề môi trường, một vấn đề mang tính chất bền vững.
Hiện nay, nấm men bia thường được sử dụng để sản xuất bột chiết nấm
men, dịch chiết nấm men, hoặc làm thức ăn gia súc…Sản xuất chế phẩm
invertase từ men bia là một hướng nghiên cứu mới tại Việt Nam [5].
Nấm men bia thuộc loài Saccharomyces carlsbergensis có hoạt tính
enzyme invertase. Enzyme này thường tập trung chủ yếu trong lớp không
gian chu chất của tế bào nấm men, khoảng không gian giữa thành tế bào và
màng nguyên sinh chất [22]. Nấm men thu được sau quá trình lên men bia có
đặc điểm là rất dễ bị tự phân. Lúc này vách tế bào không còn khả năng tự bảo

1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Thực hiện đề tài giúp sinh viên bổ sung kiến thức thực tiễn quan trọng
cho lý thuyết đã học, có thêm kinh nghiệm và tiếp cận với công tác nghiên
cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả thu được của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để có
thể tối ưu hóa các điều kiện thu nhận chế phẩm invertase từ nấm men bia
cũng như các chủng nấm men khác. Từ đó xây dựng quy trình công nghệ với
hiệu suất thu hồi enzyme hiệu quả nhất.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về enzyme
2.1.1. Khái niệm
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước
và trong dung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến
1.000.000 dalton nên không qua được màng bán thấm. [8]
Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học.
Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các
phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 - 1011 lần so
với phản ứng không có chất xúc tác.
Enzyme có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hóa
được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự
tác dụng có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Enzyme
có tính đặc hiệu cao nên không tạo ra những sản phẩm phụ.
Enzyme tác dụng trong điều kiện “êm dịu” . Enzyme thường tác dụng
thích hợp ở nhiệt độ 30 - 50oC, pH trung tính và ở áp suất thường, không cần

Là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt động sau
một phút.
2.1.3. Khu trú của enzyme
Dựa vào vị trí khu trú của enzyme trong tế bào, người ta chia làm ba
nhóm chính [8]:
Enzyme ngoại bào: enzyme được sinh tổng hợp ra ở trong tế bào rồi sau
đó mới được tiết ra ngoài môi trường trong quá trình nuôi cấy chìm. Đó là
trường hợp các enzyme hydrolase.


5

Enzyme nội bào: enzyme được tổng hợp và sử dụng ở bên trong tế bào
Các enzyme periplasmic (là những enzyme nằm ở xoang ngoài màng
sinh chất nhưng trong màng tế bào).

(Nguồn: Lecture 3- cell structure and Function)[29]
Hình 2.1. Cấu tạo mặt cắt của vi khuẩn gram âm và gram dương có chứa
periplasmic
2.1.4. Nguồn nguyên liệu thu enzyme
Enzyme là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng
hợp hóa học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật,
thực vật hoặc vi sinh vật [8].
Enzyme động vật
Một số mô động vật chứa nhiều enzyme: tụy tạng (amylase, maltase,
lipase, cholesterol esterase, pectinase, nuclease, trypsin,…), dạ dày (pepsin A,
B,…), ruột (kinase, lactase, maltase, nuclease, phosphatse…), gan, tuyến
nước bọt (amylase, kalicrein…), huyết thanh,…
Enzyme thực vật
Từ thực vật có thể thu được một số enzyme thủy phân như: papain từ nhựa

Chúng là các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng sống trong cả điều kiện hiếu
khí và yếm khí.
Tế bào nấm men có chứa 80% là nước. Bởi vậy, trong nấm men bia ép tỉ
lệ giữa trọng lượng ướt và trọng lượng khô là 4:1. Nguyên tố chủ yếu là
cacbon chiếm < 50% chất khô. Các nguyên tố chính khác như oxy (30 - 35%),
nitơ (75%), hydro (5%), và photpho (1%). Hàm lượng chất khoáng tổng số
khoảng 5 - 10% chất khô của tế bào. Trong tế bào còn bao gồm rất nhiều
thành phần khác như: nhôm, sắt, chì, natri, lưu huỳnh, magie…[2]


7

Các nhóm thành phần chính gồm các chất cao phân tử, đó là các protein (40
đến 45% chất khô), cacbonhydrat (30 - 35%), axit nucleic (6 - 8%) và lipit (4 - 5%).
Thành phần chính xác của các nhóm chất cao phân tử trong mỗi chủng
nấm men khác nhau do điều kiện nuôi cấy, pha phát triển.
Nấm men có nhiều hình dáng khác nhau: hình cầu, hình trứng hoặc hình
ovan. Sự khác nhau về hình dáng cho phép phân biệt và phân loại nấm men.
Kích thước tế bào nấm men cũng rất khác nhau thường là (2,5 - 4,5µm) ×
(10,5 - 20µm), thể tích tế bào chiếm khoảng 50 - 500µm3. Môi trường sống
cũng ảnh hưởng rất lớn đến hình dáng và kích thước tế bào. Vì vậy, khi xác
định giống, loài cũng như hình dáng và kích thước nấm men người ta phải
nuôi cấy trên một môi trường ổn định, ở nhiệt độ từ 28 - 30oC. Ngoài ra, kích
thước nấm men còn phụ thuộc vào tuổi hay thời kì phát triển của tế bào, càng
trẻ tế bào có kích thước càng bé so với các tế bào thế hệ.
2.2.2. Cấu tạo tế bào nấm men
Các tế bào nấm men có cấu tạo tương đối phức tạp, các tế bào nấm men
khác nhau thì có cấu tạo và thành phần hóa học khác nhau.
Nhìn chung nấm men đều được cấu tạo gồm: thành tế bào, không gian
chu chất, màng nguyên sinh chất (màng tế bào chất), tế bào chất (nguyên sinh

vật này tiết ra các enzyme có khả năng phân hủy tế bào).
Không gian chu chất tế bào
Đây là khoảng không gian giữa thành tế bào và màng nguyên sinh chất.
Mặc dù đó không phải là cơ quan cụ thể, nhưng mọi chất dinh dưỡng đi vào
hay các sản phẩm trao đổi chất đi ra khỏi tế bào đều phải đi qua. Ở đây có
chứa một số enzyme như invertase, phosphatase, melibiase và nhiều các
protein bao bọc nữa. Đây là các sản phẩm ngoại bào, chúng đi ra ngoài màng
nguyên sinh chất nhưng bị giữ lại bởi kích thước quá lớn không qua được


9

thành tế bào. Các enzyme ở đây được sử dụng để thủy phân các chất dinh
dưỡng không đồng hóa được tạo ra lợi thế cạnh tranh với các sinh vật tiết ra
các enzyme ngoại bào. Hàm lượng ptotein trong khoảng không gian này đủ để
tạo nên chất lưu dạng gel. Như vậy, khoảng không chu chất cũng có chức
năng làm lớp bảo vệ giữa thành tế bào và màng nguyên sinh chất [2].
Màng nguyên sinh chất (màng tế bào chất)
Màng nguyên sinh chất bao quanh tế bào chất và là lớp rào cản bên trong
giữa thành tế bào và khoảng không gian chu chất. Thành phần chính của
màng tế bào chất là lipid và protein. Có nhiều protein khác nhau, nhưng chức
năng chính không phải là tạo cấu trúc. Chúng gồm các enzyme thực hiện các
quá trình tổng hợp trên thành tế bào, các quá trình này xúc tác cho các chất
dinh dưỡng thấm qua thành tế bào [6].
Chức năng chính của màng nguyên sinh chất là điều chỉnh sự thấm qua
tế bào cử các chất dinh dưỡng. Màng tế bào chất có tính chất thẩm thấm chọn
lọc. Một chức năng quan trọng khác là phát hiện và phản ứng với các kích
thích bên ngoài. Màng tế bào chất còn có những vùng chứa các enzyme liên
quan đến các chu trình tổng hợp khác nhau của tế bào, phân bố các vùng này
phù hợp với cấu trúc không gian và chức năng [2].

Không bào
Không bào có dạng hình tròn, được bao bọc bởi một màng rất mỏng và
chứa các dịch bào. Trừ các chất điện phân trong nước, trong không bào còn
chứa các protid, hạt mỡ, carbon ở dạng keo và hệ thống enzyme.
Riboxom
Các riboxom là các cơ quan tế bào chất có chứa hàm lượng RNA cao và
một số protein. Vai trò của chúng là tập hợp các protein từ các amino acid đã
hoạt hóa thành chuỗi tương ứng với mã có trong các phân tử RNA truyền tin.
Trong hạt riboxom thường xảy ra các quá trình tổng hợp protid.
Hạt lipid
Hạt lipid được tích tụ do chuyển hóa các saccharide hoặc được tổng hợp trong
môi trường giàu lipid. Ở trong môi trường nguyên chất, các hạt lipid nằm ở dạng
các hạt nhỏ li ti. Thông thường, tỷ lệ hạt lipid chiểm 1 - 2% trọng lượng khô của tế
bào. Tuy nhiên, một số chủng có khả năng tích lũy chất béo từ các axit béo có trong
môi trường và đạt tới 40 - 50% trọng lượng khô của tế bào [2].


11

Bầu mô (chồi)
Bầu mô là vị trí tạo ra tế bào mới. Khi các tế bào phát triển đến mức nhất
định, bầu mô cũng lớn dần và phát triển thành chồi. Các chất dinh dưỡng
chuyển vào bầu mô, chồi phát triển đầy đủ tạo thành các tế bào con có kích
thước, thành phần hoàn toàn giống tế bào mẹ. Chồi có thể tách ra để tạo thành
tế bào mới hoặc nối tiếp tạo thành chồi.
Glucid dự trữ
Hạt glycogen là nơi dự trữ tinh bột trong nguyên sinh chất của tế bào
nấm men. Khi môi trường giàu chất dinh dưỡng, nhiều hạt glycogen được
hình thành. Khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng, nấm men sẽ sử dụng hạt
glycogen dự trữ để cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất.

tránh hiện tượng phá hủy tế bào thì tế bào phải đẩy ion Na+ ra ngoài. Ion Na+
là chất duy nhất di chuyển vào tế bào theo cơ chế bị động và chủ động. Khi
thâm nhập vào tế bào nấm men, nó kéo theo cả sucrose và các axit ngay cả
khi không có sự chênh lệch nồng độ các chất này. Như vậy, chỉ những cơ chất
được vận chuyển vào trong tế bào mới tham gia quá trình trao đổi chất [2].
2.3. Nấm men trong công nghệ sản xuất bia
2.3.1. Nấm men chìm và nấm men nổi.
Nấm men trong công nghệ sản xuất bia thường là chủng Sacchromyces.
Thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, phân ngành Saccharomycotina, lớp
Saccharomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae, chi
Saccharomyces. Xuất phát từ quan sát quá trình lên men, khả năng lên men các
loại đường, khả năng hô hấp khả năng trao đổi chất khi lên men và khả năng hình
thành bào tử, người ta chia thành hai loại chính là nấm men chìm Saccharomyces
carlsbergensis và nấm men nổi Saccharomyces cerevisiae [2].
Nấm men chìm là Saccharomyces carlsbergensis dùng trong sản xuất bia
lager. Hầu hết các tế bào sau khi nảy chồi thường đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi,
hình dạng chủ yếu là hình cầu. Sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp, nhiệt
độ lên men từ 0 - 10oC. Kết thúc quá trình lên men nấm men kết lắng xuống
đáy thiết bị, dễ lắng và dễ tách lớp. Do đó, quá trình lọc dễ hơn đồng thời tạo
điều kiện sử dụng lại nấm men.
Nấm men lên men nổi là Saccharomyces cerevisiae dùng trong sản xuất
bia ale. Tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại với nhau
thành chuỗi các tế bào nấm men hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc hình oval


13

với kích thước từ 7 - 10 µm. Saccharomyces cerevisiae sinh trưởng và phát
triển ở nhiệt độ cao, lơ lửng trên bề mặt là chủ yếu, nhiệt độ lên men từ 14
đến 25oC. Khi quá trình lên men kết thúc, tế bào kết chùm, thành chuỗi tạo


14

trình lên men, một số sản phẩm phụ cũng được hình thành như các axit hữu
cơ, các este, các rượu bậc cao, aldehyde, glycerin…
2.3.3. Các hướng tận dụng nấm men bia.
Sau khi lên men bia, một lượng lớn nấm men bia được thải ra ngoài môi
trường. Lượng nấm men bia thải ra này thường ở dạng sánh lỏng, dễ thối
hỏng và rất khó sử dụng. Nấm men bia sau quá trình lên men bia thường có
đặc điểm là rất dễ bị tự phân, dễ hư hỏng và rất khó bảo quản.
Trong tế bào nấm men có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng, vitamin,
protein..
Việc sử dụng men bia trong trị liệu y học đã có từ rất xa xưa, khoảng
4000 năm trước công nguyên tại Ai Cập cổ đại. Tuy đã nhận thấy tác dụng tốt
đối với sức khỏe con người, nhưng mãi đến thế kỷ XV, XVI men bia vẫn
chưa được sử dụng rộng rãi.
Đến năm 1930, tại Nhật Bản, nấm men bia được cô đặc xuất hiện trên thị
trường dưới dạng men khô.
Hiện nay, có hai phương pháp xử lý phế liệu nấm men bia là chế biến
men khô và men chiết xuất.
Men sấy khô có thể được sấy bằng nhiều loại máy sấy khác nhau như
máy sấy dạng trống, máy sấy phun…Men khô được sử dụng làm thuốc dạng
viên hay dạng bột mang lại hiều quả kinh tế cao. Men khô được sử dụng làm
nguyên liệu nuôi trồng và chế biến thực phẩm bổ dưỡng hay làm nguyên liệu
chế biến thức ăn chăn nuôi.
Men chiết xuất được dùng nhiều trong một số thực phẩm như: súp, các
loại nước chấm,… Bản chất của quá trình sản xuất men chiết xuất chính là
quá trình thủy phân nấm men thành hỗn hợp các chất như amino acid,
nucleotide, chuỗi peptide, protein, vitamin,…


Isomaltose sucrose, α- methyl glucoside, pnitrophenyl- α- glucoside

Invertase (β- fructofuranose)

Sucrose, Raffinose

Melibiose (α- galactosidase)

Melibiase, raffinose, p- nitrophenyl- αgalactoside

Zimase

Hệ enzyme chuyển hóa đường đơn giản
thành ethylic

Vì vậy, tùy theo loài nấm men thuộc chi Sacchromyces dùng trong công
nghệ sản xuất bia mà tỷ lệ cơ chất và các thành phần của glucid được chuyển
phụ thuộc nhiều vào thành phần và tỷ lệ các enzyme [2].
2.4. Khái quát về enzyme invertase
2.4.1. Enzyme invertase
Invertase có tên khoa học là β - D - fructofuranoside fructohydrolase
(E.C.3.2.1.26). Enzyme này xúc tác quá trình chuyển hóa đường sucrose
thành đường nghịch đảo (glucose và fructose).


16

Invertase có trong động vật, thực vật, vi sinh vật (đặc biệt là nấm men có
khả năng tổng hợp invertase cao). Enzyme invertase là enzyme có mặt trong
hầu hết các nấm men công nghiệp, như nấm men bia, men sản xuất rượu cồn,


Nhiều sơ đồ động học khác nhau được đề xuất để mô tả quá trình thủy
phân sucrose khi có mặt enzyme invertase nấm men.
Sự thủy phân sucrose với sự có mặt của invertase hình thành glucose mạch
vòng và fructoase mạch vòng. Quá trình xúc tác thủy phân theo sơ đồ [18]:
Sucrose + enzyme

↔

Fructose - enzyme + glucose

Fructose - enzyme + sucrose ↔ Trisaccharide
Fructose - enzyme + H2O

↔

Fructose

+ enzyme
+ enzyme

Sơ đồ chung:

2.4.3. Invertase trong tế bào nấm men
Hiện nay, invertase có thể lấy từ các tế bào nấm men sống hoặc tế bào
nấm men đã chết. Nhưng phần lớn được lấy từ các tế bào nấm men sống [19].
Vị trí của invertase trong tế bào nấm men và tính thấm của màng tế bào
với sucrose đã là vấn đề gây tranh cãi kéo dài. Báo cáo của Friis và Ottolenghi
đã chỉ ra rằng, hầu hết invertase của các chủng nấm men, khi phát triển trên
môi trường có sucrose liên kết với thành tế bào, tuy nhiên một số cũng có mặt

phẩm của quá trình tự phân sẽ giải phóng ra ngoài môi trường.
Quá trình tự phân nấm men có thể chia làm hai phần [28]:
a. Sự thoái hóa các thành phần tế bào mà chủ yếu là sự phân giải protein
b. Sự thoái hóa của thành tế bào, cấu trúc vững chắc cấu thành nên hình
dạng của nấm men.