TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ: SV2013-02
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GUS CỦA MỘT SỐ
GIỐNG BƯỞI VIỆT NAM

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Đinh Thị Huệ

Thái Nguyên, 2014


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ: SV 2013- 02
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GUS CỦA MỘT SỐ
GIỐNG BƯỞI VIỆT NAM

Chủ trì đề tài


Cơ quan chủ trì đề tài: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Cơ quan phối hợp thực hiện :
Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Đại
học Nông Lâm Thái Nguyên
Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 3 năm 2014
1. Mục đích
Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống bưởi Việt Nam.
2. Nội dung
- Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu cắt mẫu đến khả năng tiếp nhận gen gus.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức biến nạp đến khả năng tiếp nhận gen gus.
3.Kết quả chính đạt được
Bước đầu khảo sát một số yếu tố của quy trình chuyển gen để làm cơ sở cho các
nghiên cứu chuyển gen hữu ích áp dụng trên cây bưởi.


SUMMARY

Project title: “Researching capacity to receive gene gus of some breed
grapefruit Viet Nam’’.
Code number: SV 2011 - 02
Coordinator: Sv. Dinh Thi Hue

Tel. (+84) 01648939003

E-mail :
Implementing institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
Coorperating institution:
Department of Biotechnology, Faculty of Biotechnology – Food Technology,
University of Thai Nguyen
Duration : From March 2013 to March 2014

2.3.1.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid............................................................. 10
2.3.1.3. Cấu trúc và chức năng của T-DNA .................................................................. 10
2.3.1.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens ...................................................................................................................... 11
2.4. Hệ thống vector chuyển gen ................................................................................... 12
2.4.1. Hệ vector nhị thể .................................................................................................. 12
2.4.2. Hệ vector liên hợp ................................................................................................ 13
2.4.3 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng trong chuyển gen .................................................. 16
2.4.3.1. Gen chỉ thị sàng lọc ........................................................................................... 17
2.4.3.2. Gen chỉ thị chọn lọc .......................................................................................... 17
2.5. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với cây có múi ..................................................... 18
2.5. 1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với cây có múi trên thế giới............................ 18
2.5. 2. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với cây có múi ................................................. 19


PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 20
3.1. Vật liệu và hóa chất, thiết bị nghiên cứu ................................................................ 20
3.1.1. Vật liệu thực vật ................................................................................................... 20
3.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và vector chuyển gen ................. 20
3.1.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ............................................................................... 20
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 20
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 20
3.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................................... 20
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................................... 21
3.3.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 21
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu. .................................................................................... 21
3.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen gus vào bưởi thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens .................................................................................................................. 21
3.3.2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiếp
nhận gen ở một số giống bưởi thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ............................ 22

Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 3 năm 2014
1. Mục đích
Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống bưởi Việt Nam.
2. Nội dung
- Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu cắt mẫu đến khả năng tiếp nhận gen gus.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức biến nạp đến khả năng tiếp nhận gen gus.
3.Kết quả chính đạt được
Bước đầu khảo sát một số yếu tố của quy trình chuyển gen để làm cơ sở cho các
nghiên cứu chuyển gen hữu ích áp dụng trên cây bưởi.


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Ti-plasmid dạng octopin ................................................................................ 10
Hình 2.2. Cấu trúc T-DNA ............................................................................................. 11
Hình 2.3. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật ............................................. 12
Hình 2.4. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể ......................................................................... 13
Hình 2.5. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp ....................................................................... 14
Hình 2.6. Sơ đồ cấu trúc chung của vector pCambia ................................................... 15
Hình 2.7. Cấu trúc vector pCambia 3301 ...................................................................... 15
Hình 3.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen
điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải).............. 20
Hình 3.2. Quy trình chuyển gen gus vào bưởi thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
(theo Yan - Xin Duan và cs, 2007) ................................................................................ 21


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU

2

1.2. Mục đích của đề tài
- Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống bưởi Việt Nam
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu cắt mẫu đến khả năng tiếp nhận gen gus.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức biến nạp đến khả năng tiếp nhận gen
gus.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
+ Bước đầu khảo sát một số yếu tố của quy trình chuyển gen để làm cơ sở cho
các nghiên cứu chuyển gen có giá trị vào cây bưởi.
+ Cung cấp tài liệu học tập và nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh viên hoàn
thiện về cả kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn.
- Ý nghĩa thực tiễn
Thông qua kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra quy trình tái sinh tạo cây bưởi
chuyển gen hoàn chỉnh phục vụ cho công tác chọn tạo giống tốt, giống mới.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây bưởi
2.1.1. Nguồn gốc
Cây bưởi có tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck, là loại cây ăn quả có
múi có giá trị đã được trồng lâu đời trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa
có sự thống nhất về nguồn gốc xuất xứ của cây trồng này. Có rất nhiều quan điểm
của các nhà khoa học trên thế giới về nguồn gốc của cây bưởi.
Theo Chawalit Niyomadham, 1992 [27] cho rằng: Bưởi có nguồn gốc ở

- Giá trị dinh dưỡng:
Dịch quả bưởi chín có chứa nhiều chất dinh dưỡng, qua kết quả phân tích hàm
lượng các chất dinh dưỡng của một số giống bưởi ở nước ta cho thấy trong 100g
phần ăn được của bưởi có chứa nhiều chất dinh dưỡng khác nhau [2]. Trong đó:
+ Thành phần dinh dưỡng chính gồm: nước 80g, glucid 9g, protid 0.6g, lipid
0.1g.
+ Các chất khoáng: Ca 23mg, P 19mg, Fe 0.5mg, chất xơ 0.7mg ( ngoài ra còn
các K, Mg, Na, Cu...).
+ Các vitamin: B1 0.04mg, B2 0.02mg, PP 0.3mg. Cung cấp 30-43 calo.
- Gía trị sử dụng:
Người ta trồng bưởi để lấy quả ăn, lấy hoa để ướp hương thơm các món ăn,
hoặc dùng để chưng cất nước hoa bưởi làm hương liệu mỹ phẩm. Theo Đông y quả
bưởi có vị chua, có tác dụng giải độc rượu, bồi bổ cơ thể, chữa được chứng có thai
nôn mửa, biếng ăn, ăn không tiêu, đau bụng [7].
- Giá trị kinh tế:
Theo số liệu thống kê năm 2010 và năm 2011 về tình hình phát triển kinh tế xã hội của cả nước cho thấy: năm 2010 ở lĩnh vực nông nghiệp diện tích và sản
lượng một số loại cây ăn quả tiếp tục tăng lên; sản lượng cam, quýt của cả nước ước
tính đạt 729,4 nghìn tấn, tăng 5,2% so với năm trước, sản lượng bưởi đạt 394,1
nghìn tấn tăng 3,4% so với năm 2009. Năm 2011, sản lượng một số cây ăn quả cũng
đạt khá cao trong đó sản lượng bưởi đạt 417,6 nghìn tấn, tăng 4,3% so với năm
2010 [14].
Trồng bưởi mang lại hiệu quả kinh tế cao. Ở Thượng Mỗ - Hà Tây người ta tính được
hiệu quả kinh tế của trồng bưởi gấp 4-5 lần so với trồng lúa. Đối với bưởi Đoan Hùng,
thông thường những nhà trồng 30 cây bưởi thu được mỗi năm 15-20 triệu đồng/năm.
Với các giống bưởi Năm Roi, Da Xanh thu nhập lên tới 120-150 triệu/ha [15].
2.1.4. Đặc điểm thực vật học của cây bưởi
2.1.4.1. Đặc điểm chung
Theo Trần Thế Tục và cs (1998) [12] cây ăn quả có múi (cam, quýt, bưởi,..)
thường trải qua 3 giai đoạn: giai đoạn cây con, giai đoạn ra hoa kết quả và cuối
cùng là thời kỳ già cỗi.

+ Nguồn gốc: Đoan Hùng – Phú Thọ, sau đó được trồng nhiều ở 2 xã Phú
Diễn và Phú Minh, huyện Từ Liêm, Hà Nội.
+ Đặc tính: Bưởi Diễn có vị ngọt, quả để càng lâu càng ngon. Bưởi Diễn quả
tròn, vỏ quả nhẵn khi chín quả bưởi chuyển sang màu vàng cam, mỏng vỏ, tép giòn,
ăn vào ngọt mát và thơm. Sau thu hái có thể để được từ 3-5 tháng.
+ Thời gian thu hoạch: Thu hoạch vụ đông, thường trước tết Nguyên Đán từ
15-20 ngày.
- Bưởi Đào
Theo tác giả Hoàng Minh, 2005 [10] bưởi Đào có đặc điểm như sau:
+ Nguồn gốc: Giống bưởi này có nhiều dạng khác nhau, điển hình là bưởi Đào
trồng ở xã văn quán, huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc. Hiện nay, bưởi này được
trồng phổ biến ở nhiều địa phương như Hàm Yên – Tuyên Quang, Phú Bình – Yên


6

Bái, Hoài Đức – Hà Tây và nhiều ngoại thành của Hà Nội .
+ Đặc tính:Qủa có hai dạng hình cầu hơi dẹt và thuôn dài, trọng lượng trung
bình từ 1,0-1,2kg, khi chín vỏ quả lẫn cùi và đều có màu đỏ gấc, vỏ quả ngắn có
nhiều túi tinh dầu thơm .
+ Thời gian thu hoạch: Bưởi Đào thường thu hoạch muộn vào khoảng cuối
tháng 1 hoặc 2 dương lịch [12].
- Bưởi Phúc Trạch
+ Nguồn gốc: Bưởi Phúc Trạch có từ lâu đời trên vùng đất Hương Khê, Hà
Tĩnh. Bưởi này chỉ có thể giữ được bản sắc hương vị của mình khi trồng ở huyện
Hương Khê, Hà Tĩnh – nơi có bốn xã Phúc Trạch, Hương Trạch, Hương Đô và Lộc
Yên là nơi sản sinh ra cây bưởi Phúc Trạch. Hiện nay, giống bưởi này được trồng ở
hầu khắp 28 xã trong huyện và các vùng lân cận [2].
+ Đặc tính: Bưởi Phúc Trạch có hình cầu tròn, màu sắc vỏ quả xanh vàng,
màu sắc thịt quả màu hồng nhạt hoặc màu trắng trong, khối lượng quả đạt từ 11,5kg, số múi 14-16 múi/quả, tỷ lệ phần ăn được từ 60-65%, số hạt bình quân trong

Department of Biotechnology, Faculty of Biotechnology – Food Technology,
University of Thai Nguyen
Duration : From March 2013 to March 2014
1. Objective: To study the possibility of receiving some gus gene Vietnam pomelo.
2. Main Contents:
- The type reasearch effects of cutting capacity to receive the gus gene.
- The transformants of the method research effects capacity to receive the gus gene.
3. Obtained results
The gene transfer processes completely as basis for the steps value of transgenic
into grapefruit.


8

năng suất có sự tăng lên đạt 279,651 tạ/ha. Đứng thứ hai là Ấn Độ với diện tích
năm 2008 là 36 200 ha, năng suất đạt 125,138 tạ/ha, đến năm 2010 diện tích tăng
lên 55 500 ha và năng suất đạt được là 137,712 tạ/ha. Năng suất quả có múi bình
quân năm 2008 thấp nhất ở Afghanistan đạt 86,900 tạ/ha, đến năm 2010 thấp nhất
là Philippines với năng suất là 89,741 tạ/ha [19].
-Tình hình tiêu thụ bưởi trên thế giới
Nhật Bản vẫn là một thị trường lớn cho tiêu thụ bưởi. Trong năm 2004/ 05
trong bang Florida của Mỹ đã xuất sang Nhật Bản 80 851 tấn bưởi tươi, năm
2005/ 06: 102-119 nghìn tấn, năm 2006/ 07: 136 nghìn tấn. Nam Phi cũng xuất
sang Nhật khoảng 96 721 tấn trong năm 2004/ 05, tăng gần 1,55 triệu tấn so với
năm 2003/ 04.
Tại Nga, khoảng 12% người Nga coi quả có múi là loại trái cây ưa thích.
Quýt và cam là 2 loại quả phổ biến nhất trong khi đó bưởi vẫn được coi là loại quả
có múi quý hiếm. Năm 2004 Nga nhập 4 ngàn tấn bưởi, tăng so với 32 ngàn tấn
năm 2003, 33 ngàn tấn của năm 2002 và 22 ngàn tấn năm 2001. Trong 9 tháng đầu
năm 2005 Nga đã nhập 30 ngàn tấn bưởi. Như vậy trong năm 2004 Nga đứng thứ 3


2 224

2 221

1

Diện tích (ha)

2

Năng suất (tạ/ha)

110,476

109,091

109,437

114,892

117,582

3

Sản lượng (tấn)

23 000

23 200

Bảng 2.4 Giá trị xuất khẩu cây có múi tại Việt Nam (2001-2008)
Đơn vị: 1.000 USD
Năm
Loại quả

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

Bưởi

0

17

0

0


44

126

148

21

44

25

98

Cam

0

3

11

4

12

22

74


Quả có múi khác 381
Tổng

559

(Nguồn: Trung tâm thương mại quốc gia, 2009)
2.3. Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật
2.3.1.Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen
vào thực vật
2.3.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x 0,70,8mm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí,
nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn [6].


10

A.tumefaciens là loài vi khuẩn gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn
thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae
và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp [6].
Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường được biết chung là
opine. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng
phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp [6].
2.3.1.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Năm 1974, Schell và Van Montagu, trường Đại học Gand (Bỉ) chứng minh
rằng, các chủng gây khối u ở A.tumefaciens chứa một plasmid hình vòng có kích
thước lớn (khoảng 200-250kbp) có khả năng gây ra khối u. Plasmid này gọi là Tiplasmid mang rất nhiều gen, đặc biệt là các gen cần thiết cho sự tái bản [5].

Hình 2.1. Ti-plasmid dạng octopin
Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ở

tms2

2

1

tmr

tggcggatatatatgtggtgtaaac

rb

nos

tgacaggatatatggcgggtaaac

Hình 2.2. Cấu trúc T-DNA
2.3.1.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi
khuẩn như: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon...Dưới tác dụng của
các hợp chất này, A.tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển
T-DNA vào tế bào thực vật. Qúa trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir
và RB, LB. Cũng chính các chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng
vir hoạt động và tăng cường biểu hiện [5].
Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị
tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid được hoạt hóa và phiên mã.


MỤC LỤC

2.5. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với cây có múi ..................................................... 18
2.5. 1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với cây có múi trên thế giới............................ 18
2.5. 2. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với cây có múi ................................................. 19


13

dòng tế bào thực vật có thể được thực hiện do hoạt động chức năng của vùng vir.
Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(1)

Vector chuyển gen

(2)

Vector bổ trợ

Hình 2.4. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể
Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacterium, khi các gen trên vector
bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector
chuyển gen dẫn đến việc chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật. Nhờ vậy, hiệu
quả quá trình chuyển gen từ E.coli sang A. Tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay,
vector nhị thể được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với
yêu cầu của quá trình chuyển gen [5].
2.4.2. Hệ vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng
nằm trên plasmid vi khuẩn với vùng T-DNA trên Ti-plasmid của A. tumefaciens.
Trong đó, người ta giữ lại vùng vir, loại bỏ vùng mã hóa chức năng gây khối u và
thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid (Hình 2.5).
Có ba loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp [5], [33] gồm.



16

Trong nghiên cứu sử dụng vector pCambia 3301 (hình 2.7), gen chọn lọc thực
vật là gen bar, gen chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin, gen chỉ thị là gen
gusA và gen này được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân
cách nhau bởi đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa
điểm là pUC18-lacZa, dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (Cauliflower
Mosaic Virus) và được quy định bởi trình tự CaMV35S polyA. Chủng vi khuẩn
Agrobacterium được sử dụng là chủng EHA105.
2.4.3 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng trong chuyển gen
Gen chỉ thị là những gen được sử dụng làm phương tiện cho việc thực hiện
quá trình chuyển gen và tạo cây trồng chuyển gen. Trong số các gen công cụ phải
kể đến các gen làm nhiệm vụ chỉ thị chọn lọc và các gen hỗ trợ quá trình chọn lọc tế
bào và cây mang gen chuyển [9].
A. Một số gen chỉ thị chọn lọc
Ký hiệu gen
nptII

Enzyme tương ứng

Chất dùng để chọn lọc

Neomycin phostransferase

Kanamycin

hpt


Bromoxynil nitrilase

Bromoxynil

B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
gus A

β- glucuronidase

X-glux

lac Z

β- glactosidase

X-gal

luc

Luciferase đom đóm

Lumis Phos

lux

Luciferase khuẩn

Lumi Phos



hiện trong thực vật. Các gen kháng kháng sinh thường không tồn tại trong thực vật,
kể cả tảo, vì thế khi bổ sung các kháng sinh này vào môi trường nuôi cấy, chỉ những
tế bào nhận được gen kháng kháng sinh biến nạp kèm gen tính trạng mới thì chúng
có thể sống sót và phát triển, những tế bào còn lại sẽ bị chết [1].
- Gen kháng thuốc diệt cỏ
Gen kháng Glyphosphate: thuốc trừ cỏ nhóm glyphosate gồm Roundup,
Rodeo, Accord...tác động lên quá trình trao đổi chất của thực vật thông qua ức chế
hoạt tính enzym’’ 3- enolpyruvylshikimate-5phosphate synthate” (EPSPS). Khi
hoạt tính của EPSPS bị glyphosate ức chế cây sẽ chết. Dùng gen này làm gen chọn