BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-----------------*-----------------

TRẦN NGỌC KHÁNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ VI SINH
VẬT ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA
INFESTANS GÂYBỆNH MỐC SƯƠNG TRÊN
CÂY CÀ CHUA

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2015
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------------ * ----------------

TRẦN NGỌC KHÁNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ VI SINH
VẬT ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA
INFESTANS GÂYBỆNH MỐC SƯƠNG TRÊN
CÂY CÀ CHUA
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật


Page i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
trước sự quan tâm, dìu dắt và tận tình hướng dẫn của TS. Hà Minh Thanh và TS.
Phạm Bích Hiên trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn
này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn trước sự quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ của
các thầy, các cô đã tham gia giảng dạy chương trình cao học, các cán bộ trong Ban
đào tạo sau đại học – Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc Viện Bảo vệ thực vật, các cán bộ Bộ
môn Bệnh cây và đặc biệt là các đồng nghiệp nhóm Nghiên cứu cây trồng cạn,
nhóm Nghiên cứu cây có múi – Viện bảo vệ thực vật đã giúp đỡ trong quá trình điều
tra và thực hiện thí nghiệm đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, các đồng nghiệp, bạn bè đã quan tâm,
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 1 tháng 1 năm 2016
Tác giả luận văn

Trần Ngọc Khánh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC


Tính cấp thiết của đề tài

1

2.

Mục tiêu của đề tài

2

3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2

4.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1.

Cơ sở khoa học của đề tài


1.2.2.2.

Những nghiên cứu về bệnh mốc sương trên cây cà chua

15

1.2.2.3.

Những nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng

17

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1.

Vật liệu nghiên cứu

22

2.2.


Thu thập, phân lập một số vi sinh vật (vi khuẩn và xạ khuẩn) đối
kháng với nấm P. infestans, loài nấm P. infestans gây bệnh mốc
sương cà chua

3.1.1. Thu thập loài nấm P. infestans gây bệnh mốc sương trên cà chua.

37

3.1.2. Thu thập và phân lập nguồn VSV đối kháng với nấm P.infestans gây

39

bệnh mốc sương trên cà chua.
3.2.

Nghiên cứu và đánh giá khả năng ức chế của các VSV đối kháng

43

đối với nấm P. infestans.
3.3.

Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái, các yếu tố ảnh hưởng

45

đến sinh trưởng phát triển của các nguồn VSV đối kháng.
3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của vi

45

3.6.

Nghiên cứu nhân sinh khối vi sinh vật đối kháng với nấm

55

P.infestans.

3.6.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn carbon đến khả năng nhân sinh khối

55

của các VSV đối kháng
3.6.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn nitơ đến khả năng nhân sinh khối của

56

các VSV đối kháng
3.6.3. Ảnh hưởng của tần số vòng lắc đến khả năng nhân sinh khối của

57

các VSV đối kháng
3.6.4. Ảnh hưởng của thời gian lắc đến khả năng nhân sinh khối của các

58

VSV đối kháng
3.7.


3.8.4. Thí nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh mốc sương trên cà chua của

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

67

Page v


hỗn hợp VSV đối kháng BS2 trong điều kiện nhà lưới
3.8.5. Hiệu quả của các VSV dạng dơn dòng và hỗn hợp với bệnh mốc

69

sương cà chua trong điều kiện nhà lưới
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

72

Kết luận

72

Đề nghị

72

TÀI LIỆU THAM KHẢO

73


Hiệu quả giảm bệnh

4.

Liều gây chết trung bình

LD50

5.

Môi trường khoáng cơ bản

MTKCB

6.

TB

Trung bình

7.

TLB (%)

Tỷ lệ bệnh

8.

VSV

Các chủng VSV đối kháng có triển vọng đã thu thập được tại

40

Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh và Bắc Giang
3.4

Khả năng đối kháng của một số vi khuẩn và xạ khuẩn đối với

44

nấm Phytophthora infestans.
3.5a

Mật độ khuẩn lạc của các vi khuẩn đối kháng khi nuôi cấy

46

trên các môi trường khác nhau
3.5b

Mật độ khuẩn lạc của các xạ khuẩn đối kháng khi nuôi cấy

46

trên các môi trường khác nhau
3.6a

Mật độ khuẩn lạc của các vi khuẩn đối kháng khi nuôi cấy


3.9

Kết quả định danh các vi sinh vật đối kháng

53

3.10

Ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh khối của VSV đối kháng

55

3.11

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh khối của các vsv đối

56

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


kháng
3.12

Ảnh hưởng của tần số vòng lắc đến khả năng nhân sinh khối

57


Trọng lượng trung bình của chuột thí nghiệmvà chuột không tham

63

gia thí nghiệm
3.18

Hoạt tính kháng sinh của các vi sinh vật đối kháng trong môi

64

trường nhân sinh khối với nấm P. infestans
3.19

Thử nghiệm nồng độ và liều lượng của hỗn hợp vi sinh vật

66

dạng lỏng trong điều kiện Invitro
3.20

Hiệu quả nồng độ hỗn hợp BS2 khi xử lý đất đối với bệnh

67

mốc sương trên cà chua
3.21

Hiệu quả phòng trừ bệnh mốc sương trên cà chua của tổ hợp


3.2

Hình thái nấm P.infestans gây bệnh mốc sương trên cây cà

38

chua
3.3

Hình thái chủng B2.3-0312 (Paenibacillus sp.)

41

3.4

Hình thái chủng B5.3-0312 (Bacillus sp.)

42

3.5

Hình thái chủng B4.2-0312 (Pseudomonas sp.)

42

3.6

Hình thái chủng A1.1-0512 (Streptomyces sp.)

42

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của

47

chủng A2.1-0512 (Streptomyces sp.)
3.12

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của

47

chủng A1.1-0512 (Streptomyces sp.)
3.13

Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của chủng

51

B5.3-0312(Bacillus sp.) và chủng B4.2-0312(Pseudomonas
sp.)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page x


3.14

Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của chủng
A2.1-0512(Streptomyces

59

các vsv đối kháng
3.18

Hoạt tính kháng sinh của các vi sinh vật đối kháng trong môi

65

trường nhân sinh khối với nấm P. infestans
3.19

Hiệu quả của các nồng độ chế phẩm BS2 khi phun đối với

69

bệnh mốc sương trên cà chua

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page xi


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cà chua là cây trồng có giá trị kinh tế cao và mang tính đặc thù trong sản
xuất nông nghiệp. Đẩy mạnh đầu tư phát triển để nâng cao năng suất và chất lượng
sản phẩm cà chua nhằm nâng cao thu nhập cho người nông dân, góp phần xóa đói
giảm nghèo là một trong những ưu tiên trong chính sách phát triển nông nghiệp của
nước ta. Tuy nhiên quá trình sản xuất cà chua cho đến nay vẫn còn gặp nhiều khó

- Ý nghĩa khoa học
Cung cấp các dẫn liệu khoa học về thành phần loài và đặc điểm sinh học,
sinh thái, khảnăng đối kháng của một số vi sinh vật,tạo cơ sở khoa học cho việc
nghiên cứu và ứng dụng các vi sinh vật này để phát triển chế phẩm sinh học phòng
trừ bệnh mốc sương cà chua.
- Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần quan trọng trong việc ứng dụng biện
pháp sinh học phòng trừ bệnh mốc sương trên cây cà chua có hiệu quả và an toàn
với môi trường, sức khỏe con người.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu:
Một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthorainfestansgây bệnh
mốc sương cà chua.
- Phạm vi nghiên cứu:
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ức chế nấm Phytophthora
infestans của một số vi sinh vật đối kháng có tiềm năng trong phòng thí nghiệm,
nhà lưới Bộ mônbệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật – Phường Đức Thắng – Quận Bắc
Từ Liêm – Hà Nội.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
NấmPhytophthoraspp.lànhữngloàinấmgâyhạiphổbiếntrêncác
trồngkhácnhau.Biệnphápchủyếuhiệnnay

đểphòngtrừnấm

biệnpháphóahọc,hiệu

quảtrongphòngtrừbệnh,khôngônhiễm

thế
chomôi

trườngvàảnhhưởngđếnsứckhỏeconngười.Trên thế giới đã có những nghiên cứu
về vi sinh vật đối kháng nấm Phytohthora có hiệu quả rất cao như: sử dụng
vi khuẩn kháng Bacillus spp. và Pseudomonas fluorescens với nấm P.
palmivora trên cây ca cao (Galindo, 1992), vi khuẩn đối kháng Pseudomonas
fluorescens với nấm P. capsici gây thối rễ cây hồ tiêu (Dipby và cộng sự,
2001), vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis với nấm P. infestans trên cây
khoai tây và cà chua ở Châu Âu (Stephan và cộng sự, 2011). Ở Việt Nam
trong những năm gần đây cũng có một số công trình nghiên cứu về vi sinh
vật đối kháng nấm Phytophthoratrên một số loại cây trồng như:sử dụng vi
khuẩn Bacillus methylotrophicusvà xạ khuẩn Streptomyces misionensis với nấm
Phytophthoratrên một số cây trồng, đạt hiệu quả phòng trừ từ 81,7 – 84,6% trong
phòng thí(Hà Minh Thanh và cộng sự, 2013),sử dụng vi khuẩnBacillus
methylotrophicusvàBacillus amyloliquefaciens subsp. Amyloliquefaciensvới nấmP.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao (Phạm Ngọc Dung và cộng sự, 2014). Tuy
nhiên, hiện nay tại nước ta chưa có một công trình nghiên cứu chính thức nào về vi
sinh vật đối kháng với nấm P. infestans gây bệnh mốc sương trên cây cà chua. Do
đó, đề tài được tiến hành sẽ là hướng đi đúng đắn trong bối cảnh nền nông nghiệp
nước ta hiện nay.

nhánh tạo cho bề mặt của bộ phận bị bệnh có màu trắng rất dễ nhận dạng. (William
W.Kirk và cộng sự, 2009).
Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Andre và David (2004), hình thức
sinh sản hữu tính có một số vai trò trong vòng đời của Phytophthora. Trường hợp
những loài Phytophthora mang tính dị tản cho phép kết hợp những cặp gen tương
ứng. Bào tử noãn có thể tồn tại trong một thời gian dài khi không có sự hiện diện
của cây ký chủ. Bào tử noãn cũng có thể nhiễm bệnh vào mô cây chủ trong điều
kiện khí hậu không thuận lợi, nóng và khô.
Phương thức sinh sản của các loài Phytophthora quyết định khả năng phát
dịch. Tính đồng tản cho phép sinh sản tự do, tính dị tản tạo khả năng phát dịch. Gần
đây, những loài mang tính đồng tản biểu hiện mức độ thấp của lai xa trong Invitro,
trong khi những loài mang tính dị tản chỉ ra tính lai gần ở mức độ thấp (Goodwin và
cộng sự, 1994).
Kết quả nghiên cứu của Andre và David (2004) cho thấy chu kỳ sống của
nấm Phytophthora có thể bao gồm tới 3 dạng sinh sản vô tính - bào tử nang, du
động bào tử, hậu bào tử và bào tử noãn với dạng sinh sản hữu tính. Sợi nấm sinh
dưỡng lưỡng bội sản sinh ra bào tử nang vô tính mà có thể nảy mầm trực tiếp, hoặc
có thể phân chia để sản sinh ra 8-12 bào tử động, mỗi bào tử động trải qua một quá
trình lan truyền và bơi vào nang trước khi nảy mầm.
Kết quả của Burgess (2008) cho rằng Phytophthora thuộc lớp nấm trứng,
không phải nấm thực và sinh sản ra du động bào tử. Vì vậy, phòng trừ nấm này
khác với phòng trừ các bệnh do nấm thực gây ra và các thuốc dùng trong phòng trừ
cũng khác. Theo tác giả, các bệnh do nấm này gây hại cho cây lâu năm, rau và các
cây trồng khác làm tổn thất đáng kể về kinh tế cho các nước vùng Đông Nam Á.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5




Baker,

1983).

phòngtrừsinhhọccóthểđượctiếnhànhmộtcáchthủcôngbằngcáchđưa
vậtđốikhángngoạilaivàotrongđất,hoặcbằngcáchkíchthích
đốikhángnộisinhthôngquaviệcbổxungthêm

Hoạtđộng
các

hoạtđộngcủacác
cáclớpchephủhoặc

phânhữucơ(ErwinvàRibeiro,1996).Chẳng hạn, sử dụng chất hữu cơ (lớp che phủ, vỏ
gỗ thông được chế thành phân trộn...) có vi sinh vật hoạt động mạnh và độ pH thấp
sẽ giúp phòng chống được P.cinnamomi ở trong các cây được trồng tại các vườn
ươm. Mycorhizae cũng có tác dụng phòng trừ sinh học đối với P. cinnamomi giống
như đã được xác định trên cây thông và dứa.
Nhữngtiếnbộđạtđượcgầnđâytrongbiệnphápsinhhọcbaogồmviệc
địnhdạngcáctácnhânphòngtrừsinhhọcnhưcácxạkhuẩn(Youvàcộng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


sự.,1996),cácloàinấmtrongđócó


hủychitincủaváchtếbàonấmgâybệnhbaogồm6enzyme:2enzymβ-1,4

–N-

acetylglucosaminidasevà
4enzymeendochitinase.CácchủngnấmmốcTrichoderma,Aspergillus,Candidaalbican
s,

Sclerotium

glucanicum...cókhả

năngsảnsinhβ-glucanasecao,đặcbiệtlànấm

Trichoderma. Β -glucanasecủa Trichodermagiữvaitrò chínhtronghoạtđộngký
sinhđểđốikhángvới

nấm

gây

bệnhcây

glucanaseởTrichodermakìmhãmquátrìnhsinhtổng

trồng.β-1,3hợpβ-1,3-

glucanváchtếbào,ứcchếsựpháttriểncủanấmgâybệnh.
Việcsửdụngnấmcóíchđểphòngtrừbệnhhạiđãđượcnghiêncứuvà áp dụng nhiều
trên thế giới (Handelsman và Stabb, 1996).Báo cáo của Biswas và Das (1999) cho

hạicủanấm

NấmTrichodermacóthểhạnchếsựgây
Phytophthoraparasiticabằngcáchsảnsinhchitinasevà
glucanasegiúptăngkhảnăngkhángbệnhcủacây(TahíaB.vàcộngsự,2004).

Bêncạnhnhómnấm cóíchthìnhómvikhuẩnnhưvikhuẩnBacillus spp., xạ khuẩn
Streptomycesspp.vàvi

khuẩn

huỳnhquangcũngđượcsửdụngnhiềuđể

pháttriểnchếphẩmsinhhọcphòngtrừbệnhhạidocácnhóm

vikhuẩnnàycó

nhiềutiềm

năng nhưchúngphânbốrộngrãitrongtựnhiên,cótínhkhángcao đốivớicácloàiVSVgây
hạivàantoànvớicácVSVkhácvàmôitrường.VikhuẩnBasillussubtilisGBO3đượcsửdụn
gđểxửlýhạtlàmgiảmbệnhthối
rễcâyđậuvàtăngnăngsuất31%sovớiđốichứng(Jensenvàcộngsự,2002).
Các tác giả Diby và cộng sự (2001) cho rằng vi khuẩn đối kháng
Pseudomonas fluorescent có khả năng hạn chế sự phát triển của một số tác nhân gây
bệnh tồn tại trong đất. Vi khuẩn này sản sinh các chất kích thích sinh trưởng như:
gibberellins, cytokinins và axit acetic. Các nguồn vi khuẩn này được nghiên cứu
trong phòng trừ bệnh do nấm P.capsici gây thối rễ cây hồ tiêu, hiệu quả phòng trừ
đạt 70% trong điều kiện phòng thí nghiệm. Theo dõi sau 4 tháng cho hiệu quả kích
thích sinh trưởng thân lá cây hồ tiêu tăng hơn 57,15% trong điều kiện nhà lưới.

nấm Phytophthora capsici gây nên. Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm
Trichoderma harzianum IISR-1369 với vi khuẩn P. fluorescen IISR-11 cho hiệu
quả phòng trừ đạt 63%, cao hơn so với đối chứng là 36%.
Theo Diby và cộng sự (2005) cho rằng để quản lý tổng hợp bệnh mốc sương
trên cây họ cà nên hạn chế nguồn lây lan, mật độ vừa phải thông thoáng, luân canh
với cây khác họ, sử dụng nấm Trichonerma sp. hạn chế 60% tỷ lệ bệnh so với đối
chứng, cũng sử dụng thuốc hóa BVTV trừ nấm là maneb, mancozeb, chlorothalonil
khi cần thiết. Tác giả cũng sử dụng giống cà chua chống chịu bệnh như Cherry,
Netump trong thử nghiệm cho hiệu quả khá cao.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


Ở Hàn Quốc theo Dong và cộng sự (2006) đã sử dụng sản phẩm vi khuẩn có
chứa enzyme chitinase và β-1,3-glucanase đã hạn chế được 64% tỷ lệ bệnh mốc
sương so với đối chứng trên cây ớt ở nhà lưới. Tác giả cũng sử dụng các giống
chống chịu, vệ sinh đồng ruộng, luân canh với cây khác họ cà, vv... kết hợp các biện
pháp quản lý tổng hợp đối với bệnh mốc sương trên đã hạn chế được 54-70% bệnh
trên ớt ở ngoài đồng.
Stephan Olson và cộng sự (2010) trường đại học Florida của Mỹ đã ứng
dụng một số chủng VSV đối kháng để hạn chế bệnh trên cây cà chua như các chủng
PGPR Bacillus pumilus SE 34, EQTY, và Pseudomonas putida 89B61 được thông
báo hạn chế các nguồn bệnh: nấm, vi khuẩn, virus thực vật trên cà chua và dưa
chuột, làm giảm tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) từ 10-25% so với đối chứng.
Tác giả cũng sử dụng 2 chủng Bacillus làB.amyloliquefaciens IN937a và B.subtilis
GB03 cũng có khả năng hạn chế bệnh HXVK và nấm Phytophthora trên cà
chua,nhưng nếu kết hợp xử lý Actigard, thymol với các chủng VSV có ích trên kết
hợp với vệ sinh đồng ruộng, canh tác, chọn lựa dòng/giống chống chịu bệnh thì tỷ lệ

nhómnấmnày,chúngcókhảnăngtồntạilâudàivàthíchứngvớicácđiều
kiệnngoạicảnhkhókhăndưới dạngbàotử hậuhoặcdạnghạch.Hơnnữa việcsửdụngnhiều
thuốc hóa học còn gây ra những ảnh hưởng tiêu cực như tàn dư thuốc gây ô nhiễm
môi trường, thậmchícònpháhủytầngô zôn, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người
và vật nuôi, tiêu diệt vi sinh vật có ích và gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi sinh
vật

gây

bệnh.

hóahọclàhướngđi

Vìthế,việctănghiệuquảphòngtrừbệnhvàgiảmviệcsửdụngthuốc
toàncầutrongnềnsản

xuấtnôngnghiệphiệnđạiyêucầu

dụngcácphươngphápkhácnhưbiệnphápsinhhọctrongbảovệthựcvật

là

một

sử
trong

những hướng đi được các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển.
EzziyyanilM.



các

dòngTrichodermađượcđánhgiáđềuứcchếsựpháttriểncủacáctácnhân
gâybệnhtrêncâytrồngvànhữngthửnghiệmcũngchothấycácenzymethủyphânđóngvaitr
òtrongứcchếsựpháttriểncủanấmbệnh.Nhữngenzyme

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

thuỷphâncủanấm

Page 11