HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN KHẮC HẢI

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
HÒA TAN PHOSPHATE VÀ KALI KHÓ TAN TỪ ĐẤT

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN KHẮC HẢI

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
HÒA TAN PHOSPHATE VÀ KALI KHÓ TAN TỪ ĐẤT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60420201

Người hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Văn Giang

HÀ NỘI, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên

Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận
văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Xuân Cảnh, ThS. Trần Thị Đào cùng các
thầy cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Khắc Hải

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


MỤC LỤC

Lời cam đoan

ii

Lời cảm ơn


1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu

2

1.3

Yêu cầu

2

Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.1

3

Các dạng phosphate và kali trong đất và vòng tuần hoàn của phosphate và
kali trong tự nhiên

3

2.1.1 Các dạng phospho trong đất


khó tan trong đất

15

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

15

2.3.2 Tình hình nghiên tại việt nam

17

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

20

3.1

Địa điểm nghiên cứu

20

3.2

Thời gian nghiên cứu

20

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp



21

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu

21

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn

21

3.5.3 Phương pháp nhận diện vi khuẩn có khả năng phân giải kali khó tan trong đất

24

3.5.4 Phương pháp xác định hoạt độ phân giải phosphate khó tan của các chủng vi khuẩn

24

3.5.5 Phương pháp xác định lượng ion kali trong dung dịch sử dụng phương pháp
tetraphenylborate

25

3.5.6 Khảo sát sự biến thiên ph môi trường của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
trong 5 ngày nuôi cấy

26

3.5.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải phosphate và kali

30

4.1

30

Kết quả

4.1.1 Phân lập và xác đinh các đặc điểm hình thái của vi khuẩn có khả năng phân
giải phosphate khó tan

30

4.1.2 Xác định khả năng phân giải phosphate và kali khó tan của các chủng vi

4.1.3

khuẩn tiềm năng

32

Khảo sát và đánh giả một số đặc tính tiềm năng của các chủng vi khuẩn

33

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v




48

5.1

Kết luận

48

5.2

Kiến nghị

48

Tài liệu tham khảo

49

Phụ lục

57

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt


nm

Nanometer

NXB

Nhà xuất bản

PDA

Potato dextro agar

sp.

Species

UV

Ultra Violet

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng phosphate hữu cơ trong tầng đất mặt của các loại đất khác
nhau trong mối quan hệ với thành phần cơ giới đất


Page viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Vòng tuần hoàn phosphate trong tự nhiên

6

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình chuyển hóa phosphate trong đất

7

Hình 2.3 Sơ đồ chuyển hóa giữa các dạng kali trong đất

11

Hình 2.4 Sơ đồ quá trình phân giải nucleoprotein

13

Hình 4.1 Vi khuẩn có khả năng phân giải phosphate khó tan

30

Hình 4.2

31

Vi khuẩn có khả năng phân giải kali khó tan trên môi trường Aleksandrov

kali (B) của 3 chủng vi khuẩn

39

Hình 4.10 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng phân giải phosphate (A) kali
(B) của các chủng vi khuẩn

40

Hình 4.11 Một số đặc điểm của chủng 591

41

Hình 4.12 Kết quả xây dựng cây phân loại của chủng 591

42

Hình 4.12 Sự thay đổi của pH môi trường và sự phân giải phosphate (a) và kali (b)
khó tan của chủng 591 trong quá trình nuôi cấy

43

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Đề tài được tiến hành nhằm mục đích tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng
hòa tan phosphate và kali, đồng thời đánh giá một số điều kiện nuôi cấy tối ưu đến khả

respectively. In all conditions, 591 were showed the high potential P and K solublizing

activity.
Based on the macro and micro morphological characteristic and 16S
ribosome RNA sequence, 591 were preliminarily identified as Micrococcus sp.
This study also indicated the negative correlation between the P and K solublizing
and the change of pH of culture medium.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Phosphate và kali là 2 nguyên tố hóa học đa lượng thiết yếu, trong quá
trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trong đất, lượng phosphate và kali ở
dạng hòa tan rất thấp, phần lớn phosphate và kali tồn tại ở dạng không tan trong
đá, muối khoáng và trầm tích (Goldstein, 1994). Tuy nhiên, những dạng
phosphate và kali không tan này lại là nguồn dự trữ phosphate và kali cho cây,
trong điều kiện thích hợp chúng có thể chuyển thành dạng hòa tan và trở nên sẵn
sàng cung cấp cho thực vật. Một số công trình nghiên cứu khoa học đã chứng
minh vi khuẩn đóng vai trò trọng tâm trong chu trình phosphate và kali tự nhiên.
Các dòng vi khuẩn khác nhau như Pseudomonas, Agrobacterrium, Bacillus,
Rhizobium và Flavobacterium có khả năng hòa tan các hợp chất phosphate vô cơ
như tricalcium phosphate, hydroxyapatite và đá phosphate (Goldstein, 1986). Vi
khuẩn silicate có khả năng hòa tan các khoáng P, Si, Al vô cơ không tan
(Aleksandrov et al., 1967). Bên cạnh đó, theo Rajan et al. (1996) sử dụng trực
tiếp đá chứa phosphate và kali có thể có lợi cho nông nghiệp và khả thi cho môi
trường hơn phosphate và kali ở dạng hòa tan. Đá chứa phosphate và kali là nguồn

tan phosphate và kali khó tan từ đất.
1.3. YÊU CẦU
- Phân lập và nhận diện, giữ giống những chủng vi khuẩn có khả năng
phân giải phosphate và kali khó tan.
- Khảo sát và xác định khả năng sinh IAA, khả năng đối kháng với một số
chủng nấm mốc gây hại trên thực vật.
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng và khảo sát các yếu tố môi
trường ảnh hưởng đến khả năng phân giải phosphate và kali khó tan của các
chủng vi khuẩn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. CÁC DẠNG PHOSPHATE VÀ KALI TRONG ĐẤT VÀ VÒNG TUẦN
HOÀN CỦA PHOSPHATE VÀ KALI TRONG TỰ NHIÊN
2.1.1 Các dạng phospho trong đất
Phospho là nguyên tố dinh dưỡng đối với cây trồng. Phospho đóng vai trò
quan trọng trong quá trình trao đổi chất và vận chuyển các chất trong cây. Cây
thiếu phospho sẽ sinh trưởng chậm, cho năng suất thấp, phẩm chất nông sản
kém. Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng phosphate bởi cây trồng không quá 25%,
trong khi đó một lượng lớn phosphate bị cố định trong đất và chuyển thành
dạng khó hấp thụ. Lượng dự trữ phosphate trong đất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P2O5
nhưng chúng tồn tại trong đất ở dạng không tan trong nước cây khó hấp thụ.
Thành phần phosphate dễ tan và khó tan trong đất được quyết định bởi tính chất
đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ (Nguyễn Như Hà, 2005).
Hàm lượng phosphate tổng số trong đất Việt Nam khoảng 0,03 – 0,2%. Đất
bazan nâu đỏ giàu phosphate nhất (430 – 1310 mgP/kg). Đất bạc màu và đất cát

giàu mùn thì càng giàu phosphate hữu cơ. Theo Westerman (1990) trong
phosphate hữu cơ của đất, dạng phổ biến nhất là dạng phytat, có thể chiếm đến
50% tổng số phosphate hữu cơ. Tùy theo môi trường acid hay kiềm mà tồn tại
các dạng phytat khác nhau. Ở đất chua, phosphate hữu cơ chủ yếu là phytat Fe,
Al; Ở đất trung tính, đất kiềm phosphate hữu cơ tồn tại dạng phytat Ca, Mg .
Phosphate hữu cơ trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp
các hợp chất hữu cơ chủ yếu như phytin, phosphatelipid, acid nucleic. Điều
đáng chú ý là phosphate ở vi sinh vật không tham gia trực tiếp vào dinh dưỡng
cây trồng mà phải đợi vi sinh vật chết đi, tế bào bị khoáng hóa thì cây trồng mới
hấp thu được (Nguyễn Như Hà, 2005).
Khi thực hiện các quá trình khoáng hóa trong đất có sự tham gia của vi
sinh vật phân giải, phosphate vô cơ khó tan sẽ được khoáng hóa để giải phóng
ra phosphate vô cơ dễ tan, là nguồn dinh dưỡng cung cấp thức ăn cho cây trồng
(Richardson, 2001). Có 70 – 80 tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình
phân giải phosphate (Bạch Phương Lan, 2004). Thực vật không thể đồng hóa
trực tiếp phosphate hữu cơ, muốn đồng hóa được chúng phải được chuyển hóa
dưới dạng muối của acid phosphoric (H3PO4): Ca(H2PO4)2, Na2HPO4, K2HPO4,
KH2PO4. Nhưng các dạng phosphate này lại bị đất hấp phụ và vi sinh vật sử
dụng lại, nên trong đất rất ít phosphate ở dạng hòa tan. Nhiều tác giả nghiên
cứu cho rằng, nếu chất hữu cơ vùi trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate thì
qua quá trình phân giải không những hàm lượng phosphate hữu cơ trong đất
không tăng mà còn giảm xuống. Theo Kaila and Virtanen (1955), nếu chất hữu
cơ vùi xuống đất chứa ít hơn 0,2 – 0,3% P2O5 thì quá trình phân giải không tăng
lên thêm về phosphate dễ tan cho cây vì vi sinh vật sẽ sử dụng hết.
2.1.1.2. Phosphate vô cơ
Phosphate vô cơ trong đất chủ yếu tồn tại dưới dạng muối phosphate của
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


39.9

Đất thịt nặng và sét

309

332

41.4

Đất thịt trung bình

5

523

58.9

Đất thịt nặng và sét

85

579

65.4

Thành phần cơ giới đất
Đất nghèo chất hữu cơ

Đất giàu chất hữu cơ

2.1.2. Vòng tuần hoàn của phosphate trong tự nhiên
Vòng tuần hoàn của phosphate không giống như vòng tuần hoàn của Nitơ.
Trong khi nitơ luôn khan hiếm trong đất thì phosphate tồn tại nhiều trong đất ở
dạng khó phân giải (Kapoor, 1995). Nitơ được đưa vào đất nhờ vi sinh vật cố
định đạm từ không khí, còn đối với phosphate, chúng được các vi sinh vật phân
giải từ các nguồn phosphate vô cơ và hữu cơ khác nhau.
Động vật

Cây xanh
PO43- trong dung dịch đất
PO43- bị hấp thụ

Quá trình
khoáng

Hòa tan

Quá trình cố
định

Phosphate vô cơ
Cố định tạm thời
Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật
Chất hữu cơ mùn hóa
Hình 2.1. Vòng tuần hoàn phosphate trong tự nhiên
(Nguồn: Trần Văn Chính, 2010)

2.1.3. Sự chuyển hóa phosphate trong đất
2.1.3.1. Quá trình cố định phosphate trong đất
Quá trình thoái hóa phosphate là quá trình tạo thành các hợp chất

sulphat, mặt khác, khi hàm lượng phosphate trong đất cao, phosphate chủ yếu
bị giữ chặt bởi canxi cacbonat (Griffin and Jurinak 1973). Quá trình này xảy
ra phổ biến và rất nhanh. Tuy vậy, khả năng giữ phosphate bởi các muối canxi
thường yếu hơn bởi Fe và Al hydroxit. Do vậy, phosphate ở dạng này dễ dàng
được phục hồi và trở nên dễ tiêu hơn đối với cây trồng. Do đó, trên các loại
đất giàu Fe3+ và Al3+ trao đổi, quá trình giữ chặt phosphate bởi Fe và Al
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


hydroxit thường chiếm ưu thế.
Ở Việt Nam, khả năng hấp phụ phosphate của đất dao động khá mạnh,
trong khoảng từ 10 – 2656 mgP/kg, tùy theo từng loại đất. Đất cát biển có khả
năng hấp thu phosphate thấp nhất và đất lúa đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt
đất phèn có khả năng hấp thu phosphate cao nhất (Võ Đình Quang, 1999).
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định phosphate trong đất
+ pH đất:
pH đất có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hòa tan các khoáng oxide và
hydroxide trong đất cùng với sự có mặt của: Ca2+, Fe3+ và Al3+ cũng như các
cation khác vì vậy có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan phosphate trong đất. Ví
dụ: pH càng cao khả năng hòa tan phosphate sắt trong đất giảm nên hàm lượng
H2PO4- trong đất thấp (Trương Thị Cẩm Nhung, 2008).
Fe(OH)2H2PO4

Fe(OH)2+ + H2PO4-

phosphate sắt
+ Sự hiện diện của các cation trong đất:
Cùng với Ca2+, Fe3+ và Al3+, sự hiện diện của một số cation trong đất cũng

Đất kiềm

Ở pH = 7 tỷ lệ 2 loại ion này gần bằng nhau. H2PO4- dễ đồng hóa hơn
HPO42- nên về mặt lý thuyết ở pH = 5 – 6 dinh dưỡng phosphate của cây thuận lợi
nhất. Song trong đất do có mặt của nhiều ion khác mà vấn đề trở nên phức tạp hơn.
e. Sự chuyển hóa của phosphate trong đất chua
Trong đất chua nghèo chất hữu cơ: phosphate được cố định bằng oxit và
hydroxit nhôm và sắt: Fe3+, Al3+ và Mn2+ thường nằm dưới dạng hòa tan, phản ứng
với H2PO4- tạo thành hợp chất không tan cây không đồng hóa được (Goldstein , 1986;
Jones et al., 1991).
Al3+ + H2PO4- + 2H2O

2H+ + Al(OH)2.H2PO4
Không tan

Ở các loại đất rất chua, Al3+ và Fe3+ nhiều hơn các ion H2PO4- làm cho
phản ứng trên diễn ra theo chiều thuận, tạo thành phosphate không tan khiến cho
chỉ còn một lượng rất nhỏ H2PO4- trong đất cây trồng có thể sử dụng được.
Trong môi trường chua còn có hai quá trình cố định phosphate liên quan
tới sét. Đó là do sự tồn tại các ion OH- lộ trên bề mặt khoáng sét. Sự cố định này
đi kèm với việc giải phóng kiềm theo phản ứng sau:
Sét – OH + Ca(H2PO4)2

Sét – H2PO4- + Ca(OH)2

Khả năng cố định thay đổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ
tự sau đây: Illit > Kaolinit > Montmorillonit.
[Al] + H2PO4- + 2H2O

2H++ Al(OH)2.H2PO4

Ca8H2(PO4)6.5H2O +2CO2
Ca3(PO4)2 + CO2 + 6H2O

2.1.2. Các dạng tồn tại của kali và sự chuyển hóa kali trong đất
2.1.2.1 Kali trong đất
Kali là nguyên tố đa lượng với cây trồng. Nó tham gia vào nhiều quá trình
sinh lý sinh hoá quan trọng của cây như: quá trình quang hợp, tổng hợp protein,
hoạt động của một số enzyme, vận chuyển chất tan từ libe tới các cơ quan cũng
như duy trì cân bằng ion giữa bên trong và bên ngoài tế bào. Trong cây, kali
thường được tích luỹ nhiều trong thân lá. Tỷ lệ kali trong cây biến động trong
khoảng 0,5-6% chất khô. Hàm lượng kali tổng số trong đất rất khác nhau phụ
thuộc chủ yếu vào thành phần khoáng vật của đá mẹ, điều kiện phong hoá đá và
hình thành đất, thành phần cơ giới đất, chế độ canh tác, phân bón. Ðất mặn, đất
phèn, đất đỏ vàng phát triển trên đá phiến mica giàu Kali (K2O tổng số từ 2 đến
3%). đất nghèo kali là các đất xám bạc màu và một số loại đất đỏ vàng vùng đồi
núi (
chuyển biến giữa các dạng Kali trong đất. Điều này bao gồm tốc độ bổ sung
kali từ các nguồn chậm hữu dụng sang dạng dễ hữu dụng cho cây trồng. Cây
trồng hút K hòa tan trong dung dịch đất, nồng độ kali trong dung dịch thấp, cân
bằng bị phá hủy, Kali trao đổi lập tức di chuyển vào dung dịch cho đến khi cân
bằng mới được thiết lập tiến trình này được gọi là tiến trình trao đổi kali.Tiến
trình này diễn ra lập tức, nhanh chóng, vì vậy có thể xem kali trao đổi là cơ chế
đệm quan trọng cho Kali hòa tan trong dung dịch đất (Goulding, 1987).
2.2. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI PHOSPHATE VÀ KALI
TRONG ĐẤT
2.2.1 Vi sinh vật phân giải phosphate trong đất
Vi sinh vật phân giải phosphate trong đất rất phong phú và đa dạng, bao
gồm các nhóm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc (Nguyễn Xuân Thành,
2007). Nghiên cứu của Kapoor (1995) cho thấy: bổ sung một số chủng nấm sợi
có khả năng hòa tan phosphate như: Aspergillus flavus và Aspergillus niger với
vi khuẩn cố định nitơ Azotobacter sp. vào trong đất trồng đã làm tăng năng suất
hạt lúa mì lên 17.7%, trong khi đó nếu chỉ bổ sung Azotobacter sp. vào trong
đất trồng thì năng suất lúa mì chỉ tăng 9%. Reynaldo Fraga et al. (1999) cũng
đạt kết quả tương tự khi nghiên cứu sự phối hợp giữa chủng Azotobacter sp. với
các vi khuẩn phân giải phosphate thuộc các chi Agrobacterium sp., Bacillus sp.
và Pseudomonas sp. Xiao et al. (2013) đã sử dụng 4 chủng nấm men
Rhodotorula sp., Candida rugosa, Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces
rouxii được phân lập từ rễ lúa mỳ và xác định khả năng phân giải phosphate
khó tan trong đã quặng của chúng.
2.2.1.1. Vi sinh vật phân giải phosphate hữu cơ trong đất
Đất có chứa một loạt các chất hữu cơ, có thể là một nguồn chứa phosphate
cho sự phát triển của thực vật. Để có một lượng phosphate hòa tan cho dinh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12



H3PO4

H3PO4

Hình 2.4. Sơ đồ quá trình phân giải nucleoprotein
(Nguồn: Bạch Phương Lan, 2004)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13