ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

nhận được những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.
Hà nội ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên

Nguyễn Tiến Dũng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH .............................................................................................. i
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .................................................................................................... ii
MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................................. 2
1.1. BETA LACTAM ........................................................................................................ 2
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM .................................................................................... 3
1.2.1. Phản ứng Staudinger............................................................................................. 3
1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể............................................... 4
1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ........................................................ 7
1.3.1. Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym ...................................... 7
1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ................................... 8
1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại......................... 8
1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR .................................................. 9
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ........................................................... 17
1.4.1. Khái niệm ........................................................................................................... 17
1.4.2. Phân loại............................................................................................................. 17
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo.............................................................................. 17
1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo............................................................................ 18
1.4.5. DETECTOR DAD.............................................................................................. 19
1.4.6. DETECTOR MS ................................................................................................ 20
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM............................................................................................ 22
2.1. Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị. ................................................................ 22

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam............................................................................3
Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1phenylbutan-1-ol.........................................................................................10
Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol.........................................................................................10
Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA............12
Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp ..............................13
Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel .................................................................................14
Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray .....14
Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B..................................................................16
Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS.............................................................................18
Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang .............................................................19
Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). ....20
Hình 3.1. Phổ 1H của hợp chất 9a ..........................................................................32
Hình 3.2. Phổ 1H của hợp chất 9b ..........................................................................33
Hình 3.3. Phổ 1H của hợp chất 9c ..........................................................................33
Hình 3.4. Phổ 1H của hợp chất 9d ..........................................................................34
Hình 3.5. Phổ 1H của hợp chất 9e ..........................................................................35
Hình 3.6. Phổ 1H của hợp chất 9f...........................................................................35
Hình 3.7. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a .....................................................37
Hình 3.8. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b .....................................................38
Hình 3.9. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c......................................................38
Hình 3.10. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d ...................................................38
Hình 3.11. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive....................................40
Hình 3.12. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative ..................................40
Hình 3.13. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 ...............42
Hình 3.14. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 ...............42
Hình 3.15. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 ...............42
Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a ....................................................................43

Hình 3.17. Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a).................................................. 44

Chú thích

1

SKPB

Sắc ký phân bố

2

SKPD

Sắc ký pha đảo

3

SKPT

Sắc ký pha thuận

4

HPLC

High-performance liquid chromatography

5

MS


ứng tổng hợp theo phương pháp Staudinger, bằng các phương pháp hiện đại như
HPLC-MS và NMR.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. BETA LACTAM
β-lactam được phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và được chia thành
4 nhóm:
·

β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa.
o

β-lactam có chứa vòng thiazolidine được gọi tên là penams (A)

o

β-lactam có chứa vòng pyrrolidine được gọi tên là carbapenams (B)

o

β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng được gọi tên là oxapenams
hoặc clavams (C)

·

β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:
o

monobactams

2


Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam
Hợp chất chứa vòng β-lactam được ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm
thuốc kháng sinh.
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM
Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan
trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian
trong tổng hợp hữu cơ [13]. Nhiều phương pháp tổng hợp β-lactam đã được phát
triển như: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm
carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9].
1.2.1. Phản ứng Staudinger
Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức
imine, là phương pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam. Kể từ khi
được phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã được nghiên cứu
thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập
thể. Nó được áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1).
Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phương pháp tốt nhất cho quá
trình tổng hợp β –lactam [14].

Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger
3


1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể
Cơ chế của phản ứng Staudinger được đưa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả
tốt nhất [15]. Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống

ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng
đóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2). Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ
cis/trans của sản phẩm β –lactam. Các tác giả đề xuất [9], bước đóng vòng có
thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate
nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic. Tăng mật độ điện tử cho
ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng
(tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam. Mặt khác, làm giảm mật độ
electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1
và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β –
lactam. Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ
trong chọn lọc lập thể. Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tương tự thực
hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có
ảnh hưởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản
ứng Staudinge [21].
Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hưởng bởi tính chất của dung môi, các
dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi
dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans. Ngoài ra, cách ketene
5


được hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hưởng đến độ
chọn lọc lập thể của sản phẩm [27]. Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa
ketene và tác nhân imine ảnh hưởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tương
tự như nhiệt độ [19].
Một phương pháp rất hiệu quả để thu được trans- β -lactam được phát
triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) như một anion
xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4). Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl
clorua béo [28].

Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam

ra khỏi nhau.

7


1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ
Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một
tâm bất đối thường không thể tách ra khỏi nhau. Tuy nhiên, khi tham gia phản
ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản
phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách được bằng các phương pháp hóa
lý khác nhau. Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách được
đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai
đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau
bằng phương pháp kết tinh. Phương pháp này vẫn được sử dụng hiệu quả để
tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau.

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm
bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ
khác. Các đồng phân “dia” nhận được có thể tách ra bằng các phương pháp hóa
lý khác nhau. Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ được loại bỏ, thu được các
đồng phân đối quang tinh khiết.

1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại
Các đối quang có thể được tách nhờ các phương pháp sắc ký khí (GC),
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral. Bản chất của các
phương pháp này là các hỗn hợp đối quang tương tác với pha tĩnh (tâm bất đối
trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tương tác mạnh hơn với
8



trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng
phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ
nhỏ.
a). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher
Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ
không phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tín
hiệu của chúng không được phân tách trong từ trường. Để phân biệt được hai
cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất
nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyển hợp
chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của
hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau
đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đưa ra được cấu hình của
chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan9


1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để
tạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây.

Hai đồng phân dia này sẽ được phân biệt rõ trên phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este
Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trường cao, trong khi
tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ
dịch chuyển về phía trường thấp. Như vậy, người ta có thể xác định được cấu
hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu.

Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và
(R)-1-phenylbutan-1-ol

Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol
10

Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm
bất đối. Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong
phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia”. Phức dia tạo
thành có một số proton được tách ra trong từ trường và chuyển về trường thấp.
Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trường thấp của một số proton phụ thuộc
vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3.

Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt
được trong từ trường. Tuy nhiên, khi được tạo phức với tác nhân chuyển dịch
Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) được tách thành hai triplet
có cường độ tương đương nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trường phụ
thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch.
Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều được tách ra và có độ
12


chuyển dịch hóa học chuyển về phía trường thấp. Sự tách tín hiệu và độ chuyển
dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng. Đối
với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 được chuyển
dịch về phía trường cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan. Như vậy, có thể phân
biệt và xác định được tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển
dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5).

Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp
1.3.5. X-ray tinh thể
a. Giới thiệu chung
Phương pháp X-ray phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định cấu
trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ. Từ phương trình Bragg, người ta tính toán
độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục
tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lượng phân tử (n) xây

Phương pháp X-ray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hình
tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất
thường. Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phương pháp X-ray
tinh thể người ta sử dụng phương pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ
số R.
14


Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi được chiếu bức xạ tia
X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thường Friedel, lợi dụng nguyên tắc này
Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của
cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hướng (h,k,l) và hướng
ngược lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối.
Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R được xây dựng trên cơ sở hàm
thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và được
so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang. Nếu giá
trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá
trị này bằng phương pháp thống kê.
Như vậy, cả hai phương pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có
cường độ cao do ảnh hưởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử
mà chưa so sánh được những tia tán xạ yếu. Những yếu tố tán xạ yếu chỉ được
sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lượng lớn. Phương pháp X-ray tinh có thể sử
dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi.
Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, người ta có
thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với
một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt
đối. Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết được chọn để nghiên cứu trong
phương pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận được dạng đơn
tinh thể. Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng
phân tích X-ray được thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết

ngược so với B.

Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B
Ngoài ra, với các phân tử hữu cơ quang hoạt có chứa các phần mang màu
đã biết việc phân tích phổ CD cho phép xác định được cấu hình tuyệt đối của
cacbon bất đối trong phần mang màu này.

16