TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG

VIỆN SINH-NÔNG

[

HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN MẠNH TƯỜNG
LỚP: Công nghệ sinh học K13 KHÓA: 2012-2016
TÊN ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN LỌC CÁ THỂ

TRONG QUẦN THỂ F5 MANG QTL/GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CAO SẢN.

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP:
Ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: Ts: Trần Đăng Khánh
Th.s: Vũ Thị Lan Phương

Hải Phòng, năm 2015

1


LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Viện Sinh –
Nông, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam trong
thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử
trong chọn lọc cá thể trong quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Sơ đồ chu trình nhiệt của phản ứng PCR.
Hình 4.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB trên
gel agarose 0,8%
Hình 4.2. Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với chỉ thị RM445
Hình 4.3. Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với chỉ thị RM500
Hình 4.4. Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với chỉ thị RM21615

3


DANH MỤC VIẾT TẮT
DNA : Deoxyribonucleic Acid
RNA : Ribonucleic Acid
PCR : Polymerase Chain Reaction
KD : Kháng Dân
AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn
được nhân bản chọn lọc

4


RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được nhân
bản ngẫu nhiên
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh
phân cắt giới hạn
SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản
cs : Cộng sự
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

chọn giống cây trồng, các tính trạng được khảo nghiệm là những tính trạng liên
quan đến năng suất, phẩm chất của sản phẩm và chủ yếu liên quan tới việc tăng
cường tính chống chịu đối với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi, những
đặc điểm mong muốn về hình thái luôn bị ảnh hưởng từ điều kiện môi trường
hoặc không biểu hiện khi điều kiện ngoại cảnh không phù hợp. Xuất phát từ
những thực tế trên tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn
lọc cá thể trong quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông phục vụ
công tác chọn tạo giống lúa cao sản.”

6


MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.

1.2.1. Mục đích
-

Chọn được cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông trong
quần thể F5 trong chọn giống lúa cao sản của tổ hợp lai Khang Dân 18 x KC25.

-

Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử chọn lọc dòng lúa cao
sản mang QTL/gen và cho năng suất triển vọng.

1.2.2. Yêu cầu
-


quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam,..Trong đó, có
khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu hạn, úng, nóng, lạnh, sâu bệnh.
Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L) còn được gọi là lúa châu Á vì nó được
thuần hóa từ lúa dại từ ba trung tâm đầu tiên ở châu Á. Theo đặc điểm lúa trồng
Việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica.



Đặc điểm hình thái và sinh trưởng của lúa
Đặc điểm hình thái
Bộ rễ lúa thuộc loại rễ chùm. Những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành có

-

màu vàng nâu và nâu đậm, rễ đã già có màu đen.
Thời kỳ mạ: Nếu mạ gieo thưa, rễ mạ có thể dài 5-6 cm. Tiêu chuẩn của mạ tốt là

-

bộ rễ ngắn,nhiều rễ trắng.
Thời kỳ sau cấy: Bộ rễ tăng dần về số lượng và chiều dài ở thời kỳ đẻ nhánh, làm

2.1.2.

đòng.

8


-

+

*
-

hơn 5 mm được xem là lóng dài.
Số lóng dài: Từ 3-8 lóng. Theo giải phẫu ngang lóng, lóng có một khoảng trống
lớn gọi là xoang lỏi.
Chiều cao cây, thân:
Chiều cao cây
Được tính từ gốc đến mút lá hoặc bông cao nhất.
Chiều cao thân
Được tính từ gốc đến cổ bông.
Chiều cao thân và chiều cao cây liên quan đến khả năng chống đổ của giống
lúa.
Nhánh lúa
Cây lúa có thể đẻ nhánh khi có 4-5 lá thật. Ở ruộng lúa cấy, sau khi bén rễ hồi
xanh cây lúa bắt đầu đẻ nhánh. Lúa kết thúc đẻ nhánh vào thời kỳ làm đốt, làm
đòng.

9


-

Từ cây mẹ đẻ ra nhánh con (cấp 1), nhánh cấp 1 đẻ nhánh cấp 2 , nhánh cấp 2 đẻ
nhánh cấp 3. Những nhánh hình thành vào giai đoạn cuối thường là nhánh vô

-


Cuối thời kỳ đẻ nhánh - làm đòng: khoảng 12 - 15 ngày / lá. cây lúa trỗ bông
cũng là lúc hoàn thành lá đòng.
Số lá trên cây phụ thuộc chủ yếu vào giống, thời vụ cấy, biện pháp bón phân

*

và quả trình chăm sóc. Thường số lá của các giống:
Giống lúa ngắn ngày: 12 - 15 lá
Giống lúa trung ngày: 16 - 18 lá
Giống lúa dài ngày: 18 - 20 lá
Chức năng của lá
Lá ở thời kỳ nào thường quyết định đến sinh trưởng của cây trong thời kỳ đó.
Ba lá cuối cùng thường liên quan và ảnh hưởng trực tiếp đến thời kỳ làm đòng và

*
-

hình thành hạt.
Chức năng của bẹ lá
Chống đỡ cơ học cho toàn cây
Dự trữ tạm thời các Hydratcacbon rước khi lúa trỗ bông.
Lá làm nhiệm vụ quang hợp, chăm sóc hợp lí, dảm bảo cho bộ lá khoẻ, tuổi
thọ lá (nhất là lá đòng), lúa sẽ chắc hạt, năng suất cao.
10


-

Sinh trưởng của lúa
Nếu tính theo thời kỳ sinh trưởng thì cây lúa có 3 thời kỳ sinh trưởng chính:


Giai đoạn phân hoá hoa.

-

Giai đoạn trỗ bông.

-

Giai đoạn nở hoa thụ phấn, thụ tinh.

-

Giai đoạn hạt chín sữa.

-

Giai đoạn hạt chín sáp.

-

Giai đoạn hạt chín hoàn toàn.

2.2.

Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống

2.2.1.

Chỉ thị phân tử

phát hiện các gen mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ ngay cả khi
chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình. Vì vậy, chỉ thị phân tử được coi là chỉ tiêu
phản ánh chân thật bản chất di truyền (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005)
[7]. Các chỉ thị phân tử DNA bao gồm:
- Chỉ thị phân tử không dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP
12


- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như AFLP, RAPD,
STS, SSR...
Trong đó chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu di truyền học, sinh thái học, phân loại và di truyền học tiến hoá, chọn
giống... do đặc điểm đơn giản và dễ sử dụng bởi PCR, sau đó thực hiện trên gel
điện di biến tính để xác định kích thước alen và mức độ thông tin cao được cung
cấp bởi một số lượng alen lớn trên locus.
•

Ưu điểm của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái
Chỉ thị phân tử rõ ràng không bị ảnh hưởng tác động của môi trường và điều
kiện sống của cây trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng. So với chỉ thị hình thái,
chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có các ưu thế sau:
Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai
đoạn nào và ở bất kì mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể.
Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kì lớn, trong khi chỉ thị hình thái là hạn
chế.
Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với những hiệu
ứng có hại, trong khi sự đánh giá của các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với
các hiệu ứng phụ không mong muốn.
Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân
biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của chị thị hình thái

trải qua một cuộc cách mạng thầm lặng trong những năm gần đây.
(Mackill và cs, 2006) [19] đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị
phân tử (MAS) là sử dụng chỉ thị DNA liên kết chặt với locus mục tiêu để thay
cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị DNA có thể dự đoán kiểu
hình một cách đáng tin cậy. Hay nói cách khác, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là
việc sử dụng chỉ thị di truyền để kiểm soát khu vực chứa bộ gen mã hoá cụ thể
đặc điểm của cây trồng. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus mục tiêu
để xác định tính trạng mong muốn thay cho kiểm tra hay đánh giá kiểu hình. Để
việc chọn giống có hiệu quả, phải xác định được chỉ thị phân tử đa hình giữa
giống bố mẹ và các cá thể trong quần thể phân tích. Mức độ xác định chỉ thị
phân tử đa hình phụ thuộc vào hệ thống chỉ thị được sử dụng. Với chỉ thị phân
14


tử, cho phép các nhà chọn giống xác định được chính xác các gen/locus gen quy
định những tính trạng mong muốn. Các gen/locus gen này cũng sẽ được chuyển
vào các giống mới trong quá trình chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử.
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà
chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân
tử. Trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, quá trình chọn lọc được dựa trên cơ sở
các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính trạng cần quan tâm.
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống đã trở nên hữu hiệu không chỉ
đối với các tính trạng được điều khiển bởi các gen chính mà đối với cả những
tính trạng số lượng được điều khiển bởi các gen phụ hay các QTLs.
Hiệu quả cải tiến cây trồng sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với chọn giống cổ
điển, nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn, mà
thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó. Phương pháp này cho phép
thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn. Các nhà chọn giống có thể
rút ngắn thời gian đánh giá kiểu hình, tập trung chọn lọc những mục tiêu quan
trọng khác có giá trị về mặt kinh tế. Nếu so sánh với chọn lọc kiểu hình, MAS có

được gọi là chọn giống nhờ chỉ thị (Marker assisted breeding/MAB), cho dù
MAS không chắc chắn là đáp án cho tất cả cá lĩnh vực chọn giống, tuy nhiên
MAS vẫn là một bước tiếp cận đầy hứa hẹn cho phương pháp chọn giống truyền
thống.
•

Nội dung chỉ thị phân tử

+

Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP marker (Restriction Fragment Length
Polymorphism – Đa hình chiều dài đoạn phân cắt)
Các chỉ thị RFLP được sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ di truyền và đến
nay vẫn được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về genome nhờ những ưu điểm
16


của nó. Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong
nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh của người (Vương Đình Tuấn
và cs, 2000) [8]. Các đa hình RFLP sinh ra bởi các đột biến tự nhiên ở những
điểm cắt enzym giới hạn trong DNA bộ gen, ví dụ như đảo đoạn, thêm đoạn, mất
đoạn, hoặc mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc
vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Mỗi một loài
sinh vật có một bộ DNA genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng
những enzyme giới hạn để cắt phân tử DNA của hệ gen, người ta có thể nhận
biết những đoạn DNA có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai DNA với những
mẫu dò (prope tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử Aa. Đây là đặc điểm ưu
việt và đáng tin cậy của loại chỉ thị RFLP và thường được dùng để kiểm tra các
chỉ t) giúp nhận biết được những đoạn DNA có chiều dài khác nhau. Chỉ thị
RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng

ngẫu nhiên đó có thể kết cặp được.
Tuy nhiên, do phản ứng PCR chỉ có thể nhân được 1 đoạn DNA có kích thước
tối đa chừng 4-5 kb, nghĩa là phản ứng PCR xảy ra chỉ khi khoảng cách tối đa
giữa mồi thuận và mồi nghịch không vượt quá 4-5 x 103 nucleotide. Như vậy đối
với hệ gen có kích thước khoảng 109 nucleotide, phản ứng PCR với mỗi mồi
ngẫu nhiên xác định chỉ cho sản phẩm trung bình là vài băng DNA. Sau khi phản
ứng PCR kết thúc, sản phẩm PCR (các băng DNA) được phân tách bằng điện di
trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím.
Do các băng DNA của RAPD là không xác định, nên người ta coi mỗi băng
DNA với kích thước đặc trưng là tương đương với 1 lôcut và locus đó chỉ có 1
alen. Như vậy RAPD là chỉ thị trội, biểu hiện bởi sự có mặt (ký hiệu bằng “1”
hay “+”) hay vắng mặt (ký hiệu bằng “0” hay “- ”) những băng ADN đặc trưng.
Do đó chỉ thị RAPD không phân biệt được thể dị hợp tử. Đó là hạn chế của loại
chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP. Ngoài ra chỉ thị RAPD, do sử dụng mồi
ngắn (10 gốc) và nhiệt độ kết cặp thấp, nên độ nhạy của PCR bị phụ thuộc vào
điều kiện của phản ứng, và phản ứng PCR thường có độ chính xác kém, nhất là
khi phải thao tác với những sinh vật có hệ gen lớn, thí nghiệm cần được lặp lại
18


nhiều lần để có kết quả chính xác. Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biết
những thông tin về trình tự DNA cần thiết để thiết kế mồi và thí nghiệm có chi
phí rẻ với thao tác nhanh gọn và đơn giản.
*

Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)
Vi vệ tinh, hay ở thực vật còn gọi là Simple Sequence Repeates (SSR) (ở người
và động vật, người ta gọi “vi vệ tinh” là “Short Tandem Repeats” – STR) là
những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2
đến 6 nucleotid, theo kiểu lặp lại ngắn vài chục lần. SSR đã được nghiên cứu lần


Chọn lọc bố mẹ và thực hiện lai tạo, ít nhất một hoặc cả hai có alen chỉ thị DNA
cho tính trạng mong muốn.

-

Phát triển quần thể F1 và xác định sự có mặt của các alen chỉ thị để loại bỏ các
cây lai không đủ điều kiện.

-

Phát triển quần thể F2 phân ly, sàng lọc các cá thể bằng các chỉ thị và thu các cá
thể mang alen chỉ thị mong muốn.

-

Trồng cây F2:3 và sàng lọc các cá thể bằng chỉ thị. Số lượng lớn cá thể F3 trong
phạm vi một hàng có thể được sử dụng cho việc sàng lọc chỉ thị nhằm xác định
hơn nữa trong trường hợp cần thiết nếu thấy cây F 2 trước là đồng hợp tử với chỉ
thị. Chọn lọc và thu các cá thể với alen chỉ thị và các tính trạng mong muốn
khác.

-

Trong thế hệ tiếp theo (F4 và F5) thực hiện sàng lọc chỉ thị và chọn lọc tương tự
như ở thế hệ F2:3, nhưng cần chú ý với những cá thể có đặc tính nổi trội của các
dòng đồng hợp tử.

-



Kết hợp kết quả của chỉ thị với một số tiêu chí chọn lọc khác, chọn lọc các con
lai của quần thể tin cậy bởi sàng lọc alen chỉ thị và các cá thể trội trong các quần
thể của chương trình lai tạo.

2.2.3.

Phương pháp MAS
Phương pháp MAS và sự sàng lọc trong các thế hệ chọn giống
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với
một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện
hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu
hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn,
người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết
với các gen đó.
Sự phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống
khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những
cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay
vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc hiệu mà không
cần đánh giá kiểu hình. Phương pháp này còn có thể giúp ta chọn lọc những cá
thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong
cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác này thường không thể phát
hiện được bằng các phân tích kiểu hình. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả
trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa cùng lúc nhiều gen khác
nhau vào một genôm đích. Nguồn gen mới nhập được phát hiện gián tiếp thông
qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó.
21


Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương


•

Chuyển một vùng gen, đối với những tính trạng quan tâm được quy định bởi đơn
gen hay một gen chịu trách nhiệm phần lớn biểu hiện kiểu hình của tính trạng.

•

Trong chọn giống lúa, MAS ngày càng được sử dụng rộng rãi để rút ngắn các
quá trình phục hồi các dòng bố mẹ trong các chương trình lai lại. MAS sẽ giúp
cho quá trình những gen quan tâm vào các giống có cấu trúc hệ gen khác nhau
một cách nhanh chóng do MAS cho phép tối ưu hoá số cây cần chọn, số lần lai
trở lại, hoặc loại bỏ các cá thể không liên quan đến những gen quan tâm, các chỉ
thị phân tử có thể được áp dụng chọn giống nhằm phân biệt giữa các cá thể trong
một quần thể phân ly và xác định giống. Khi so sánh với chọn giống truyền
22


thống, vai trò trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở
các điểm:
-

Phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử. Để phân biệt các kiểu gen trong
phương pháp chọn giống truyền thống là dựa trên chọn lọc kiểu hình. Chọn lọc
kiểu hình ít hiệu quả hơn trong việc phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử.
Khả năng xác định sự khác nhau là cần thiết tại một số bước trong các chương
trình chọn giống.

-


23


Cho đến nay, ứng dụng MAS đã đạt được nhiều thành công khác nhau trong
chọn giống cây trồng, tuy nhiên để ứng dụng MAS trở nên phổ biến thì vẫn có
một số tồn tại. Hạn chế lớn nhất là rào cản tồn tại của MAS là cải tiến tính trạng
đa gen. Lý do chính tồn tại của rào cản này là xác định vị trí chính xác QTL trên
bản đồ. Vì QTL thiếu các ảnh hưởng kiểu hình riêng biệt và không thể lập bản đồ
QTL như thể chúng là locus định lượng hoặc locus di truyền Menden riêng biệt.
Mặc dù các công cụ tính toán thống kê phức tạp được sử dụng, khả năng luôn
tồn tại là vị trí hợp lý tối đa theo quy định có thể không là vị trí chính xác của
QTL. Một trong những thách thức chính trong chọn giống các tính trạng định
lượng là bị ảnh hưởng lớn từ điều kiện môi trường biểu hiện lên tính trạng đó, do
vậy có tính di truyền thấp. Các nghiên cứu cũng chứng minh rằng MAS là hiệu
quả nhất khi các giá trị chọn giống dự đoán bởi chỉ số giá trị QTL kiểu gen, như
từ kiểu gen chỉ thị liên kết và ước lượng hiệu ứng QTL và các giá trị kiểu hình.
2.3.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CÔNG
TÁC CHỌN TẠO GIỐNG

2.3.1.

Tình hình nguyên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trên thế giới
Từ hơn hai thập kỷ trước người ta đã dự đoán rằng công nghệ chỉ thị phân tử
sẽ định hình lại các chương trình chọn giống và thúc đẩy nhanh trong chọn lọc
các tính trạng kinh tế của cây trồng. Khoảng 14 năm trước đây (Concibido và cs,
1996) [15] đã mô tả ứng dụng MAS chọn tạo giống đậu tương kháng u nang
tuyến trùng (Heterodera glycines). Tuy nhiên, trong khi đó MAS được sử dụng
hiệu quả hơn trong chọn tạo các tính trạng đơn gen, nhưng lại không hiệu quả

còn là những thách thức (Li và cs, 2004) [17].
Trong số các ức chế phi sinh học, như hạn hán và nhiễm mặn là một trong
những ức chế chính gây thiệt hại kinh tế lớn. Một tiến bộ đạt được nhờ ứng dụng
25