Trnh Thu Hng

Cao hc K17 Sinh hc

Lời Cảm ơn
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lai
Thành, chủ nhiệm bộ môn Tế bào - Mô Phôi - Lý sinh, đồng thời là trởng
phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống.
Thầy đã trực tiếp hớng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện
luận văn này. Thầy đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi cả trong công việc, cũng
nh trong quá trình tôi thực hiện thí nghiệm tại phòng Công nghệ Tế bào Động
vật.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ và sinh viên Phòng
Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự
sống, những ngời luôn bên tôi trong công việc, luôn nhiệt tính giúp đỡ tôi trong
quá trình tôi làm việc và nghiên cứu tại phòng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Bùi Thị Việt Hà , chủ nhiệm bộ môn
Vi sinh vật cùng tập thể các anh chị em ở phòng thí nghiệm Vi
sinh - Khoa Sinh học - Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, những ngời đã
nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin giửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy cô giáo trong Khoa
Sinh học - Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo

Lun vn thc s - Khoa Sinh hc


Trnh Thu Hng

Cao hc K17 Sinh hc



G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

RNA

Ribonucleic acid

mRNA

Messenger Ribonucleic acid

tRNA

Transfer ribonucleic acid

VSV

Vi sinh vật

i

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học



Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH......................................4
1.1.1. Chất kháng sinh....................................................................4
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS..........................................5
1.1.3. Phân loại CKS......................................................................6
1.1.4. Cơ chế tác dụng của CKS....................................................7
1.1.4.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào.....................................8
1.1.4.2. Phá hủy màng sinh chất..............................................9
1.1.4.3. Ức chế tổng hợp protein...........................................10
1.1.4.4. Ức chế các con đường trao đổi chất.........................11
1.1.4.5. Ức chế sự tổng hợp acid nucleic..............................12
1.1.5. Thực trạng kháng kháng sinh của các chủng VSV gây bệnh
.................................................................................................14
1.2. PEPTIDE KHÁNG KHUẨN CECROPIN.................................15
1.2.1. Nguồn gốc của peptide kháng khuẩn.................................15
1.2.2. Phân bố tự nhiên của peptide kháng khuẩn.......................16
1.2.3. Cấu tạo của peptide kháng khuẩn......................................18
1.2.4. Tác động của peptide kháng khuẩn....................................19
1.2.4.1. Cơ chế tác động........................................................19
1.2.4.2. Sự tác động chọn lọc của peptide kháng khuẩn.......24
1.2.5. Ứng dụng của peptide kháng khuẩn...................................26
1.2.6. Peptide kháng khuẩn cecropin B........................................26
1.3. CHUYỂN GEN CECROPIN B VÀO TẾ BÀO VÀ CƠ THỂ
ĐỘNG VẬT..................................................................................28
1.4. GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT ĐƯỢC DÙNG
ĐỂ CHUYỂN GEN CECROPIN B..............................................30

.................................................................................................39
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau:.........................39
2.2.2. Phương pháp thu môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã
được chuyển gen cecropin B:..................................................40
2.2.3. Phương pháp cô đặc môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột
đã được chuyển gen cecropin B..............................................41

iv

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

2.2.4. Phương pháp nhân nuôi và cất giữ vi khuẩn......................41
2.2.5. Phương pháp đục lỗ...........................................................42
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ..................44
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau:..........................44
2.2.6.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chất
kháng sinh...............................................................................44
2.2.6.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptide
cecropin B:..............................................................................45
2.2.6.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của CKS
kết hợp với peptide cecropin B:..............................................46
2.2.6.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của môi
trường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B:
.................................................................................................47
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................49


Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA
Hình 1. Cấu trúc peptide kháng khuẩn................................................19
Hình 2. Mô hình hoạt động kháng khuẩn của các peptide kháng
khuẩn...................................................................................................20
Hình 3. Cơ chế hoạt động của peptide kháng khuẩn...........................22
Hình 4. Cơ sở của chọn lọc phân tử tế bào của peptide kháng khuẩn
[54] . ....................................................................................................25
Hình 5. Cấu trúc của nguyên bào sợi hoạt động [57]..........................31
Hình 6. Kết quả đánh giá tác động của ampicillin và puromycin đối
với hai chủng vi khuẩn Shigella flexneri (A) và Vibrio cholerae (B)
..............................................................................................................50
Hình 7. Kết quả thăm dò hoạt tính kháng khuẩn của peptitde
cecropin B với vi khuẩn Escherichia coli.........................................52
Hình 8. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng
sinh ampicillin và peptitde cecropin B với vi khuẩn Vibrio
cholerae...............................................................................................53
Hình 9. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của peptitde
cecropin B kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với hai chủng
VSV Vibrio cholerae và Moraxella catarrhalis..............................55
Hình 10. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của peptitde cecropin B
kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với chủng vi khuẩn Vibrio
cholerae...............................................................................................56

các loại kháng sinh mới ngày càng ít đi và đã bắt đầu thời điểm mà các kháng
sinh có mặt không đủ để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Trước tình trạng bế tắc của việc tìm kiếm thuốc kháng sinh, các nhà
khoa học nhận thấy một triển vọng mới đầy hứa hẹn là các peptide kháng
khuẩn. Hiện nay, các peptide kháng khuẩn được coi như nguồn “kháng sinh
tự nhiên” của sinh giới đã được phát hiện ở nhiều loài sinh vật khác nhau.
Thuộc nhóm peptide này, Cecropin đã được phân lập đầu tiên từ nhộng bướm
tằm Hyalophora cecropia bị lây nhiễm vi khuẩn, và sau đó là ở nhiều loại côn
trùng 2 cánh.
Cecropin là peptide kháng khuẩn có hoạt tính mạnh, nó tác động lên cả
vi khuẩn Gram âm và Gram dương [9]. Cấu trúc và cơ chế hoạt động độc đáo
cho phép chúng dễ dàng kết hợp với màng của tế bào vi khuẩn, nấm và kí
sinh trùng, hình thành các lỗ trên màng và tiêu diệt các tác nhân đó. Gen mã
hóa cho một số cecropin được thiết kế và tổng hợp đã cho thấy hiệu quả
chống bệnh ở động vật và thực vật do vi khuẩn gây nên. Gen cecropin đã
được sử dụng để tạo ra thực vật biến đổi gen (như khoai tây, thuốc lá) biểu
hiện sự tăng cường tính kháng khuẩn hoặc nấm.
Họ cecropin gồm có ba nhóm chính là cecropin A, B và D [11]. Trong
đó cecropin B được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Với tính hiệu
quả trong việc kiểm soát mầm bệnh sinh ra do tác nhân vi khuẩn và côn trùng,

1

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học


1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH
1.1.1. Chất kháng sinh
CKS (Chất kháng sinh - antibiotic) là các hợp chất hóa học do một số
VSV sinh ra mà ngay ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt
các VSV khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc...) một cách chọn lọc [1].
Một CKS tác động lên cả vi khuẩn G(+) lẫn vi khuẩn G(-) và nấm được
gọi là một CKS phổ rộng. Các CKS phổ hẹp chỉ tác dụng lên một nhóm VSV,
chẳng hạn vancomycin, một glycopeptide.
Trước đây, CKS được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng có
nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn). Những năm gần đây với
những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều CKS đã được tạo ra theo con
đường bán tổng hợp (ampicillin) hoặc tổng hợp mới hoàn toàn
(chloramphenicol) [41].
Như vậy, CKS là các chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc
tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Mỗi CKS thường chỉ có tác
dụng với một nhóm VSV nhất định [4].
Số lượng CKS cách đây 1/4 thế kỷ chỉ khoảng vài trăm loại, nhưng đến
năm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000. Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm
2.000 các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ
VSV. Ước tính số lượng thực sự của các chất này phải lên đến trên 15.000
chất [30].

4

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học



Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

học (1975) đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được
những thành tựu lớn lao.

1.1.3. Phân loại CKS
CKS có thể được phân loại theo nhiều cách tùy thuộc vào tiêu chí của
các nhà nghiên cứu. Các nhà nghiên cứu dược liệu và các thầy thuốc muốn
phân loại theo hoạt tính sinh học của CKS (CKS kháng khuẩn, CKS kháng
nấm, CKS phổ rộng, CKS phổ hẹp, CKS kháng vi khuẩn G(-), CKS kháng vi
khuẩn G(+) ...). Các nhà hóa sinh, sinh học phân tử muốn phân loại theo cơ
chế tác động của CKS. Các nhà VSV muốn phân loại theo sản phẩm vi sinh
hay con đường sinh tổng hợp. Các nhà hóa học muốn phân loại theo các đặc
tính sinh lý, sinh hóa và nhiều tính chất khác dựa trên việc xác định rõ cấu
trúc hóa học.
Thông thường CKS được phân loại ra thành một số nhóm quan trọng
sau:
- Nhóm β – lactam: về cấu trúc chúng đều có vòng β – lactam. Nhóm
này bao gồm:
+ Các penicillin: gồm có Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin,
Cloxacillin ...
+ Các cephalosporin: có 4 thế hệ I, II, III, IV. Thế hệ I, II chủ yếu để
điều trị các vi khuẩn G(+), thế hệ III, IV chủ yếu để điều trị vi khuẩn G(-).
Gồm có: Cefadroxil, Cephalexin, Cefaclor, Cefixim, Ceftriaxon ...

6

VSV. Các CKS có thành phần và cấu trúc hóa học đặc trưng nên không có
một cơ chế tác dụng chung của các CKS đối với tất cả các VSV. Đặc tính và
cơ chế tác dụng của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học của từng chất, nồng
độ và cấu trúc hiển vi của VSV. Các chất có bản chất hóa học khác nhau thì
có ảnh hưởng khác nhau lên VSV, còn các chất có bản chất hóa học gần giống
nhau thì có hoạt phổ tương tự nhau. Một số CKS khi ở nồng độ thấp thì không
có tác dụng ức chế mà còn có tác dụng kích thích sinh trưởng của VSV.
Ngoài ra cùng một CKS nhưng ở các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác dụng
lên VSV khác nhau.
Mỗi CKS có đích tác dụng và cơ chế tác dụng riêng nhằm ức chế hoặc
tiêu diệt hoàn toàn VSV kiểm định bằng cách tác động vào một hay nhiều
bước của quá trình tổng hợp. Có thể phân loại thành các cơ chế tác động sau:

7

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

1.1.4.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào
Thành tế bào vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp
suất thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglican
(PG). PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polysaccarit bao gồm đơn
phân là các dẫn xuất của đường glucose nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách
liên tục (NAG – NAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi
polysaccarit của PG phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptide
ngắn giữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân

khuẩn G(-) nên đã khắc phục được nhược điểm trên. Tế bào người không có
PG nên các kháng sinh β – lactam rất ít độc cho người [45].
Các CKS khác như vancomycin hay CKS bán tổng hợp cycloserin ức
chế sự hình thành tế bào theo một cách khác. Chúng cản trở trực tiếp sự hình
thành cầu D – alanin – D – alanin liên kết các tiểu phần NAM của các vi
khuẩn G(+). Tuy nhiên các vi khuẩn không có cầu D – alanin – D – alanin
kháng tự nhiên với các kháng sinh này.
Một CKS ức chế sự tổng hợp thành tế bào theo cách khác là bacitracin.
CKS này ngăn cản sự vận chuyển của các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị
trí sinh trưởng của thành tế bào. Cũng như các kháng sinh β – lactam,
vancomycin, cycloserin và bacitracin làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào
làm cho tế bào vi khuẩn bị phân giải do áp suất thẩm thấu [45].
1.1.4.2. Phá hủy màng sinh chất
Một số CKS phá võ màng sinh chất của các tế bào đích bằng cách
tương tác với màng sinh chất và làm tổn thương tính nguyên vẹn của nó. Đây
là cơ chế hoạt động của một nhóm chất gọi là polyen. Amphotericin B là một
polyen có khả năng kháng nấm vì nó gắn với ergosterol – thành phần cấu tạo
nên màng sinh chất của nấm và tạo thành các lỗ rò trên màng. Do đó nội quan
của màng thất thoát ra môi trường bên ngoài. Màng sinh chất của tế bào người
và động vật có thể bị tổn thương bởi amphotericin B vì chúng chứa
cholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự như ergosterol, mặc dù cách
liên kết của amphotericin B với cholesterol hơi khác so với ergosterol.

9

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng




Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của
ribosome gồm các aminogicoside và các tetracyclin. Aminoglycoside bao
gồm streptomycin, gentamycin, neomycin, kamacycin, tobramycin, ... Chúng
gắn vào tiểu phần 30S của ribosome, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra
sự bắt cặp không chính xác giữa các codon của mRNA và các anticodon của
tRNA tương ứng. Kết quả là làm cho mã di truyền trên phân tử mRNA bị đọc
sai. Ví dụ dưới tác dụng của streptomycin, codon UUU mã hóa cho
phenylalanin bị đọc sai thành AUU mã hóa cho isoleucin. Tetracylin phong
bế vị trí gắn của phân tử RANt với RANm ở tiểu phần 30S, ngăn cản sự bổ
sung các acid amin vào chuỗi polypeptide đang được kéo dài [34].
Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S của
ribosome. Chloramphenicol và một số CKS tương tự phong bế vị trí hoạt
động của enzyme xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptide giữa các acid amin
trong chuỗi polypeptide đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành acid amin hoàn
chỉnh. Clindamycin và các tác nhân kháng khuẩn macrolit bao gồm
erythromycin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của ribosome từ
codon này đến codon kế tiếp. Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự
tổng hợp protein bị dừng lại.
1.1.4.4. Ức chế các con đường trao đổi chất
Hầu hết các CKS loại này đều có cấu trúc tương tự các chất trao đổi
bình thường của tế bào như acid amin, coemzyme nên được gọi là các chất
trao đổi tác dụng theo kiểu ức chế cạnh tranh. Ở nhiều VSV acid para –
aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng enzyme dẫn đến sự tổng hợp
tetrahydrofolic (THF), một dạng của acid folic đóng vai trò như một

actinomycin gắn với DNA ức chế sự tổng hợp DNA và phiên mã không chỉ ở
các tế bào vi khuẩn mà cả với con người.
Nhìn chung các CKS này không được dùng để điều trị các bệnh truyền
nhiễm. Tuy nhiên chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu quá trình sao
chép của DNA hoặc sử dụng nghiêm ngặt để làm chậm sự phát triển của tế
bào ung thư.

12

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Các kháng sinh tổng hợp như quinolon và fluoroquinolon có khả năng
ức chế đặc hiệu DNA của tế bào prokaryote mà ít ảnh hưởng đến tế bào
eukaryote. Những kháng sinh này ức chế hoạt động của enzyme tháo xoắn sợi
DNA mạch kép trong quá trình sao chép DNA của tế bào. Ví dụ ciprofloxaxin
được kê đơn trong các trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng
đường tiết niệu hoặc trong các trường hợp nghi mắc bệnh than.
Các kháng sinh khác ức chế hoạt động của RNA polymerase trong quá
trình sinh tổng hợp RNA từ DNA mạch khuôn. Một số kháng sinh bao gồm
rifampin kết hợp mạnh mẽ với RNA polymerase của prokaryote nhưng ít ảnh
hưởng đến RNA polymerase của eukaryote. Kết quả là rifampin độc với vi
khuẩn gây bệnh hơn so với con người. Rifampin được sử dụng chủ yếu để
điều trị bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra. Clofazimin
gắn với DNA của vi khuẩn Mycobacterium leprae gây bệnh phong và làm cản
trở quá trình sao chép cũng như phiên mã bình thường của tế bào vi khuẩn.

tấn/năm. Trong đó sản lượng penicillin các loại là 17.000 tấn, tetracylin 5.000
tấn, ... [17]. Đến nay, nhiều vi khuẩn đã kháng với penicillin, do thuốc bị lạm
dụng, sử dụng quá mức hay không đúng yêu cầu. Một số vi khuẩn không còn
nhạy cảm với 8 hoặc 10 kháng sinh khác nhau. Bệnh lao, một thời bị
streptomycin khống chế, nay đã trỗi dậy với đại dịch AIDS và giết hại khoảng
3 triệu người hàng năm. Hiện nay, muốn tránh được tình trạng kháng thuốc,
cần phối hợp cả 2 hay 3 kháng sinh, hoặc phải liên tục có những kháng sinh
mới. Tiếc rằng từ năm 1970 sáng kiến đã lụi dần.
Có nhiều yếu tố gây nên tình trạng kháng kháng sinh. Một trong những
nguyên nhân kháng thuốc là việc sử dụng ồ ạt kháng sinh trong chăn nuôi để
chữa bệnh và bổ sung với liều lượng thấp các thuốc kháng sinh vào thức ăn để
thúc đẩy tăng trưởng gia súc. Năm 1974 Châu Âu đã cấm sử dụng penicillin,
tetracylin và nhiều kháng sinh khác để nuôi thúc súc vật. Sự xuất hiện ngày
càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh
mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” [50].
14

Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học


Trịnh Thu Hằng

Cao học K17 Sinh học

Ngày càng có nhiều chủng VSV kháng kháng sinh. Báo cáo của WHO
cho thấy, mỗi năm trên thế giới ước tính có thêm 440.000 ca nhiễm mới bệnh
lao đa kháng thuốc gây ít nhất 15.000 ca tử vong. Ở Việt Nam con số này là
khoảng 5.900 ca nhiễm lao đa kháng thuốc gây tử vong ít nhất 1.800 ca mỗi
năm. Nghiêm trọng hơn là lao siêu kháng đa thuốc đã xuất hiện ở 58 quốc gia.
Hiện tượng kháng thuốc điều trị sốt rét, HIV, nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễm