BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
tài
XÁC ĐỊNH LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN (SLGL) PHÂN LẬP TỪ BÒ TẠI
MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG, TÂY NGUYÊN – VIỆT NAM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP VÀ HÌNH THÁI HỌC

Giáo viên hướng dẫn: ThS. Đỗ Ngọc Ánh
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Khánh Hòa
p: 11-01

HÀ NỘI – 2015


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Lãnh đạo, chỉ
huy và các cán bộ thuộc Bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng, Ban giám đốc Trung
tâm nghiên cứu Y Sinh Dược Học – Học viện Quân y.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Thạc sĩ Đỗ Ngọc Ánh
– Giảng viên Bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng – Học viện Quân y,
người thầy luôn theo sát, tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
để em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các anh/chị kĩ thuật viên, đặc biệt là chị

1.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 6
1.2.3. Vòng đời sinh học ............................................................................................ 7
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DO SLGL........................................................................... 8
1.3.1. Bệnh do SLGL ở động vật ................................................................................ 8
1.3.2. Bệnh do SLGL ở người .................................................................................... 9
1.4. VAI TRÒ CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH LOÀI................................................................... 11
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL ..................................................... 11
1.5.1. Phương pháp hình thái................................................................................... 11
1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử ...................................................................... 12
1.5.3. Nghiên cứu xác định loài ở Việt Nam. ............................................................ 14

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 15
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp đo kích thước các chỉ số hình thái ........................................... 19
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử PCR-RFLP ................................................... 19
2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................ 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 27
3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁICỦA SLGL ......................................................... 27
3.1.1. Kích thước chiều dài ...................................................................................... 27


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp

3.1.2. Kích thước chiều rộng .................................................................................... 28
3.1.3. Chỉ số chiều dài/chiều rộng ............................................................................ 29

BW

Body width (Chiều rộng cơ thể)

CS

Cộng sự

COX1

Cytocorome c oxidase subunit 1

ĐL

Đắc Lắc

KTS

Ký sinh trùng

Nad1

Nicotinamide dehydrogenease sunbunit 1

NA

Nghệ An

PCR


µl

Microlit


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/ bò ................................................................... 4
Bảng 3.1. Kích thước chiều dài của SLGL............................................................. 27
Bảng 3.2. Kích thước chiều rộng của SLGL .......................................................... 28
Bảng 3.3. Tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của SLGL .................................................... 29
Bảng 3.4. So sánh tỷ lệ BL/BW ở nghiên cứu này với nghiên cứu ở 1 số nước ...... 29
Bảng 3.5. Kích thước đoạn từ giác bụng đến cuối thân .......................................... 30
Bảng 3.6. So sánh chỉ số VS-P ở nghiên cứu này với nghiên cứu ở 1 số nước ....... 30
Bảng 3.6. Số lượng và kết quả chạy PCR .............................................................. 34
Bảng 3.7. Số lượng và kết quả cắt giới hạn sản phẩm PCR ................................... 35


Nguyễn Thị Khánh Hòa

Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành ........................................................ 6
Hình 1.2. Hình thể trứng sán lá gan lớn ................................................................... 7
Hình 1.3. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn ....................................................... 8
Hình 2.1.Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 16


Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu TN5 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank. ............................................ 41
Hình 3.18. Trình tự đoạn ADNthu được với mồi JB4.5 của mẫu PY9 ................... 42
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự gen COX1 của mẫu PY9 với trình tự mẫu F.
gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) trên Genebank ............................................. 42


MỞ ĐẦU
Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) là bệnh rất phổ biến ở động vật nhai lại như
cừu, dê, trâu, bò… trên khắp thế giới, do Fasciola hepatica(Linnaeus, 1758) và
Fasciola gigantica(Cobbold, 1885) gây ra[1], [45]. Người là vật chủ tình cờ của
SLGL khi người ăn rau sống hoặc uống nước lã có nang ấu trùng của SLGL còn
sống. Ở người, SLGL gây tổn thương chủ yếu ở gan nhưng cũng có thể gây tổn
thương ngoài gan khi SLGL lạc vị kí sinh.Tại một số khu vực trên thế giới, tỷ lệ
nhiễm SLGL ở người rất cao và nhiễm SLGL được xem là vấn đề sức khỏe được
cộng đồng đặc biệt quan tâm [59], [61].
Hai loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica có nhiều điểm giống và
khác nhau.Để phân biệt 2 loài, người ta có thể sử dụng phương pháp hình thái
học[44], [67] hoặc sinh học phân tử [6], [18], [54].Theo Periago và cộng sự
(2006)[67], dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều dài, rộng, khoảng cách từ giác
bụng tới cuối thân và tỷ lệ chiều dài/chiều rộng có thể cho phép xác định loài
SLGL. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện không cần những thiết bị phức tạp
và có thể thực hiện ở hầu hết các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho
rằng SLGL có sự đa hình về hình thái, kích thước và hình dạng của SLGL thay đổi
phụ thuộc vào vật chủ kí sinh, số lượng sán nhiễm và tình trạng dinh dưỡng của vật
chủ [27], [45]. Vì vậy, chỉ dựa vào hình thái rất khó có thể xác định SLGL là F.
hepatica hay F. gigantica[20], [27], [45].Phương pháp sinh học phân tử từ khi ra
đời đã khắc phục được những hạn chế của phương pháp hình thái.Các kỹ thuật sinh
học phân tử cho phép xác định và phân biệt 2 loài Fasciola hepatica và Fasciola

loài F. hepatica và F. gigantica được xác định là gây bệnh cho cả người và động vật
[60].Những nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy bệnh sán lá gan lớn ở người
là vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới [45].Bệnh
phân bố chủ yếu ở các quốc gia có tỷ lệ chăn nuôi cừu và gia súc (động vật nhai lại)
cao. Bệnh sán lá gan ở người được thông báo ở một số quốc gia thuộc Châu Âu,
Mỹ, Châu Á, Châu Phi và Châu Đại Dương. Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh ở
người ngày càng tăng tại 51 quốc gia của năm lục địa [59], [61]. Một phân tích
toàn cầu cho thấy bệnh do SLGL chỉ xuất hiện ở những vùng có mối liên hệ giữa
bệnh ở động vật với bệnh ở người và vật chủ trung gian có các điều kiện thuận
lợi để phát triển. Một số nghiên cứu cho rằng, bệnh do SLGL ở người không liên
quan với bệnh do SLGL ở thú.
Ở Châu Á, bệnh sán lá gan ở vật nuôi tập trung ở một số nước như: Thái
Lan, Iran, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ…Trong đó bệnh SLGL ở người được
thông báo nhiều nhất ở Iran, đặc biệt tỉnh Gilan, khu vực gần biển Caspian. Tại các
quốc gia Đông Á, bệnh do SLGL ở người xuất hiện rải rác. Một số trường hợp bệnh
SLGL ở người thông báo tại Nhật Bản, Việt Nam, Thái Lan [59], [61].
Hậu quả SLGL gây ra cho người rất khác nhau.Khi mang ấu trùng
(metacercaria) xuyên qua thành ruột hoặc tá tràng gây xuất huyết và viêm, giai đoạn
này các tổn thương có thể gây triệu trứng không rõ rệt. Quá trình kí sinh ở gan
SLGL gây tiêu hủy tổ chức gan lan rộng, gây chảy máu và phản ứng viêm, phản
ứng miễn dịch. Sán có thể vào đường mật và ở đây chúng có thể sống vài năm gây
viêm nhiễm dẫn tới sơ hóa, dầy lên và giãn rộng, có thể chảy máu đường mật [1],
[14], [45], [61].
Đặc biệt SLGL có quá trình di chuyển lạc vị trí nên có thể gây bệnh ở các cơ
quan ngoài gan.Ở người, vị trí tổn thương ngoài gan thường gặp nhất là đường tiêu
hóa [45]. Các vị trí lạc chỗ khác được thông báo là: mô dưới da, tim, mạch máu,
[3]


phổi và khoang màng phổi, não, hốc mắt,thành bụng, ruột thừa, tuyến tụy, lách, u ở


43

16

37.2

4-8

42

18

42.9

>8

40

20

50.0

Tổng số

125

54

43.2


38.3

245

100

40.8

Trâu

Bò

Tổng số

(Trích nghiên cứu của Nguyễn Khắc Lực và CS, 2010)

[4]


Về tỷ lệ nhiễm theo tuổi, theo hầu hết các nghiên cứu, ở cả trâu và bò, tuổi
càng cao thì tỷ lệ nhiễm càng cao [16], [39]. Theo Nguyễn Khắc Lực (2010)[16],
nhóm trâu/bò độ tuổi >8 năm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (50% ở trâu và 45.5% ở bò).
Giải thích về vấn đề này, tác giả Nguyễn Khắc Lực (2010) cho rằng tuổi trâu/bò
càng cao thì sự tiếp xúc với ngoại cảnh càng dài và cơ hội ăn phải nang ấu trùng
SLGL (metacercaria) càng cao. Hơn nữa, SLGL trưởng thành sống trong gan của
trâu/bò tương đối dài (3-5 năm, thậm chí 10 năm).Võ Thị Hải Lê (2010)[39] cũng có
cùng quan điểm này.
*Nhiễm SLGL ở người
Theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008)[3], thống kê đến năm 2006 số bệnh nhân

A

B

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành

(A: F. gigantica, B: F. hepatica)
Con trưởng thành của F. hepatica có dạng hình lá dẹt (Hình 1.1), hình dạng
đặc trưng cho các loài sán lá.Kích thước từ 20-30 mm chiều dài và 8-15 mm chiều
rộng [10], [45], [62].Cơ thể của nó kéo dài về phía trước phía đầu có dạng hình nón,
trên đó có giác miệng xấp xỉ như nhau. Hình thể của Fasciola gigantica có một số
điểm khác biệt với Fasciola hepatica là kích thước thường dài hơn, trung bình 2575 mm chiều dài và 15mm chiều rộng [62]. Ngoài ra, tỷ lệ phần đầu hình nón thì
nhỏ hơn của F. hepatica và phần cơ thể của nó hình dạng giống chiếc lá

[6]


hơn[45].Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loài này về mặt hình
thái.
*Hình thể trứng

Hình 1.2. Hình thể trứng sán lá gan lớn

Trứng sán F. hepatica thường có kích thước 150 × 90 µm và hình dạng cũng
rất giống với trứng của F. gigantica (Hình 1.2).Có thể thấy các trứng của F.
gigantica với kích thước lớn hơn (200 × 100µ). Trứng SLGL có vỏ màu vàng nâu
với một nắp không rõ ràng và các tế bào phôi nằm bên trong. Trong khi đó
Paramphistome vỏ có màu trong suốt, nắp rõ ràng và các tế bào phôi sáng màu bên
trong trứng. Bên cạnh đó trứng có một mấu nhỏ nằm phía sau của trứng [10], [45], [62].
1.2.3. Vòng đời sinh học

1.3.1.1. Đặc điểm lâm sàng
-Con vật suy nhược, ăn ít
-Niêm mạc nhợt nhạt, lông xù xì dễ nhổ nhất là 2 vùng bên sườn và dọc
xuống ức.
[8]


-Thủy thủng ở mắt, yếm ngực, nhai lại yếu, khát nước, tiêu chảy xen lẫn
táo bón, thú gầy dần, con vật ho, nặng thì thú có thể chết, vàng da.
- Phù thũng ở những vùng thấp của cơ thể như 4 chân, nách, ngực, vùng hầu.
1.3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng
- Trên mặt gan của gia súc bị bệnh có vết di hành của sán lá ( màu vàng trắng) và
xuất huyết do các mô bị phá hủy. Nặng sẽ gây xơ gan.
- Ống mật trong gan dày lên rõ rệt, giống cành cây, mổ ra có nhiều sán lá ký sinh
trong đó, viêm loét ống dẫn mật.
- Hàng ống dẫn mật giảm có mủ, gan có những điểm hoại tử, niêm mạc tăng sinh
thành những u trong đó có nhiều bạch cầu hạt.
1.3.2. Bệnh do SLGL ở người
1.3.2.1. Đặc điểm lâm sàng
Bệnh sán lá gan lớn được chia ra làm các thời kỳ: thời kỳ ủ bệnh (từ khi nang
ấu trùng xâm nhập vào cơ thể đến khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên); thời
kỳ toàn phát (sán lá gan di chuyển vào đường mật); thời kỳ bệnh tiềm tàng (sán
trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng); và thời kỳ tắc nghẽn hay mạn tính [45], [58], [61].

* Thời kỳ ủ bệnh: Triệu trứng của thời kỳ ủ bệnh rất thay đổi phụ thuộc vào
số lượng ấu trùng xâm nhập và sự đáp ứng của cơ thể vật chủ.
* Thời kỳ toàn phát:
Các triệu chứng cơ năng xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn này là:
-Sốt:sốt bất thường, có thể sốt cao, có hiện tượng rét run hoặc có thể thoáng qua rồi
hết, đôi khi sốt kéo dài.

*Xét nghiệm chức năng gan:
-Giai đoạn cấp tính: GOT, GPT, hlobulin và bilirubin tăng nhẹ trong hầu hết
các trường hợp [45].
-Giai đoạn mạn tính: Vàng da, nước tiểu màu vàng sẫm [45].
*Chẩn đoán hình ảnh:Siêu âm cho thấy hình ảnh tổn thương gan là những ổ
âm hỗn hợp hình tổ ong hoặc có thể thấy hình ảnh tụ dịch dưới bao gan [1].
*Chẩn đoán miễn dịch: Kỹ thuật miễn dịch hay được sử dụng nhất là ELISA [1].
*Xét nghiệm phân:Kỹ thuật làm lắng để tìm trứng được chứng minh là ưu
điểm hơn các phương pháp khác [45]. Cần xét nghiệm phân trong 3 ngày liên
tiếp.Chúng ta có thể lấy dịch mật để phát hiện sự có mặt của trứng [1].

[10]


1.4. VAI TRÒ CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH LOÀI
Năm 1995, Tổ chức Y tế thế giới(WHO) thông báo phát hiện bệnh sán lá gan
lớn ở 65 quốc gia và vùng lãnh thổ với gần 180 triệu dân nằm trong vùng nguy cơ
và khoảng 2,4 triệu người dân nhiễm bệnh. WHO coi đây là bệnh cần được quan
tâm trong chương trình sức khỏe cộng đồng và đã được nhiều quốc gia xếp vào vị
trí quan trọng trong chiến lược và chính sách y tế [45].
Bệnh sán lá gan lớn có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể
người bệnh cả về thể chất lẫn tinh thần nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm,
đúng cách.Những lý do trên là nguyên nhân gây tổn thất rất lớn về sức khỏe cũng
như kinh tế cho gia đình và xã hội.
Phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể là phương pháp PCR-RFLP từ khi
ra đời đã tỏ ra ưu việt trong chẩn đoán và phân loại bệnh tật liên quan đến ký sinh
trùng.Nhờ phương pháp này người ta có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh
từ rất sớm, ngay cả khi bệnh tiềm tàng chưa có triệu chứng.Điều này giúp cho các
nhà điều trị lựa chọn các biện pháp thích hợp, hiệu quả, ít tốn kém, góp phần ngăn
chặn những hậu quả mà bệnh gây ra.

36-37 gen mã hóa cho 12-13 loại protein, 2 ARN ribosome (rARN) và 22 ARN vận
chuyển (tARN).Các protein được mã hóa trong hệ gen ty thể là các enzyme tham
gia vào các quá trình hô hấp của tế bào trong hoạt động sống[20].
Vị trí trong tế bào chất, số lượng bản sao nhiều của ADN ty thể đã quy định
những đặc điểm di truyền của ty thể, đó là [45], [75]:
-Di truyền theo dòng mẹ;
- Tỷ lệ đột biến cao hơn hệ gen nhân;
- Sao chép độc lập với quá trình phân bào;
- Các đột biến ADN ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và
phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan đến sự biến đổi
ty thể. Đối với ký sinh trùng, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể, có giá trị định hướng
trong phòng chống, đặc biệt tìm kiếm hóa chất, hóa dược, hoặc thực nghiệm các
loại vacxin thế hệ mới.
Đối với lớp sán lá (trematoda) hệ gen ty thể được xác nhận là chỉ thị phân tử
thiết yếu trong công tác giám định, thẩm định loài [11], [52], [75]. Trên thực tế, các
gen nad1, cox1, cob thường được sử dụng để giám định và định loại các loài có họ
hang gần gũi; các gen nad3, 16S, 12S, vùng không mã hóa thường được sử dụng
trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài có họ hàng xa.
[12]


Các gen ty thể là cấu trúc di truyền đại diện cho dòng mẹ, do vậy, khi giám
định các loài có khả năng lai hay trong vùng tạp lai ngoại loài nhất thiết cần xem xét
thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2), vì gen nhân đại diện di truyền cho dòng bố.
Từ đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay mẹ [11].
1.5.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong xác định và phân biệt 2 loài F. hepatica và F. gigantica
Trong hai thập kỉ qua, công nghệ ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
trong xác định và phân biệt loài sán lá gan đã có những định hướng phát triển vượt
bậc. Nhiều công cụ khác nhau đã được thiết kế để xác định và phân biệt giữa F.
hepatica và F. gigantica như: PCR cơ bản kết hợp giải trình tự, SSCP-PCR… Một

giả thực hiện từ năm 2002.Bước đầu, các nghiên cứu này đã giúp xác định loài sán
lá gan lớn gây bệnh ở nhiều điểm khác nhau trong nước. Các công trình nghiên cứu
sau này bằng sinh học phân tử đã khẳng định loài F. gigantica gây bệnh chủ yếu
cho gia súc ở Việt Nam[2], [5], [6], [18], [19], [20], [24], [25], [26], [27], [29]. Một
số nghiên cứu khác sử dụng hệ gen nhân và hệ gen ty thể đã cho kết luận sán lá gan
lớn gây bệnh trên người và trên động vật ở Việt Nam là F. gigantica có lai với F.
hepatica [12], [20].Các nghiên cứu trong nước chủ yếu sử dụng các gen nad1, cox1,
thuộc hệ gen ty thể và ITS-2 thuộc hệ gen nhân [20] trong giám định thành phần loài.

[14]


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các mẫu SLGL trưởng thành thu thập từ bò ở các
địa điểm Nghệ An (2 mẫu), Tây Ninh (4 mẫu), Quảng Nam (10 mẫu), Đắc Lắc (10
mẫu), Phú Yên (11 mẫu).
Phương pháp thu thập mẫu:
Con sán trưởng thành được thu thập tại các lò mổ ở các tỉnh trên, sau đó
được rửa sạch bằng nước muối sinh lý và bảo quản trong cồn 70˚ cho đến khi thực
hiện các phân tích hình thái và phân tử.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên máy, thiết bị

Hãng sản xuất


6

Bộ pipet 1 kênh

Nychiro (Nhật Bản)

7

Cân điện tử

Labnet (Mỹ)

8

Tủ lạnh -20˚C, -80˚C

Sanyo (Nhật Bản)

9

Lò vi sóng

Sanyo (Nhật bản)

10

Bộ điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Bio-Rad (Pháp)


[15]


Hình 2.1.Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

[16]


2.1.2.2. Hóa chất

STT

Tên sinh – hóa chất

Hãng sản xuất

1

Agarose

Sigma (Mỹ)

2

Ethanol tuyệt đối

Fermentas (Mỹ)

3


Thang chuẩn ADN 100bp

Fermentas (Mỹ)

9

Tango Buffer

Thermo Scientific (Mỹ)

10

Master mix

Thermo Scientific (Mỹ)

11

Enzym Rsa1

Thermo Scientific (Mỹ)

12

Bộ kít tinh sạch ADN

Promega (Mỹ)

Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR
Gene