0

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
WX Đề tài:
ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ
THUẬT RAPD-PCR

Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẫn:
Lê Thanh Vương TS Nguyễn Ngọc Hải
ự đa
hình các đoạn DNA được nhân bản.
II. Tổng quan tài liệu
1. Giới thiệu sán lá gan lớn
Sán lá gan lớn hình chiếc lá, có kích thước 30 x 10-12mm ở trâu bò. Sán ký
sinh trong đường mật trâu bò, nhưng trong nhiều trường hợp, chúng có thể
ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da Trong cơ thể ký chủ như người
và ngựa, sán lá có thể được tìm thấy trong phổi, dưới da hay nơi khác.

2

Hình: Sán lá gan lớn

hợp, ấu trùng theo đường máu cư trú ở các cơ quan khác như
phổi, dưới da
thì chúng vẫn phát triển được thành sán lá gan. Sán lá gan lớn hấp thu chất
dinh dưỡng của người qua máu. Đối với người, việc chẩn đoán bệnh sán lá

4
gan lớn bằng phương pháp tìm trứng trong phân là khó vì chúng thường cư
trú ở các thùy gan. Tuy nhiên, 2-10% bệnh nhân có thể tìm thấy dấu vết sán
lá gan qua phân.

Còn đối với trâu bò sán lá gan cư trú trong ống mật. Do vậy, phương
pháp tìm trứng trong phân rất dễ dàng. Động vật nhai lại (trâu, bò, cừu ) bị
nhiễm sán lá gan là mãn tính. Khi bị nhiễm, chúng ít khi có triệu chứng sốt
mà biểu hiện chủ yếu là sút cân, gầy yếu.
Thông thường, động vật mắc bệnh này ở giai đoạn di hành của ấu
trùng sán lá gan lớn thường kéo theo các vi khuẩn hiếm khí dẫn đến nguy cơ
tử vong cao.
Do các loài độ
ng vật trên thường ăn cỏ ngoài đồng, uống nước ao hồ
nên tỷ lệ mắc sán lá gan rất cao. Theo con số điều tra của Viện Thú y Quốc
gia qua nhiều năm bằng phương pháp tìm trứng trong phân, trên các vùng
núi cao, tỷ lệ động vật ăn cỏ bị nhiễm sán lá gan chiếm từ 40- 90%. Số liệu
này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh sán lá gan lớn ở động vật ăn cỏ rất cao.
Bệ
nh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng do làm tổn thương
gan và giảm năng suất thịt, sữa.
4. Phòng tránh bệnh sán lá gan lớn
Đối với người, để phòng tránh bệnh sán lá gan lớn, cần rửa sạch các
loại rau thủy sinh (rau trồng trong nước), ăn chín, uống sôi.
Đối với trâu, bò, dê hàng năm cần phải cho tẩy giun sán. Cần xử lý phân

2
3
4
n

Hỡnh 5: Cỏc giai on ca phn ng PCR
6. Gii thiu k thut in di trờn gel agarose

S di chuyn ca cỏc phõn t mang in trong in trng gi l in di.
in di hay in di trờn gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) ỏp
dng trong sinh hc phõn t l mt k thut phõn tớch cỏc phõn t DNA,
RNA hay protein da trờn cỏc c im vt lý ca chỳng nh kớch thc,
hỡnh dng hay im ng in tớch (isoelectric point). K thut ny s dng
mt dung dch m (buffer) d
n din v to in trng u, mt bn gel
(thng l agarose hay polyacrylamide) úng vai trũ l th nn phõn tỏch
cỏc phõn t, v cỏc cht nhum khỏc nhau (ethidium bromide, bc, xanh
Coomassie) phỏt hin v trớ cỏc phõn t trờn gel sau khi in di.

6
DNA hay RNA thường tích điện âm. Trong điện di trên gel, mẫu được cho
vào các giếng ở gần cực âm và DNA hay RNA sẽ di chuyển về phía cực
dương. sự di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử càng nhỏ di
chuyển càng nhanh.
Điện di trên gel là phương pháp hữu dụng trong các phân tích sinh hoá học.

Hình: gel
Agarose: cấu tạo
mạng lưới cấu trúc ba chiều, cầu nối hydrogen giữa các
thành phần. Là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích

các đ
oạn giữa các cá thể. Do đó kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến.
Kỹ thuật này giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội.
Quy trình thực hiện RAPD-PCR
- Ly trích DNA
- Lựa chọn mồi
- Tối ưu hoá mồi và thực hiện phản ứng PCR
- Chọn các primer khuếch đại ổn định nhất
- Điện di trên gel agarose
- So sánh kết quả giữa các mẫu
PCR thông thường:

8

Hình: Phản ứng PCR đã biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại
Tuy nhiên, trong RAPD phân tích, trình tự mục tiêu (sẽ được khuếch
đại) là chưa biết. Mồi được thiết kế với một trình tự tùy ý, kích thước 10
nucleotide. Sau đó thực hiện một phản ứng PCR và chạy điện di trên gel
agarose để đọc kết quả nếu có các phân đoạn DNA được khuếch đại trong sự
hiện diện c
ủa mồi tùy ý.
Trong hình này mô tả một phản ứng RAPD, một đoạn lớn của DNA
được sử dụng làm mẫu trong một phản ứng PCR có chứa nhiều bản sao của
một mồi ngẫu nhiên duy nhất.

Hình: phản ứng RAPD-PCR
Trong ví dụ này, có 2 sản phẩm:

trong hệ đệm tương tự ở 37 ° C trong 3 giờ để loại bỏ hết vật chất của ký
chủ. Sau đó các ký sinh trùng được rửa sạch với PBS nhiều lần. 2. Chiết tách DNA
Việc khai thác của DNA được thự
c hiện theo các bước được mô tả
trước đó bởi KAPLAN et al., MC Manus và Bowles; Vargas et al Phương
pháp đã được chỉnh sửa như sau:
Các mẫu ký sinh trùng được đồng nhất trong một dung dịch phân giải
(8% triton 100X, 0,25 M Sucroza, 50 mm EDTA, pH 7,4). Dung dịch đồng
nhất được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, ở 4°C. DNA bộ gen được
tách ra bởi SDS-proteinase K, enzym này sẽ phá vỡ các polypeptide thành
các đơn vị nhỏ hơn, sau đó dễ dàng tách bởi phenol chloroform. DNA phục
hồi được hòa tan trong 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,6 (Tris-EDTA
đệm) và RNA được loại bỏ bằ
ng cách ủ với RNAse ở 37 ° C trong 1h, sau
đó kết tủa lần thứ hai bởi phenol cloroform và ethanol.
Dịch huyền phù được bảo quản ở -20°C.
3. Lựa chọn mồi
Để tối ưu hóa các điều kiện PCR, ba mồi (5'-TCG TCG CATT -3
'(OSA09), 5'-AGC AGC AGGC -3' (OSA 10) và 5'-GGG TAA CGCC -3

11
'(OSA 11 )) đã được lựa chọn ngẫu nhiên để khuyếch đại DNA của Fasciola
hepatica có nguồn gốc ở bò và cừu.
4. Tối ưu hóa
Sự cần thiết tối ưu hóa các điều kiện là để việc khuếch đại có thể thu
nhận đầy đủ và tái bản nhiều band mẫu cho DNA bộ gen của mỗi ký sinh
trùng (5ng). Nồng độ DNA được xác định nhờ ultraviolet absorbance


Sử dụng OSA-10 mồi, chỉ có doạn DNA (150 bp) từ F. hepatica trên cừu đã
được phát hiện, trong khi không có đoạn khuếch đại của F. hepatica trên bò
(Hình 2). 13
Cuối cùng, sau khi khuếch đại của mồi OSA-11, 2 đoạn ADN khoảng 200
và 400 bp đã thu được chỉ từ F. hepatica trên bò và không có band DNA của
F. hepatica trên cừu được phát hiện (hình 3). V. Thảo luận
Việc xác định các loài gần gũi dựa trên đặc điểm hình thái có thể khó
khăn. Điều này đặc biệt là trường hợp cho các loài động vật thân mềm như
sán lá ký sinh. Tuy nhiên, tiến bộ gần đây trong sinh học phân tử, đặc biệt là
khuếch đại vùng ADN đặc trưng thông qua phản ứng PCR có thể cho phép
để phân biệt các có loài quan hệ gần gũi bằng cách so sánh DNA của chúng.
DNA prode cũng như PCR primer dự
a trên khu vực biến động của
chuỗi DNA ribosome đã được phát triển để phát hiện và định loại các loài
Fasciola.
Kỹ thuật RAPD-PCR cho phép khuếch đại của khu vực ngắn của bộ
gen của một sinh vật mà không có thông tin về trình tự trước, nên rất thuận
tiện trên các đối tượng mà bộ gen chưa được biết rõ. Kỹ thuật này có một
tiềm năng lớn trong phân biệt giống, phân biệt cá thể và lập b
ản đồ di truyền.
Trong nghiên cứu này, 3 mồi ngẫu nhiên đã cho các đoạn DNA có kích
thước khác nhau theo nguồn gốc các loài trên ký chủ khác nhau.
Phân biệt những đoạn đặc trưng cho F. hepatica có nguồn gốc từ bò và cừu.