VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng
kháng nấm (Fusarium) gây bệnh cây trồng

Giáo viên hướng dẫn : PGS. TS. Tăng Thị Chính
Sinh viên thực tập

: Trương Thu Hương

Lớp

: 11-01

Hà Nội – 2015


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Tăng Thị Chính - Trưởng phòng Vi
sinh vật môi trường - Viện công nghệ môi trường đã tận tình hướng dẫn, định
hướng và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Khái quát về nấm Fusarium..................................................................... 3
1.2. Ảnh hưởng của nấm Fusarium đối với cây trồng ..................................... 4
1.3. Một số biện pháp phòng trừ nấm Fusarium ............................................. 5
1.3.1. Biện pháp canh tác ............................................................................. 5
1.3.2. Biện pháp hóa học ............................................................................. 6
1.3.3. Biện pháp sinh học............................................................................. 7
PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU ................................................... 10
2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................. 10
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 10
2.1.2. Chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu .................................... 10
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................... 10
2.1.4. Môi trường....................................................................................... 10
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 11
2.2.1. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm Fusarium gây bệnh
của các chủng vi sinh vật bằng thỏi thạch .................................................. 11
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm bằng giếng thạch ........ 12
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng kháng
Fusarium của các chủng VSV tuyển chọn ................................................. 12
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng nấm của
các chủng vi sinh vật ................................................................................. 13
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH ............................................................. 13
Trương Thu Hương

ii

Lớp:11_01


PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 14

1

VK

Vi khuẩn

2

XK

Xạ khuẩn

3

VSV

Vi sinh vật

4

MPA

Meet Peptone Agar

5

TN

Thí nghiệm


bệnh ở cây .......................................................................................................... 15
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng đối kháng nấm Fusarium của
các vi sinh vật ..................................................................................................... 18
Bảng 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả năng ức chế nấm Fusarium của các vi sinh
vật tuyển chọn ..................................................................................................... 25
Bảng 3.5. Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả năng ức chế nấm gây bệnh cây trồng ...... 30
Bảng 3.6. Một số thông số về chủng VSV đã tuyển chọn ........................................ 35

Trương Thu Hương

v

Lớp: 11_01


DANH MỤC HÌNH
Hình1.1. Nấm Fusarium ........................................................................................ 4
Hình 3.1. Khả năng kháng nấm Fusarium của các chủng vi sinh vật tuyển chọn........ 17
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của chủng vi
khuẩn B1 ............................................................................................................ 19
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng kháng nấm Fusarium của chủng
vi khuẩn B2 ........................................................................................................ 20
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của vi khuẩn
B8 ...................................................................................................................... 21
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của vi khuẩn
B12 .................................................................................................................... 22
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn C tới hoạt tính kháng nấm Fusarium của xạ khuẩn
XK VHL4.1 ........................................................................................................ 23
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng kháng nấm Fusarium của các
chủng VSV tuyển chọn ........................................................................................ 24

VSV tuyển chọn .................................................................................................. 35

Trương Thu Hương

vii

Lớp: 11_01


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Đây là
điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh
thực vật. Các vi sinh vật này đã gây thiệt hại lớn đối với năng suất cây trồng.
Trong xu thế phát triển của nền nông nghiệp thế giới, những năm gần đây
nền nông nghiệp của nước ta đã đạt được những thành tựu to lớn. Sản xuất gạo
không những đáp ứng đủ nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu đến các nước lớn
trên thế giới như Mỹ. Ngoài cây lương thực, cây công nghiệp, các cây rau màu cũng
phát triển mạnh mẽ trong sản xuất. Song sản xuất nông nghiệp cũng gặp không ít
khó khăn như thời tiết bất lợi, dịch hại do sâu bệnh, nấm bệnh, cỏ dại, chuột, ốc
bươu vàng,…, đã làm giảm năng suất và phẩm chất nông sản. Theo thống kê của
FAO (1984) hàng năm bệnh hại cây trồng không những làm giảm năng suất, phẩm
chất cây trồng mà còn làm tăng chi phí sản xuất. Vì vậy để bảo vệ sản xuất, chúng
ta phải áp dụng hàng loạt các biện pháp canh tác, cơ giới vật lý,…, đặc biệt biện
pháp hóa học để bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Hóa chất bảo vệ
thực vật không những hủy hoại hệ sinh thái mà còn tồn dư trong đất, trong nông sản
ảnh hưởng tới chất lượng nguồn nước và sức khỏe con người. Hơn nữa, những năm

bệnh cây trồng”.

Mục tiêu của đề tài:
-

Tuyển chọn 2-3 chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Fusarium gây
bệnh cây trồng.

-

Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của các vi sinh vật đã tuyển
chọn tới khả năng kháng nấm Fusarium gây bệnh cây trồng.

Trương Thu Hương

2

Lớp: 11_01


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về nấm Fusarium
Nấm có hơn 20 vạn loài đã được ghi nhận, sống ở khắp mọi nơi trên trái đất;
trong đó có trên 10 vạn loài nấm hoại sinh, hàng năm loài nấm sống ký sinh trên
động vật và cơ thể con người. Hơn 1 vạn loại nấm gây bệnh hại thực vật và trên
80% số bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra với thành phần loài rất phong phú, đa

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Fusarium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc
Việt Nam (L. Burgess, thông tin chưa xuất bản) và từ cà phê ở tỉnh Đắc Lắc (TS.
Trần Kim Loan).
Nghiên cứu sinh địa lý học chỉ ra rằng, các loài Fusarium khác nhau sẽ phân
bố ở các vùng địa lý khác nhau. Sự thay đổi trong cấu trúc và đa dạng của nấm có
thể do kết hợp với các vùng khí hậu đặc biệt trên thế giới [6].

Hình1.1. Nấm Fusarium
Việt Nam là một đất nước có 2 vùng khí hậu khác biệt. Vùng khí hậu Á nhiệt
đới từ phía Bắc của đèo Hải Vân với 4 mùa rõ rệt và vùng khí hậu nhiệt đới ở phía
Nam đèo hải Vân với 2 mùa là: mùa khô và mùa mưa. Sự có mặt của những dãy núi
ở miền Trung và miền Bắc Việt Nam làm gia tăng sự khác nhau giữa các vùng khí
hậu, điều đó cho phép trồng nhiều loại cây khác nhau. Những vùng khác nhau của
Việt Nam cũng đem lại khí hậu lý tưởng cho những loài Fusarium phát triển mạnh
và những dòng Fusarium gây thiệt hại kinh tế lớn cho hàng loạt các cây trồng khác
nhau trên cả nước, bao gồm cây ăn quả, cây rau, cây công nghiệp và cây nông
nghiệp khác.[4]
1.2. Ảnh hưởng của nấm Fusarium đối với cây trồng
Nấm gây nhiều bệnh và thiệt hại đối với cây trồng như:

Trương Thu Hương

4

Lớp: 11_01


giúp làm chậm quá trình lây bệnh sang các cây khác trong vườn rau. Trong mùa
mưa nếu lứa rau trước đó đã nhiễm bệnh trước khi gieo trồng từ 15-20 ngày nên đặt
những tấm nhựa lên đất sau đó bón vôi vào đất và cuốc lật phơi đất thêm vài ngày

Trương Thu Hương

5

Lớp: 11_01


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

để ánh sáng làm nóng đất và nhiệt độ cao sẽ giết chết nhiều vi sinh vật trong đó có
những tác nhân gây bệnh ở tầng đất bề mặt.
Về giống: Luân canh cây trồng khác họ. Sử dụng giống kháng. Không dùng
hạt giống có mầm bệnh (lấy ở ruộng có cây bị bệnh). Xử lý hạt giống bằng nước
nóng 50oC trong 25 phút.
Mật độ trồng: vừa phải, không quá dày để tránh bớt độ ẩm khi lá giao tán.
Phân bón: nên bón lót phân hữu cơ vi sinh hoặc phân chuồng đã ủ hoai cho
rau. Sử dụng cân đối N-P-K, không bón nhiều phân đạm cho rau. Ngưng bón phân
đạm khi bệnh đang phát triển. Bón vôi trước khi trồng và xử lý đất trước khi xuống
giống bằng các loại thuốc gốc đồng. Dùng phân hữu cơ hoai mục, có nhiều vi sinh
vật đối kháng làm hạn chế nguồn bệnh. Bón phân cân đối hợp lý, tránh bón đạm quá
nhiều.
1.3.2. Biện pháp hóa học.
Thuốc phòng bệnh được phun phủ lên toàn bộ bề mặt cây trồng (thân, lá,
hoa, quả,… trong một vài trường hợp phun thuốc cả hạt giống và đất gieo trồng), để

Khi có thêm những bệnh khác loại cùng xuất hiện, phải kết hợp phòng trừ các
phương pháp khác (như phun kèm thêm các loại thuốc đặc trị bệnh mới đó). Chẳng
hạn như các thuốc nhóm phenylamides có hiệu lực trừ bệnh cao với nhóm bệnh
phytophthora hay mốc sương, nhưng tỏ ra kém hiệu lực với nhóm bệnh thối xám và
thán thư… ngoài ra do tính chọn lọc của thuốc, nên cũng dễ làm nảy sinh các nòi
nấm kháng nếu sử dụng một loại thuốc liên tục trong thời gian dài.
1.3.3. Biện pháp sinh học.
Hiện tượng cây con chết do nguyên nhân nhiễm nấm bệnh trong điều kiện
ẩm ướt gọi là bệnh thối rạp “Damping off” do những loài nấm Phytophthora và
Pythium gây ra. Cây con của nhiều loài rau, đậu như rau diếp bị bệnh đột ngột đổ
rạp xuống đất và thối rữa. Đó là do điều kiện ẩm ướt, chật chội (mật độ cây dày)
hoặc qua nhiều than bùn có thể gây ra bệnh này. Vì vậy, kiểm soát bệnh này bằng
cách giữ mặt đất khô sau khi tưới, thậm chí có thể dải một lớp cát trên mặt đất.
Cách giữ đất khô cũng sẽ giúp phòng trừ một loại ruồi nhuế (Sciarid Fly) hay còn
gọi là muỗi nấm (Fungus gnats). Loài này có màu đen và rất nhỏ bé, bò và bay
chung quanh trên mặt đất. Chúng đẻ trứng và ấu trùng của chúng sẽ gây hại cây con
do ăn phần rễ của cây.
Cũng có thể dùng trà hoa cúc La Mã để làm thuốc trừ nấm bằng cách pha
một tách trà hoa cúc La Mã và ngâm trong vòng 10 phút. Khi đã nguội có thể phun
trên những lá nhiễm bệnh nấm nói trên kể cả trên ngọn và dưới gốc để diệt trừ.
Có thể dùng bột cây quế rắc chung quanh cây và đất cũng giúp phòng trừ
nấm bệnh.

Trương Thu Hương

7

Lớp: 11_01



tạo ra trên môi trường ngũ cốc [10].

Trương Thu Hương

8

Lớp: 11_01


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Ở Ấn Độ, các báo cáo đầu tiên về bệnh hại rễ tiêu là do Barber công bố năm
1902, 1903, 1905. Butler (1906) đã tiến hành điều tra bệnh hại ở vùng Wynad (Tây
Nam Ấn Độ). Ông đã phát hiện ra tuyến trùng hại rễ là do nấm Fusarium
oxysporium. Later (1918) đã bác bỏ kết quả của Buler và cho rằng nguyên nhân gây
bệnh là chưa rõ ràng. Venkara Rau (1929) đã phân lập được Phytophthora sp. từ các
mẫu tiêu bị chết héo chủ yếu ở vùng mới khai hoang. Nhưng tiến sĩ Ramaskishen
(1957) đã cho rằng không có loài Phytophthora nào được phân lập từ cây tiêu bị
bệnh trong nước.
• Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nấm trong nước:
Xuất phát từ thực tế về bệnh cây trồng ở Việt Nam, các biện pháp phòng trừ
sinh học bệnh này đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như
nhiều phòng thí nghiệm ở nước ta trong nhiều thập kỉ qua.
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho
thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm 13 Trichoderma
có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh

2.1.4. Môi trường

Trương Thu Hương

10

Lớp: 11_01


Bảng 2.1. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
MT Gause (g/ml)

MT Czapek (g/ml)

MT MPA (g/ml)

Tinh bột tan

20g

Saccarose

30g

Cao thịt

3g

K2HPO4


20g

NaCl

0,5g

KCl

0,5g

H2O

FeSO4.7H2O

0,1g

FeSO4.7H2O

0,1g

Agar

20g

Agar

20g

H2O


- Dùng dao sạch hoặc que sắt đã thanh trùng cắt miếng thạch chứa các vi
sinh vật muốn kiểm tra các hoạt tính đối kháng mốc Fusarium (sao cho diện tích
khoảng 3x3 mm2). Sau đó đặt các miếng thạch lên đĩa petri có chứa nấm Fusarium,
rồi nuôi cấy ở 30oC. Sau 72h lấy mẫu ra để kiểm tra kết quả vòng kháng.
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm bằng giếng thạch
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể và được nuôi
cấy ở 30oC trong vòng 24h đối với vi khuẩn và 48h đối với xạ khuẩn. Dịch nuôi cấy
VSV sau đó được tiến ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút để loại sinh khối và
thu dịch nổi để thử hoạt tính.
Các chủng mốc M2.2, M3.1, M3.3, M4.1 và M5.1 được trang trên đĩa petri
chứa môi trường Czapeak. Sau đó dùng dụng cụ chuyên dụng khoang các lỗ thạch
trên đĩa, rồi dùng pipet nhỏ khoảng 200µl dịch nổi của các chủng VSV thu ở trên
vào các giếng thạch. Các đĩa sau khi đã nhỏ dịch được để ở 40C trong vòng 4h, rồi
chuyển qua tủ ấm 30oC. Sau 72h lấy mẫu ra để kiểm tra vòng kháng.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng kháng Fusarium
của các chủng VSV tuyển chọn
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Đối với vi khuẩn.
Môi trường cơ sở là MPB có bổ sung các nguồn cacbon sau: glucose,
saccarose, tinh bột tan (TBT), rỉ đường với nồng độ 3%. Sau đó khử trùng ở 121oC,
trong 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.
Chủng vi khuẩn hoạt hóa trên môi trường MPB được cấy vào các môi trường
trên với tỷ lệ giống 1%. Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút. Sau 24h lấy mẫu để
xác định khả năng kháng Fusarium.

Trương Thu Hương

12

Lớp: 11_01

Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng ức chế nấm Fusarium gây bệnh
cây trồng, chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm Fusarium từ cây hồ tiêu và đánh
giá khả năng kháng nấm các chủng VSV có trong bộ sưu tập giống của Phòng Vi
sinh vật môi trường. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Một số đặc điểm của các chủng nấm Fusarium sử dụng trong nghiên cứu
TT Ký hiệu

Nguồn phân lập

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và bào tử

Từ đất trồng tiêu

- Khuẩn lạc tròn, màu kem, bề mặt hơi bột.

chủng
1

M2.2

- Bào tử có hình lưỡi liềm, có vách ngăn.
2

M3.1

Từ rễ cây tiêu

-Khuẩn lạc tròn, màu vàng hơi carot, bề
mặt bông.
- Bào tử có hình lưỡi liềm, có vách ngăn.

các chủng nấm phân lập được. Kết quả thể hiện ở bảng 3.2:

Trương Thu Hương

14

Lớp: 11_01


Bảng 3.2. Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm gây
bệnh ở cây
STT

Chủng

1

B1

2

Loại VSV

Mốc
M2.2

M3.1

M3.3


3

B3

VK

-

8

9

-

-

4

B7

VK

-

-

-

-


-

-

7

B10

VK

-

-

-

-

-

8

B11

VK

-

-


-

-

-

-

11

V2

VK

-

-

-

-

-

12

V5

VK


VK

-

-

-

-

-

15

V11

VK

-

9

-

8

-

16


18

H1

VK

-

-

-

-

-

19

H2

VK

-

-

-

-


-

-

22

H9

VK

-

-

-

-

-

Trương Thu Hương

15

Lớp: 11_01


23

H10


H12

VK

-

7

-

7

5

26

VHL1.1

XK

-

-

-

-

-


-

29

VHL4.1

XK

-

-

17

18

12

30

VHL4.2

XK

-

-

-

Trương Thu Hương

16

Lớp: 11_01


Hình 3.1. Khả năng kháng nấm Fusarium
của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính kháng nấm
Fusarium của các chủng VSV đã tuyển chọn
Sau khi tuyển chọn được các chủng VSV có tính đối kháng nấm Fusarium
cao nhất chúng tôi đã tiến hành một số nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện
lên hoạt tính của chúng.
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là nguồn vật chất cung cấp cho quá trình sinh trưởng của VSV.
Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hóa hóa học phức tạp biến vật
chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Trong các phản ứng sinh
hóa nguồn C còn tạo ra năng lượng cho tế bào. Một số VSV dùng CO2 làm nguồn C
duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn C không phải là nguồn sinh
năng lượng. Đường nói chung là nguồn C và là nguồn năng lượng tốt cho VSV.
Nhưng tùy từng loại đường mà VSV có những khả năng sử dụng khác nhau. Sau
đây là kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng kháng nấm
của các chủng VSV đã tuyển chọn:

Trương Thu Hương

17

Lớp: 11_01