BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
***************

BÙI HỮU DŨNG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS
TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA
CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN
VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
***************

BÙI HỮU DŨNG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS
TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA
CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN
VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI

Chuyên ngành: Thú Y
Mã số:
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn Khoa học:

PCV ................................................................................................Porcine circovirus
PCR ......................................................................................Polymera chain reaction
PiCV ................................................................................................Piegon circovirus
PK15 ........................................................................................................Pig kiney 15
RA .........................................................................................Riemerella anatipestifer
SC ...................................................................................................................Subcutis
TBE ................................................................................................Tris Borate EDTA


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Các hạt phân tử DuCV ở túi bursa fabricius trên vịt Mulard được chụp
dưới kính hiển vi điện tử
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gien của DuCV
Hình 2.1 Vịt hư hại lông, chảy nước mắt, nước mũi
Hình 2.4 Vịt bị thất điều vận động, nằm ngửa và bơi chèo
Hình 2.5 Các bệnh tích đại thể phổ biến trên vịt nhiễm RA
Hình 2.6 Các bệnh tích vi thể phổ biến trên vịt nhiễm RA


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số kháng sinh và sulfamides sử dụng trong điều trị bệnh do RA
Bảng 3.1 Số lượng trại khảo sát và số mẫu dự kiến
Bảng 3.2 Mẫu thu thập cho các nghiên cứu xét nghiệm bệnh
Bảng 3. Trình tự đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR chẩn đoán RA
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR trong chẩn đoán DuCV
Bảng 3. Chu trình luân nhiệt phản ứng PCR phát hiện RA


Chương 1
MỞ ĐẦU

Circovirus trên vịt và khả năng nhiễm ghép với một số tác nhân khác như: E.coli,
Salmonella, DHV và Riemeralla anatipestifer. Mặc dù, số lượng trại nuôi vịt siêu
thịt nhập ngoại cũng đã tăng lên một cách nhanh chóng, cũng như tình hình dịch
bệnh trên loài này cũng ngày càng phức tạp hơn.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn sản xuất đặt ra, đề tài: “Bước đầu đánh
giá tình hình nhiễm Circovirus trên vịt và khả năng nhiễm ghép giữa
Circovirus và Riemerella anatipestifer trên vịt siêu thịt nhập ngoại ở tỉnh Đồng
Nai” đã được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Tất Toàn và TS.
Nguyễn Thị Phước Ninh.
1.2 Mục tiêu của đề tài
- Đánh giá tình hình nhiễm Circovirus trên đàn vịt nuôi.
- Đánh giá khả năng nhiễm ghép giữa Circovirus và RA trên vịt.
1.3 Yêu cầu của đề tài
- Tỷ lệ nhiễm DuCV trên tổng đàn/ vịt khảo sát.
- Tỷ lệ nhiễm DuCV trên đàn/ vịt khảo sát theo lứa tuổi.
- Tỷ lệ nhiễm RA trên vịt dương tính với Circovirus.
- Tỷ lệ nhiễm RA trên vịt âm tính với Circovirus.
- So sánh tỷ lệ nhiễm RA trên vịt dương tính và âm tính với Circovirus.


Chương 2.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu bệnh circovirus trên vịt
2.1.1 Lịch sử bệnh
Circovirus trên vịt (DuCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae được mô
tả đầu tiên trên hai vịt mái Mulard 6 tuần tuổi ở Đức, năm 2003 (Hattermann và cs,
2003). Bệnh gây ra các tác hại chủ yếu như: rối loạn tình trạng mọc lông, chậm tăng
trưởng và gầy ốm (Hattermann và cs, 2003; Soike và cs, 2004). Sau đó, DuCV cũng
đã được phân lập ở Hungary (Fringuell và cs, 2005). Năm 2006, Chen và cs đã mô
tả DuCV trên vịt Muscovy, Pekin và Mule với các triệu chứng còi cọc, sự bất bình

và cs, 2010). Năm 2012, Xiang và cộng sự dựa trên cơ sở giải trình tự gien đã
chứng minh DuCV có thêm ORF3 (nucleotide 103-399), nằm ở mạch bổ sung của
ORF1 và có sự đồng nhất với gien ORF3 của PCV2 trên heo. ORF3 liên quan đến
sự chết theo lập trình của tế bào. Tấc cả các ORF đều chịu áp lực chọn lọc codon.


Hình 2.2 Cấu trúc bộ gien của DuCV
(nguồn: Xiang, 2012)
2.1.3 Đặc điểm về dịch tễ
DuCV có tỷ lệ lưu hành cao trên vịt nuôi nhà (Zhilong Zhang và cs, 2013).
Đã có nhiều báo cáo về tỷ lệ nhiễm Circovirus trên nhiều giống vịt như: Vịt Mulard,
Muscovy, Mule, Cherry valley, Pekin và Pockmark (Banda và cs, 2007; Wan C. Và
cs, 2011) ở nhiều nơi trên thế giới gồm: Đức, Mỹ, Hungary, Trung Quốc, Đài Loan
(Liji và cs, 2014). DuCV có thể truyền ngang (Lin và cs, 2010) và truyền dọc từ đàn
vịt giống sang vịt con tại cùng một thời gian ( Li và cs, 2014). Các nghiên cứu của
Hattermann và cs (2003) trên vịt mái 6 đến 8 tuần tuổi đã mô tả các triệu chứng đặc
trưng của bệnh (Soike và cs, 2004). Sự suy giảm miễn dịch làm tăng khả năng đồng
nhiễm một số tác nhân gây bệnh khác như: Riemerella anatipestifer, Pasteurella
multocida, Staphilococus aureus, Duck hepatitis và Aspergillus fumigatus (Soike và
cs, 2004; Fringuelli và cs, 2005; Chen và cs, 2006; Zhang và cs, 2009). Sự nhiễm
ghép của các tác nhân này với Circovirus có tỷ lệ lưu hành cao trên cả gia cầm non
và gia cầm trưởng thành (Leslie Và Kenneth, 2013). Tỷ lệ mắc bệnh cao đã được
mô tả Trung Quốc nhưng các quốc gia liền kề như: Hàn Quốc, Nhật Bản thì chưa có
báo cáo về tình trạng này (Cha và cs, 2014).
Các nghiên cứu của Ritchie và cộng sự (1991); Rittchie và Latimer (1995) đã
chứng minh Circovirus tồn tại trong các chất bài tiết, phân của những con vẹt bị
nhiễm bệnh và bụi trong không khí. Nghiên cứu cũng đề nghị rằng: sự bài thải các
hạt vi-rút và sự tiêu hóa trực tiếp các vật nhiễm bệnh có thể là con đường truyền lây
tự nhiên của vi-rút. Hess (2004) cũng đã chứng minh: vi-rút được phát hiện phổ



Do khó khăn trong việc nhân giống Circovirus trong nuôi cấy tế bào hoặc
phôi gà nên sự hiểu biết về sự nhân lên của Circovirus còn rất hạn chế. Có 2 loài
thuộc họ Circoviridae gồm: CIAV ( Chicken infectious anaemia virus) và PCV
(Porcine circovirus) được nhân giống trong môi trường nuôi cấy tế bào (Murphy và
cs, 1999; Todd và cs, 2001) và đã có những thông tin cơ bản về sự nhân lên của virút. CIAV nhân lên trong tế bào MDCC-MSB1 bắt nguồn từ tế bào lympho của
bệnh Marek, còn PCV phát triển trong tế bào PK15. Do sự giới hạn về kích cỡ của
bộ gen nên khả năng nhân lên của Circovirus phụ thuộc nhiều vào các enzymes
trong tế bào. Circovirus nhân lên trong nhân và phụ thuộc vào protein tế bào được
tạo ra trong suốt pha S của chu kỳ tế bào (Todd và cs, 2001). Các quá trình nguyên
phân cần thiết cho DNA đi vào trong nhân và sự nhân lên xảy ra trong các tế bào
đích như: biểu mô nang lông, các lympho bào và biểu mô đường ruột. Sự nhân lên
xảy ra trên cấu trúc stem-loop của bộ gien, ORF1 mã hóa protein cần thiết cho sự
nhân lên của vi-rút (Mankertz và cs, 2000; Todd và cs, 2001).
2.1.6 Triệu chứng lâm sàng
Các triệu chứng lâm sàng của vịt nhiễm Circovirus thường không điển hình,
không có những biểu hiện bất thường đặc trưng. Vịt chết rãi rác và chậm lớn. Theo
Hattermann và cộng sự (2003), vịt chủ yếu còi cọc, thể trạng kém và hư hại bộ lông
dọc theo sống lưng. Một số con có thể bị xuất huyết ở gốc chân lông. Tình trạng này
cũng được quan sát thấy trên chim sẻ, quạ và ngỗng bị nhiễm Circovirus (Leslie và
Kenneth, 2013). DuCV có thể nhiễm ghép với nhiều tác nhân khác như: E.coli, P.
Multocida, Riemerella anatipestifer, viêm gan vịt (theo trích dẫn của Xiang và cs,
2012) và làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả chăn nuôi (Se-Yeoun và cs,
2014). Nhiễm ghép cũng xảy ra phổ biến trên vịt lớn tuổi và sự suy giảm đáp ứng
miễn dịch do tác động của Circovirus được cho là nguyên nhân cơ bản (Banda và
cs, 2007).
2.1.7 Bệnh tích
Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các biến đổi bệnh tích vi thể trên vịt bị
nhiễm Circovirus. Phức hợp bệnh tích mô bào, sự hoại tử xảy ra ở lách, tuyến ức và




Phương pháp ELISA gián tiếp đã được Liu và cộng sự (2010) sử dụng để
phát hiện Circovirus trên vịt và điều tra dịch tễ của bệnh. Tác giả sử dụng kháng
nguyên protein capside tái tổ hợp của DuCV được sản xuất từ các tế bào E.coli để
phát hiện kháng thể đặc hiệu của Circovirus trong huyết thanh vịt.
2.2 Giới thiệu bệnh bại huyết do Riemerella anatipestifer (RA) trên vịt
Bệnh do RA là một bệnh truyền nhiễm cấp tính trên vịt, ngỗng, gà tây và
nhiều loài gia cầm nuôi nhà khác. Bệnh được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau
như: bệnh bại huyết trên vịt, hội chứng anatipestifer, bệnh bại huyết do anatipestifer
hay bệnh viêm thanh mạc truyền nhiễm. Bệnh xảy ra cấp tính hoặc mãn tính với các
đặc trưng như: viêm màng ngoài tim, màng bao gan, viêm túi khí, viêm vòi trứng
tích casein và viêm màng não.
Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế do có tỷ lệ tử vong cao, tăng trọng kém. Vì
vậy, cần phải kết hợp đồng thời nhiều biện pháp để ngăn ngừa và kiểm soát bệnh
như: chẩn đoán bệnh chính xác, kịp thời, chủng ngừa vắc-xin và điều trị bệnh.
RA được mô tả đầu tiên năm 1932 trên vịt Bắc Kinh từ ba trại vịt ở Long
island, New York. Hendrickson và Hilbert (1932) đã phân lập được mầm bệnh và
lấy tên Pfeifferella anatipestifer. Sau đó, tác nhân gây bệnh đã được phân lập dựa
trên các đặc tính và liên tiếp được thay đổi tên từ Moraxella anatipestifer (Brogden,
Rhoades và Rimler, 1982), Flavobacterium (Piechulla, Pohl và Mannheim, 1986),
Pasteurella anatipestifer. Cuối cùng, Segers và cộng sự (1993) đã quyết định đặt
tên là Riemerrella anatipestifer thuộc họ Flavobacteriaceae để tưởng nhớ Riemer
(Riemer, 1904) - người đầu tiên mô tả bệnh bại huyết tiết dịch trên ngỗng năm
1904.
2.2.1 Căn nguyên
RA có dạng trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí, không di động, không bào tử và
có thể kết nhóm đôi hay chuỗi ngắn. RA có kích thước 1-2 mm, dạng lồi, mọc thành
khối, trong suốt và óng ánh.
RA được định serotype dựa vào phản ứng trung hòa và phản ứng AGP. Cả

tố như: chủng vi khuẩn, tuổi của vật chủ và đường truyền lây (Heddleston, 1972;
Sarver và 2005). RA được mô tả đầu tiên trên vịt và ngỗng. Sau đó, được báo cáo


trên gà tây (Sarver, 1977; Zehr, 1970), chim trĩ (Bruner, 1970), gà (Rosenfeld,
1973), cút (Pascucci, 1989) và heo (Hinz, 1998).
Vịt từ 1-8 tuần tuổi nhạy cảm cao với mầm bệnh. Vịt nhỏ hơn 5 tuần tuổi
thường chết trong 1-2 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Tuổi vịt lớn
hơn thường có thời gian sống sót lâu hơn. Bệnh do RA hiếm khi xảy ra trên vịt đẻ.
Mầm bệnh truyền lây trực tiếp và gián tiếp. RA truyền lây trực tiếp qua
đường hô hấp (Layton, 1984), gián tiếp qua các vết thương trên da thông qua trung
gian các chất độn chuồng nhiễm mầm bệnh (Asplin, 1955). Vi khuẩn xâm nhập qua
các vết trầy xước, vết nứt hay các vết thương trên da hoặc các điểm ở cánh. Vịt
cũng có thể bị nhiễm mầm bệnh qua phân vào thức ăn, nước uống hay môi trường,
nơi vịt nhiễm RA mãn tính là nguồn lây bệnh lâu dài trong trại. Thời gian ủ bệnh
thường từ 2-5 ngày. Sự gây nhiễm thí nghiệm bằng cách tiêm dưới da hoặc trong da
có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh, tỷ lệ tử vong cao và sớm sau 24 giờ.
Ngược lại, gây nhiễm qua đường miệng hoặc hô hấp thì tỷ lệ tử vong thấp hơn
(Asplin, 1956; Hatfield, 1988; Sarver, 2005).
2.2.5 Triệu chứng lâm sàng
Các dấu hiệu lâm sàng thường được quan sát thấy với các biểu hiện: ủ rũ,
chảy nước mắt, nước mũi, ho, hắc hơi, sốt và thở nhanh. Vịt tiêu chảy phân xanh.
Ngoài ra, vịt còn bị thất điều vận động, bơi chèo, quẹo cổ, run đầu và hôn mê. Vịt
chết do nhiễm trùng huyết và nhiễm độc tố huyết. Tùy thuộc vào đặc tính gây bệnh
của vi khuẩn, tỷ lệ bệnh biến động từ 5-75 %, tỷ lệ chết thường cao hơn. Những con
vịt sống sót thường còi cọc hay chậm lớn (Pickrell, 1966).

Hình 2.3 Vịt hư hại lông, chảy nước

Hình 2.4 Vịt bị thất điều vận động,

(Nguồn: Hess và cs, 2013)
2.2.6.2 Bệnh tích vi thể
Bao tim tích dịch có sợi huyết chứa một số tế bào viêm, các tế bào đơn nhân
và bạch cầu trung tính. Ở thể quá cấp, mô cơ tim bị hoại tử điểm nghiêm trọng. Ở
mô gan, có sự xâm lấn nhẹ các bạch cầu đơn nhân ở rìa và sự thoái hoái các tế bao
nhu mô. Ở thể cấp tính, sự xâm lấn các tế bào bạch cầu ở rìa cũng có thể được quan
sát thấy (Pickrell, 1966). Ở túi khí, các tế bào đơn nhân chiếm đa số trong dịch tiết.
Trong khi đó, các tế bào đa nhân khổng lồ và các nguyên sợi bào có thể được quan
sát thấy ở thể mãn tính (Dougherty, 1955). Đường hô hấp cũng bị nhiễm RA nhưng
không có biểu hiện lâm sàng. Phổi có thể không bị ảnh hưởng. Chỉ có sự xâm lấn
nhẹ các tế bào và sự gia tăng nhanh chóng các nốt lympho gần tiểu phế quản
(Pickrell, 1966) hoặc viêm phổi tiết dịch sợi huyết có mủ (Graham, 1938). Hệ thống
thần kinh trung ương có thể tạo sợi huyết và viêm màng não với sự xâm lấn các tế
bào lympho ở trong hoặc xung quanh mạch máu não (Jortner và cs, 1969). Sự hoại
tử các mô lympho và sự suy kiệt các lympho bào cũng được mô tả ở lách và túi
bursa fabricius (Sarver, 2005).


Hình 2.6 Các bệnh tích vi thể phổ biến trên vịt nhiễm RA
(a) Màng bao tim lấp đầy tế bào đơn nhân và các bạch cầu hạt bắt màu lưỡng tính
(b) Viêm màng não lấp đầy tế bào viêm
(c) Viêm vùng mô dưới da lấp đầy bạch cầu trung tính
(d) Các tế bào đơn nhân và bạch cầu hạt nhuộm màu lưỡng cực ở vùng gân gót Asin
(Nguồn: Hess và cs, 2013)
2.2.7 Chẩn đoán
Phân lập và xác định RA: Hầu hết vi khuẩn có thể được phân lập nhanh để
chẩn đoán bệnh trong trường hợp bệnh cấp tính. Các mẫu mô thường được sử dụng
gồm: não, máu tim, túi khí, tủy xương, phổi, gan và dịch tiết các tổn thương. Các
phản ứng trung hòa và phản ứng AGP cũng được sử dụng để xác định các serotype
của RA với kháng huyết thanh đặc hiệu. Thử phản ứng sinh hóa cũng là một trong

kháng thể mẹ truyền (Sandhu, 1992). Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có vắc-xin
phòng bệnh do RA trên vịt.
Sự đề kháng kháng sinh của RA thay đổi theo thời gian (Zhong, 2009).
Kháng sinh và các sulfamides là những hoạt chất được chứng minh có tác dụng tốt
trong điều trị bệnh do RA (bảng ...)


Bảng 2.1 Một số kháng sinh và sulfamides sử dụng trong điều trị bệnh do RA
Tên
Sulfamethazine
Sulfaquinoxaline
Novobiocin
Lincomycin
Penicillin
Enrofloxacin
Ceftiofur
Sulfadimethoxine + Ormetoprim
Penicillin + Streptomycin
Lincomycin + Spectinomycin

Hàm lượng hoặc
liều sử dụng
0,2-0,25%
0,025-0,05%
0,0303-0,0368%
0,011-0,022%

Đường cấp thuốc

Uống hoặc trộn thức ăn

phương pháp real time PCR có độ nhạy cao hơn so với phương pháp PCR truyền
thống.


Jiang và cộng sự (2008) báo cáo: đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện
và giải trình tự gien của DuCV trên vịt Muscovy bệnh ở tỉnh Fujian , Trung Quốc.
Theo đó, tỷ lệ mẫu dương tính là 79 %, có 10/12 trại dương tính với DuCV. Tác giả
sử dụng phương pháp PCR để giải trình tự gien cho biết tỷ lệ tương đồng của DuCV
được phân lập ở tỉnh Fujian (FJ0601) là 97,3-97,5 % so với 4 chủng được phân lập
Đài Loan (TC1/2002, TC2/2002, TC3/2002, TC4/2002), 82,9 % so với chủng được
phân lập ở Mỹ và 82,3 % chủng được phân lập ở Đức. Phân tích trình tự gien của
DuCV cho thấy genome hoàn chỉnh có độ dài 1988 bp.
Sự nhiễm ghép của DuCV với các tác nhân khác như: E.Coli, P. multacida,
Riemerella anatipestifer hay viêm gan vịt đã được mô tả. Các nghiên cứu của Zhang
và cộng sự (2009) đã sử dụng phương pháp PCR để điều tra tỷ lệ nhiễm ghép của
DuCV với RA, E.coli và DHV1 trên vịt Cherry Valley ở tỉnh Shangdong, Trung
Quốc. Theo đó, tỷ lệ vịt chỉ nhiễm DuCV là 33,29%. So sánh tỷ lệ vịt dương tính và
âm tính với DuCV khi nhiễm ghép với RA lần lượt là: 23,4 % và 8,28 %; với E.coli
là 16,19 % và 4,85 % và DHV1 là: 25,5 % và 7,47 %.
Sau đó, Cha và cộng sự (2012) cũng đã đánh giá tỷ lệ nhiễm ghép giữa
DuCV với RA và Salmonella trên vịt được nuôi ở Hàn Quốc. Tỷ lệ vịt chỉ nhiễm
Circovirus là 10,9 %. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm ghép giữa DuCV với RA,
Salmonella hay DuCV với RA và Salmonella lần lượt là: 4,1 %, 5 % hay 1,4 %.
Chúng tôi nhận thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các
đặc điểm của bệnh cũng như vi-rút gây bệnh, trong đó, có các công trình về chẩn
đoán DuCV. Nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều mô tả về bệnh, sự đánh giá về khả
năng nhiễm ghép giữa DuCV và các tác nhân khác, cũng như ứng dụng phương
pháp PCR trong chẩn đoán nhanh DuCV.



phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ở 3 huyện: Trảng Bom, Thống Nhất và Gia Kiệm,
tỉnh Đồng Nai. Số lượng trại khảo sát và số mẫu dự kiến như sau:
Bảng 3.1 Số lượng trại khảo sát và số mẫu dự kiến
Huyện

Số trại dự

Số vịt dự kiến lấy

Tổng số vịt lấy

Giai đoạn

kiến khảo

trong mỗi trại (con)

mẫu (con)

tuổi (tuần)

2-5

120 - 300

0-8

sát (trại)
Trảng
Bom