BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH PHƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101396

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHỌN LỌC
VÀ TINH CHẾ ASIATICOSID TỪ CÂY RAU
MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH PHƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101396

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHỌN LỌC
VÀ TINH CHẾ ASIATICOSID TỪ
CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Tuấn Anh.
2. PGS. TS. Đỗ Quyên.
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dƣợc Liệu.

HÀ NỘI - 2016

1.1. Tổng quan về cây rau má ........................................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Centella (L.) trong hệ thống phân loại thực vật ...... 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây rau má................................................................ 2
1.1.3. Phân bố và sinh thái ................................................................................ 3
1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến .......................................................... 3
1.1.5. Thành phần hóa học ................................................................................ 4
1.1.6. Tác dụng dược lý..................................................................................... 6
1.1.7. Công dụng ............................................................................................... 8
1.2. Tổng quan về asiaticosid........................................................................ 10
1.2.1. Công thức hóa học, tính chất hóa lý...................................................... 10
1.2.2. Định tính................................................................................................ 11
1.2.3 Định lượng ............................................................................................. 11
1.2.4. Tác dụng dược lý và công dụng ............................................................ 12
1.2.5. Một số nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid từ rau má ...... 13
1.3. Tổng quan về tối ƣu hóa và áp dụng trong chiết xuất tối ƣu ............. 15
1.3.1. Tối ưu hóa ............................................................................................. 15
1.3.2. Áp dụng trong nghiên cứu chiết xuất tối ưu ......................................... 17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 18
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ..................................................................... 18
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất .................................................................. 18
2.1.2. Máy móc, thiết bị .................................................................................. 19
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ................................................. 19


2.2.1. Khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má ....... 19
2.3.2. Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid ................................... 21
2.3.3. Phương pháp đánh giá ........................................................................... 23
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 26
3.1. Khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ƣu asiaticosid từ rau má ... 26
3.1.1. Thiết kế mô hình chiết xuất................................................................... 26

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các nhóm chất khác trong cây rau má

5

3.1

Mô hình thí nghiệm và kết quả thực nghiệm chiết xuất

26

dược liệu
3.2

Kết quả thực nghiệm chiết xuất rau má ở điều kiện tối

28

ưu
3.3

Kết quả khảo sát dung môi rửa giải nhựa hấp phụ resin



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của asiaticosid

10

1.2

Lý thuyết hệ thống và hộp đen

16

2.1

Dược liệu rau má

18

2.2

Sơ đồ chiết xuất dược liệu rau má

đóng vai trò rất quan trọng.
Cây rau má (Centella asiatica (L.) Urb.) là cây thuốc mọc hoang và được
trồng ở khắp nước ta, được sử dụng với nhiều tác dụng quý như giải nhiệt,
giải độc, thông tiểu, dùng để chữa sốt, rôm sảy, mẩn ngứa, các bệnh về
gan,…Trong y học hiện đại, cao rau má với hoạt chất chính là asiaticosid
được ứng dụng nhiều trong điều trị bỏng, làm lành vết thương, điều trị lao,
phong,…[10] Với sự phát triển của công nghệ bào chế, rau má được sử dụng
làm thuốc dưới nhiều dạng bào chế khác nhau, trong đó dạng cao khô được sử
dụng phổ biến. Tuy nhiên, việc chiết xuất các hoạt chất trong rau má, đặc biệt
là asiaticosid hiện nay chưa đạt hiệu suất cao. Với hàm lượng rất thấp trong
dược liệu, cùng với công nghệ chiết xuất truyền thống, các sản phẩm cao khô
trên thị trường hiện nay có hàm lượng asiaticosid thấp. Vì vậy, chúng tôi thực
hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất chọn lọc và tinh chế asiaticosid từ cây
rau má (Centella asiatica (L.) Urb.)” với các mục tiêu:
- Khảo sát một số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má.
- Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid.


2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây rau má
Cây rau má (còn gọi là tích tuyết thảo, liên tiền thảo) thuộc chi Centella (L.)
họ Hoa tán (Apiaceae).
1.1.1. Vị trí phân loại chi Centella (L.) trong hệ thống phân loại thực vật
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan, chi Centella (L.) thuộc họ Hoa tán
(Apiaceae). Vị trí phân loại của loài Centella asiatica (L.) Urb. trong hệ thống
phân loại thực vật có thể tóm tắt như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Ở Việt Nam, cây rau má mọc tự nhiên khắp nơi. Cây ưa ẩm, hơi chịu bóng,
thường mọc thành đám ở vườn, bãi sông suối, nương rẫy, bờ ruộng cao và ven
rừng [4], [16].
Rau má sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, đến mùa đông (ở miền Bắc)
hay mùa khô (ở miền Nam), cây có hiện tượng bán tàn lụi. Cây ra hoa và quả
nhiều vào cuối mùa hè hoặc đầu mùa thu, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Do
có khả năng đẻ nhánh khỏe, cây rau má thường mọc thành từng đám dày đặc
nên lấn áp các loài cỏ khác [16].
Do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng ở nhiều nước như Madagasca, Srilanka,
Philippin và cả miền Nam Việt Nam, người ta đã tiến hành trồng rau má để
làm thuốc hoặc nước giải khát. Ở Việt Nam, cây rau má chủ yếu mới được
khai thác sử dụng tại chỗ, chưa trở thành mặt hàng thương mại hóa [16].
1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
Bộ phận dùng của rau má là toàn cây. Rau má có thể thu hái quanh năm. Để
làm thuốc, rau má thường dùng tươi hoặc sao vàng [10].
Ngoài ra, rau má cũng được sử dụng như loại rau thường ngày. Rau má
được dùng xay nhỏ hay giã nát, lọc lấy nước, thêm đường làm nước giải khát,
tiêu độc [4].


4

1.1.5. Thành phần hóa học
Rau má chứa những hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau.
Triterpenoid
Đây là thành phần chính và quan trọng nhất của rau má, được dùng làm chất
đối chiếu hay “dấu vân tay” của rau má trong lĩnh vực kiểm nghiệm. Các
triterpenoid có cấu trúc là dẫn chất pentacyclic nhóm ursan và oleanan, gồm 4
chất chính là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic và acid madecassic, ngoài
ra còn có triterpenoid khác như asiaticosid (B, C, D, E, F), brahmosid,

Matsuda và cộng sự (2001) đã phân lập được một flavonol có tên là
petuletin và kaempferol 3-O-β-D-glucuronid từ phần trên mặt đất của rau má
trồng ở Việt Nam [30].


5

Một số flavonoid khác tồn tại trong loài này như castilliferol, castillicetin,
quercetin 3-O-β-D-glucuronid, quercetin 3-O-glucosid, keampferol 3-Oglucosid và kaempferol 7-O-glucosid [22].
Tinh dầu
Theo Quin và cộng sự (1998), thành phần tinh dầu của rau má tương tự như
những loài Hydrocotyle sp. của họ Apiaceae. Bằng phương pháp GC-MS, đã
xác định được 45 thành phần từ tinh dầu rau má, trong đó caryophyllen,
farnesol và emelen là các thành phần chính [37].
Nghiên cứu của Nor Azah Mohd Ali và cộng sự tại Malaysia (2002) và
nghiên cứu của Oyedeji và cộng sự tại Nam Phi (2005) cho thấy βcaryophyllen là thành phần chính trong tinh dầu của rau má [33], [35]. Như
vậy, qua các nghiên cứu về tinh dầu được thực hiện bởi nhiều tác giả khác
nhau, mẫu thu hái ở các thời gian và địa điểm khác nhau thì kết quả đều cho
thấy β-caryophyllen là thành phần chính có mặt trong các bộ phận của rau má.
Nhóm chất khác
Bên cạnh 3 nhóm chất triterpenoid, flavonoid và tinh dầu, thành phần hóa
học của cây rau má rất phong phú. Bảng 1.1 trình bày các nhóm chất khác
trong cây rau má [16], [22].
Bảng 1.1. Các nhóm chất khác trong cây rau má
Nhóm chất

STT

Tên hợp chất


quinic, acid 1,5-di-o-caffeoyl quinic,
acid 3,5-di-o-caffeoyl quinic
5
6

Monosaccharid Glucose, mesoinositol
Carbohydrat

7

Oligosaccharid Centellose
Polysaccharid

Pectin, arabinogalactan

8

Vitamin

Vitamin C, vitamin B2, β-caroten

9

Chất khoáng

Ca, P, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na, Cu

10

Acid amin


của collagen và tăng biểu mô hóa tế bào, tạo mạch ở vị trí tổn thương; qua đó
có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình làm lành vết thương [40].
Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung bƣớu và gây độc tế bào
Một số nghiên cứu thử nghiệm trên chuột cho thấy rau má và các thành
phần hoạt tính của nó có tác dụng điều hòa miễn dịch rất tốt [42].
Uống chế phẩm Brahma Rasayana có chứa rau má làm tăng đáng kể số
lượng tế bào máu, tế bào tủy xương, tế bào NK trên chuột bị tiếp xúc với bức
xạ gamma. Bên cạnh đó, thuốc còn làm giảm tác động của tia bức xạ gây ra
sự peroxide hóa ở gan, mà cơ chế có thể là giúp tăng sinh tế bào gốc và ngăn
chặn gốc tự do gây tổn thương [42].
Tác dụng lên thần kinh trung ƣơng
Dịch chiết nước từ rau má có tác động tốt lên khả năng học tập, giúp tăng
cường trí nhớ và khả năng nhận thức trên chuột và trẻ em [32].
Rau má có tác dụng bảo vệ và phục hồi tế bào thần kinh thông qua thúc đẩy
tái tạo tế bào thần kinh thông qua thúc đẩy tái tạo tế bào thần kinh, làm dài sợi
trục trên in vitro. Hoạt chất acid asiatic cũng được chứng minh hiệu quả điều
trị tổn thương neuron do ngăn chặn sự oxy hóa tế bào thần kinh [28].
Tác dụng trên tim mạch
Rau má có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim khỏi tác động của chất gây tổn
thương cơ tim (adryanmycin) [23] và cải thiện tình trạng tổn thương tái tưới
máu và thiếu máu cục bộ cơ tim (nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim) ở chuột
thí nghiệm [36].
Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng và mù đôi trên các bệnh
nhân mắc chứng tăng huyết áp tĩnh mạch cho thấy rau má và các saponin từ
rau má giúp cải thiện tình trạng phù mắt cá chân, cải thiện vi tuần hoàn, tăng
hiệu quả lọc ở mao mạch và tác dụng phụ thuộc vào liều sử dụng [18], [19].


8


thổ huyết, chảy máu cảm, tả lỵ, giải độc lá ngón và nhân ngôn. Dùng ngoài trị
rắn cắn, mụn nhọt, lở ngứa và vết thương chảy máu [4].
Rau má ngày dùng 30 đến 40 (g) tươi, vò nát vắt lấy nước uống hoặc sắc
uống. Thuốc rau má không độc, phụ nữ có thai vẫn dùng được [10].
Một số bài thuốc có rau má:
+ Chữa bệnh da thể phong nhiệt: Chàm khô, tổ đỉa khô, á sừng, viêm da thần
kinh, viêm nang lông và vảy nến thể khô:
Rau má 16g; chi tử, huyền sâm, đậu đen, thiên môn, ngưu tất, thạch cao,
mỗi vị 20g; hoài sơn, lá dâu, mỗi vị 16g; hoàng liên 8g: thiền thoái 6g. Sắc
uống ngày một thang.
Thuốc xông, ngâm, bôi, chườm: Rau má 16g; khổ sâm nam, quyết minh tử,
hoàng đằng, mỗi vị 20g; hà thủ ô, cỏ mực, mỗi vị 16g; kinh giới, phèn chua,
mỗi vị 12g [16].
+ Chữa viêm loét dạ dày tá tràng:
Rau má 12g; đảng sâm 16g; hoài sơn, ý dĩ, hà thủ ô, huyết dụ, kê huyết
đằng, cam thảo dây, đỗ đen sao mỗi vị 12g. Sắc uống ngày một thang [16].
Theo y học hiện đại
Trong y học hiện đại, rau má ít được dùng trực tiếp, mà thường ở dạng cao
đã tiêu chuẩn hóa bằng đường uống, tiêm bắp hoặc dưới da [16].
Cao rau má điều trị bỏng độ hai và độ ba có tác dụng dự phòng sự co rúm
và sưng do nhiễm khuẩn và ức chế tạo sẹo lồi. Kem chứa 1% cao rau má điều
trị nhiễm khuẩn mạn tính. Viên nang chứa cao rau má hoặc asiaticosid và kali
clorid có hiệu quả như dapson trong điều trị bệnh nhân phong. Cao rau má
tiêu chuẩn hóa được dùng trong điều trị bệnh loét dạ dày tá tràng có tác dụng
tốt cải thiện các hiệu ứng chủ quan và làm lành các vết loét ở 73% bệnh nhân
qua xét nghiệm bằng nội soi và chụp tia Rơngen [16].
Ở một số nước, người ta chế rau má dưới dạng:



nước, alcol, pyridin, glycol, glycerin, có độ chảy 230 – 233°C [10] [34].
1.2.2. Định tính
- Phản ứng tạo bọt:
Asiaticosid có một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước, vì vậy có tính chất đặc
trưng là tạo bọt. Khi dùng dung dịch cồn chiết có asiaticosid thực hiện phản
ứng tạo bọt với ống nghiệm chứa HCl 0,1N và ống nghiệm chứa NaOH 0,1N,
cột bọt trong 2 ống nghiệm tạo ra bền và cao bằng nhau [13].
- Phản ứng định tính:
Asiaticosid có các phản ứng màu của saponin triterpenoid:
+ Phản ứng Rosenthaler: Asiaticosid cho tác dụng với vanillin 1% trong HCl
và hơ nóng sẽ có màu hoa cà.
+ Asiaticosid phản ứng với antimoin triclorid trong dung dịch chloroform rồi
soi dưới đèn phân tích tử ngoại thì có huỳnh quang xanh.
+ Phản ứng Liebermann – Burchardt: Lấy vài milligram asiaticosid hòa nóng
vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, sản phẩm thu được
có màu từ hồng đến tía [13].
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng:
+ Bản mỏng: Bản mỏng silicagel G.
+ Hệ dung môi khai triển:
Chloroform : Methanol : Nước = 7 : 3 : 0,5.
+ Thuốc thử hiện màu: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT).
Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 105°C, đến khi hiện rõ vết [2].
1.2.3 Định lƣợng
- Phương pháp cân:


12

Nguyên tắc: Chiết asiaticosid rồi cân. Tính hiệu suất asiaticosid thu được
dựa vào khối lượng asiaticosid thu được và khối lượng dược liệu [13].

thuốc bột, thuốc mỡ hoặc thuốc tiêm dưới da [13].
Asiaticosid có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh nhân bỏng độ hai hoặc độ
ba.Thuốc dùng ngoài asiaticosid được dùng trong điều trị bỏng khẩn cấp [44].
Năm 1956, Boiteau và Ratsimamanga dùng asiaticosid điều trị hủi và lao da
[13]. Asiaticosid làm tan bao bằng chất giống sáp của trực khuẩn phong, trực
khuẩn trở nên mong manh và dễ bị phá hủy [16].
Inhee M. J. và cộng sự (1999) đã công bố công trình nghiên cứu về tác dụng
bảo vệ thần kinh, chống lại các độc tố beta – amyloid của các dẫn xuất của
asiaticosid. Asiaticosid kích thích hệ reticuloendothelial nên sức đề kháng của
cơ thể mạnh hơn [24].
Trong nghiên cứu của Wijeweera P. và cộng sự (2006) đã chứng minh tác
dụng giải lo âu của dịch chiết rau má và asiaticosid trên mô hình thí nghiệm
trên chuột [43]. Nghiên cứu của Si W. C. và cộng sự (2006) cũng đã chứng
minh được tác dụng tương tự của asiaticosid [39].
Công trình nghiên cứu của Xin L. và cộng sự (2008) cho thấy asiaticosid có
tác dụng chống trầm cảm trên chuột thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy
asiaticosid có tác dụng chống trầm cảm, trong nghiên cứu so sánh với
clomipramine [45].
Ngoài ra, asiaticosid có tác dụng chống ung thư vì nó gây chết tế bào theo
chương trình và làm tăng hoạt động kháng khối u của vincristine với tế bào
ung thư [46].
1.2.5. Một số nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid từ rau má
Những nghiên cứu về phương pháp chiết xuất và tinh chế asiaticosid đã
được nghiên cứu và công bố rộng rãi bởi các nhà khoa học nước ngoài. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu chiết xuất asiaticosid từ rau má tại Việt Nam vẫn chưa
được quan tâm và chú trọng.


14



dòng 1,5 ml/phút. Hàm lượng asiaticosid thu được theo nghiên cứu là 9,803
mg/g [1].
Những nghiên cứu về chiết xuất rau má tại Việt Nam vẫn đang còn hạn chế,
chỉ có một số nghiên cứu về tác dụng dược lý, thành phần hóa học của rau má
và asiaticosid, mặc dù rau má là dược liệu dễ kiếm, dễ trồng và có thể mang
lại hiệu quả kinh tế cao tại Việt Nam.
1.3. Tổng quan về tối ƣu hóa và áp dụng trong chiết xuất tối ƣu
1.3.1. Tối ƣu hóa
- Định nghĩa tối ƣu hóa
Tối ưu hóa một công thức hay quy trình là việc tìm công thức, thông số (hay
điều kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt nhất
trong giới hạn mong muốn của người làm thí nghiệm [9].
- Các khái niệm
+ Biến đầu vào còn gọi là biến độc lập hay yếu tố: Là những biến mà người
làm thí nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thí nghiệm và sự
thay đổi này sẽ kéo theo sự thay đổi giá trị của biến đầu ra.
+ Biến đầu ra còn gọi là biến phụ thuộc hay đáp ứng: Là kết quả của thí
nghiệm mà người làm thí nghiệm thấy cần phải đo đạc và đánh giá [9].
- Phƣơng pháp tối ƣu hóa
Theo lý thuyết hệ thống, một hệ thống có thể xem như một quá trình chuyển
đổi từ đầu vào (input) thành đầu ra (output).
Việc xem xét hệ thống từ phương diện bằng thực nghiệm được coi như là
việc tiếp cận một hộp đen. Hộp đen là một hệ thống với cấu trúc bên trong
chưa biết nhưng biết được giá trị của đầu vào và đầu ra. Trên thực tế, chất
lượng của đầu ra không những bị ảnh hưởng bởi đầu vào mà còn có nhiều yếu
tố khác có thể không được biết. Do đó, có thể sử dụng các yếu tố được biết,


16


17

máy tính hỗ trợ người làm thí nghiệm trong công việc này. Một số chương
trình thông dụng:
- Dựa trên phương trình hồi quy đa thức bậc ≤ 2: MODDE, DESIGN
EXPERT, STATGRAPHICS.
- Dựa trên mạng neuron nhân tạo: INFORM, ANNA & OPTIM, TRAJAN
[9].
1.3.2. Áp dụng trong nghiên cứu chiết xuất tối ƣu
Việc chiết xuất và phân lập các hoạt chất từ dược liệu thường bị ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố: Dung môi, thiết bị, điều kiện chiết xuất (tỷ lệ dược liệu/dung
môi, nhiệt độ, áp suất, thời gian, pH,…) [7], [11]. Vì vậy, cần thực hiện tối ưu
hóa để hiệu suất của quá trình chiết xuất lớn nhất.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Lập và cộng sự (2014), đã tối ưu hóa quy
trình chiết xuất phospholipid từ đậu nành với các điều kiện thực nghiệm:
- Giai đoạn 1: t = 40°C, p = 360 bar, thời gian 120 phút.
- Giai đoạn 2: t = 56°C, p = 398 bar, thời gian 120 phút.
Hiệu suất trung bình đạt 0,72% so với nguyên liệu ban đầu [8].
Theo nghiên cứu của Hồ Bá Vương và cộng sự (2015), đã tối ưu hóa quy
trình chiết xuất polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với các
điều kiện thực nghiệm:
- Nhiệt độ: 90°C.
- Thời gian chiết: 76,5 phút.
- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 70/1 (ml/g).
- Nồng độ dung môi chiết: Ethanol 44,3%.
Hiệu suất của quá trình chiết đạt 233,76 mg GAE/g chất khô [17].