THƯ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ HUỆ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG
HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT
SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG
ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ
ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU

TP.HCM, 2010


MỞ ĐẦU
Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong
thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng dụng
rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn
enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi
sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô
công nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng
dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau này người ta
đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin.
Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với polysaccharide như cellulose. Chitin phân
bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài của tôm cua
và côn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, chứa các đơn

- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất, thời gian thủy phân cơ chất.
- Bước đầu thử nghiệm một số ứng dụng của chế phẩm chitinase từ nấm sợi.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
Thời gian

: từ tháng 8/2009 – 7/2010

Địa điểm

: Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường

Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI

1.1.1. Khái quát về enzyme
1.1.1.1. Cấu trúc [1, 23]
Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các
phản ứng sinh học.
Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin
liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của
enzyme.
Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học
duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần protein
thuần gọi là apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu


1.1.1.3. Phân loại enzyme [16, 23]
Có nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tôi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc
tác của enzyme. Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại
mới, trong đó enzyme được chia ra làm 6 lớp chính:
-

Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hoàn nguyên sinh học)


-

Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

-

Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

-

Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo con đường thủy phân)

-

Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

-

Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)


Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69]
 Họ Glycohydrolase 20
Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi
khuẩn, Streptomyces và người.
Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc
tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu
cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt
động xúc tác.
Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu
cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I.
Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.
Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II


Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự
amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu
cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu
cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.
1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11]
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn
olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma
harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9),
Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).
Chitin 1,4- - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các

Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine.


1.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase [11]
* Trọng lượng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng
30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số
chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa. Trọng
lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến
120 kDa.
* Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và
tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số
Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml).
* Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 63]
Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg và
Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự, 1999;
Bendt và cộng sự, 2001).
Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C, ngoại
trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là
50OC (Jeuniaux, 1963). Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase có thể có
những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và
chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ
cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase
từ Vibrio sp. Từ 30-450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở
40-600C.
Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum
Rifai nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ
tối ưu là 400C.
* Ảnh hưởng của pH [32]

chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột
xác.
1.1.3. Chitin (cơ chất của chitinase)
1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu chitin [56]
Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu loài nấm
Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu được sản phẩm và
đặt tên là chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc).
Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của chitin.


Năm 1843, Lassaige chứng minh rằng trong chitin có sự có mặt của nitrogen.
1.1.3.2. Chitin trong tự nhiên [30, 57, 58]
Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh học được tổng hợp
với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau
cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin
tồn tại ở cả động vật và thực vật.
Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số
động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong giới thực vật,
chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae.
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với
nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi tồn tại ở
trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin- protein. Điều này dẫn đến
sự đề kháng với các hóa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh
chế chúng. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng
một loài có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của chitin.
Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin
chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực là nguồn
nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng.
Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [45,51]
Bọ cánh cứng


Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là
từ vỏ cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như:
CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai
yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất của chitin.


1.1.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của chitin
 Cấu trúc phân tử [58, 59]
Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng
chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-Glucosamine liên kết với nhau bởi
liên kết 1-4 glucoside.

Hình 1.5. Cấu trúc chitin [62]
Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ, sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp
các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng
chiều, ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các
cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.

Hình 1.6. Cấu trúc của alpha-chitin [62]
 Tính chất của chitin [27, 31]
Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch. Chitin
không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung môi thông
thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…).


1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm sợi trên môi trường lên men
bán rắn [14, 35, 36]
1.1.4.1 Thành phần môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase [4, 11, 29]
 Nguồn dinh dưỡng cacbon

1.1.4.2. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme chitinase của nấm sợi
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm có ý nghĩa trong nuôi cấy bán rắn. Theo Matsumoto và cộng sự (2001), với độ ẩm
75%, chủng Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase có hoạt tính cao nhất. Đối với
Trichoderma harzianum, hoạt tính chitinase cao nhất ở độ ẩm môi trường là 65% (Nampoothiri và
cộng sự, 2003). Takashi và cộng sự (2002) chỉ ra rằng nấm sợi Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có
hoạt tính cao ở điều kiện độ ẩm môi trường 57%.
- Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
của các chủng nấm sợi. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là
acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH =
5-6 (Takashi và cộng sự, 2002). Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH thích
hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị Hồng
Thương và các đồng tác giả, 2003).
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của nấm sợi. Nhiệt
độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-320C, tối đa dưới 500C. Nhiệt độ quá cao hoặc
quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp
enzyme sẽ bị ức chế. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ
370C (Takashi và cộng sự, 2002)
- Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng
Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Tuy nhiên trong các môi trường
nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase.
Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase
(Monreal và Reese, 1969; Ulhoa và Peberdy, 1993). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả
năng kích thích tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000; Nampoothiri và cộng sự, 2003). Trong hầu
hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật có khả năng tạo chitinase (Felse
và Panda, 2000).
Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ
tôm, cua ...) để tạo chitinase từ nấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Việc tận dụng phế liệu

dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl
glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N- acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao
exochitinase và N-acetyl glucosamindase. (Aloise và cộng sự, 1996) nhận thấy khi ủ enzyme
chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy có sự hình thành các
hexamer.
Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N- acetyl glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng
dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330.


1.1.5.3. Ứng dụng trong việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học
Chitin có mặt trong lớp vỏ ngoài và ống tiêu hóa của côn trùng. Villagomez-Castro và LopezRomero (1996) đã chỉ ra rằng các sự sự kiện thuộc về hình thái học ở nấm luôn có sự tham gia của
enzyme chitinase. Allosamidin, một chất ức chế mạnh của enzyme chitinase, được nhận thấy có khả
năng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài như ve bét, ấu trùng nhặng sau khi chúng ăn vào (Sakuda
và cộng sự, 1987).
1.1.5.4. Ứng dụng trong việc ước tính sinh khối nấm
Các nhà nghiên cứu đã mô tả một loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm có trong đất.
Kỹ thuật bao gồm việc quan sát dưới kính hiển vi và ly trích những chất chỉ thị đặc trưng cho nấm
như glucosamine ergosterol.
Có sự liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và lượng nấm có trong đất. Sự liên quan
như thế không thấy xuất hiện với vi khuẩn và xạ khuẩn. Chính vì thế, chitinase trở thành yếu tố chỉ
thị thích hợp cho mức sinh trưởng của nấm trong đất (Miller và cộng sự,1998). Tương tự, chitinase
và protein gắn kết với chitin có thể được sử dụng để dự báo sự lây nhiễm nấm trên con người (Laine
và Lo, 1996).
1.1.5.5. Ứng dụng trong việc kiểm soát muỗi
Chitinase đóng vai trò quan trọng đối với hình thái nấm men, côn trùng. Kuranda và Robbins
(1991) chỉ ra vai trò của chitinase trong sự phân chia tế bào trong suốt quá trình sinh trưởng của
nấm men Sacharomyces cerevisiae.
Người ta chỉ ra rằng ấu trùng muỗi Aedes aegypti có thể bị giết trong vòng 48 giờ với sự tác
động của chế phẩm thô từ nấm Myrothecium verrucaria. Nấm gây bệnh côn trùng như Beauveria
bassiana có thể gây nhiễm trứng của muỗi Aedes aegypti. Điều này mở ra tiềm năng trong việc sản

Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt côn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng. Chitinase từ
Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum, F.
Solani, Penicillium ultimum (Change và cộng sự, 2003). CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ
Trichoderma harzianum P1 và Trichoderma virens 41 có thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo
dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago
avenae, ... khi chúng được ủ với dịch enzyme.
1.1.5.8. Ứng dụng trong sản xuất protein đơn bào
Chất thải rắn từ quá trình chế biến tôm chứa chủ yếu là chitin, CaCO3 và protein. RevahMoiseev và Carrod (1981) đã đề nghị sử dụng loại chất thải này để chuyển đổi bằng phương pháp
sinh học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin. Họ sử dụng enzyme
chitinase thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin và sau đó nuôi Pichia
Kudriavazevii để sản xuất protein đơn bào (với 45% protein và 8-11% acid nucleic). Những nấm


thường được dùng để sản xuất protein đơn bào là Hansenula polymorpha, Candida tropicalis,
Sacharomyces cerevisiae và Myrothecium verrucaria.
Vyas và Deshpande (1991) đã dùng enzyme thủy phân chitin thu nhận từ Myrothecium
verrucaria và dùng Sacharomyces cerevisiae để sản xuất protein đơn bào từ chất thải chứa chitin.
Tổng hàm lượng protein thu được là 61%, với tỉ lệ rất thấp acid nucleic (3,1%). Các nghiên cứu chỉ
ra rằng Sacharomyces cerevisiae là chủng tốt nhất để sản xuất protein đơn bào (60% protein và chỉ
1-3% acid nucleic).

1.2.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NGHIÊN CỨU

1.2.1. Các chủng thuộc chi nấm Aspergillus [7, 8, 61]
1.2.1.1. Vị trí phân loại
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Eurotiomycetes

(C), (D), (E): hình thái bào tử
1.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh
Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng phân bố rộng rãi và dễ thích nghi vì
chúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau.
Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng
của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C. Theo Takashi và cộng sự (2002),
nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất là 370C.


Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus
awamori là khoảng 5.0-7.0. Độ pH quá acid (khoảng 2-3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến
hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm.
Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger, gồm amylase,
amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase ... Ngoài ra chitinase của nấm này cũng
được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 [61].
Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng không có hại,
nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an toàn của Aspergillus niger
được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng
sự (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer và cộng sự (2006) [41]. Theo thông tin tóm tắt từ
những bài báo của các tác giả này, khoảng 3-10% các chủng Aspergillus niger có khả năng sinh ra
độc tố trong những điều kiện nuôi cấy xác định như ochratoxin A.

1.2.2. Trichoderma harzianum [5, 12, 55]
1.2.2.1. Vị trí phân loại
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại do các đặc
điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.
Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma thuộc lớp nấm, nấm bất toàn
Deuteromycetes (Fungi imperfect), chúng được phân loại như sau:
Giới: Nấm
Nghành: Ascomycota

SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE

1.3.1. Trên thế giới
So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase ... thì hệ enzyme chitinase được
nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế. Đối tượng được nghiên
cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R. Berger và D.M. Renolds, 1958; R.
Grupta, R. K. Saxena, P. Chatuvedi và J. S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tượng này
nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A.
Carroad và R. A. Tom có công trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất
thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A (1982) đề cập đến quá
trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin.


Về sau, trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối
tượng khác như Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và
M. V. Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào
nấm.
Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma.
Năm 1991, C. J. Ulhoa, J. F. Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum. Năm 1999, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh
tổng hợp chitinase từ Trichoderma hazianum. Năm 2000, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu quá
trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok
Pandey và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ
Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Dường như Trichoderma là chi nấm đến
nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong
bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng
sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Nopakarn Rattanakit và cộng sự, 2002). Những
chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A. A. Sherief,
1990); A. fumigatus (Jin-Ian Xia và Jing Xiong, 2009). A. A. Shubakow và P. S. Kucheryavykh
(2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đó có các chủng thuộc các chi nấm

lĩnh vực y dược.


Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1

NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Giống vi sinh vật
Các chủng nấm sợi Asperillus niger và Asperillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma
harzianum do phòng thí nghiệm, Bộ môn Sinh hóa, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành
phố Hồ Chí Minh và Bộ môn Vi sinh, Trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
2.1.2 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm
2.1.2.1. Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi
MT 1 [1, 12]: Cao nấm men agar – Yeast Extract Agar (YEA)
Cao nấm men

4g

Agar

20g

Glucose

20g

Nước

1000ml


Agar

20g

Glucose

20g

Nước

1000ml

pH = 5,5 – 6,0
Khử trùng 1atm/30 phút
2.1.2.2. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase [12, 13, 29]


MT 4:
NaNO3

3,5g

K2HPO4

1,5g

MgSO4.7H2O

0,5g

Cám

40g

Đường vàng

4g

(NH4)2HPO4

0,1g

Urê

2,2g

CaCl2

0,1g

KCl

0,05g

MgSO4.7H20

0,05g

HCl


KCl

0,05g

MgSO4.H20

0,05g

Bột chitin

10g

MT 6: