ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHI
Ê
N
NGUYỄN THỊ THÚY
HẰNG
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA
MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM,
GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES
VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS
LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG
TẾ BÀO UNG TH
Ư
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH
HỌ
C
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG
LỜI CẢM
ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương. Cô
đã
hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Và
tôi
cũng rất biết ơn Trung tâm Sâm và Dược liệu T.P.Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện
cho
tôi được thực hiện đề tài tại Trung
tâm.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy

Trang phụ
bìa
Lời cảm
ơ
n
Mục
lục
Danh mục chữ viết
t
ắ
t
Danh mục các
b
ả
ng
Danh mục các
hình
LỜI MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về ung
thư

3
1.1.1. Sơ lược về nguyên nhân gây ung thư
3
1.1.2. Đặc tính của tế bào ung thư
4
1.2. Apoptosis và ung thư
4

2.1.1. Ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú
MCF-7
và ung thư phổi NCI-H460 sử dụng trong đề tài
34
2.1.2. Thuốc đối chiếu
Camptothecin 35
2.1.3. Nấm dược liệu
35
2.1.4. Hóa
ch
ấ
t

37
2.1.5. Thiết
bị 40
2.2. Phương pháp
40
2.2.1. Phương pháp thu nhận cao chiết từ nấm dược liệu
40
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật
43
2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Tryphan blue
44
2.2.4. Thử nghiệm SRB
46
2.2.5. Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang
v
ớ
i

3.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao
chi
ế
t
phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết từ
nấm
Linh chi vàng trên ba dòng tế bào HeLa, NCI-H460 và MCF-7
66
3.2.1. Tế bào HeLa
67
3.2.2. Tế bào ung thư vú MCF-7
69
3.2.3. Tế bào ung thư phổi
NCI-H460 70
3.2.4. Kết quả xác định cao chiết tiềm năng
72
3.3. Xác định giá trị IC
50
của cao chiết cồn nấm Linh chi
vàng
(Ganoderma colossum) trên dòng tế bào HeLa
73
3.4. Kết quả xác định khả năng gây apoptosis của cao chiết
cồn
nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế
bào
ung thư
HeLa 75
3.4.1. Kết quả nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB
75

58
Bảng 3.2. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao
chi
ế
t
nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
61
Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết
n
ướ
c
trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng
63
Bảng 3.4. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao
chi
ế
t
phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm
Linh
chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm
ứ
ng

68
v
Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao
chi
ế
t
phân đoạn có chứa triterpen và polysaccharid thô chiết xuất từ nấm Linh

bromide
BuOH :
buthanol
CAD : caspase activated
DNase
CARD : caspase recruitment
domain
CPT :
camptothecin
DD : death domain DEVD
:
Asp-Glu-Val-Asp
DED :
death
effector
domain
DISC : death inducing signalling
complex
DNA : deoxyribose nucleic
acid
DMSO : dimethyl
sulphoxide
E’MEM : eagle minimal essential
medium
EDTA : ethylenediaminetera-acetic
acid
FasL :
Fas-ligand
FasR : Fas-
receptor

polysaccharopeptide
PBS : phosphate buffer
saline
RAIDD : RIP associated Ich-1/CED3 homologous protein with death
domain
R110 : rhodamine
110
SRB : sulforhodamine
B
STD : standard
deviation
TCA : trichloroacetic
acid
TNF : tumor necrosis
factor
TRAIL : TNF- related apoptosis induced-
ligand
TRADD : TNF receptor – associated death
domain
WHO : world health
organization
XTT : sodium
3,3,-[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium-bis(4-
methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid
hydrate
DANH MỤC CÁC
HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sự hình thành tế bào ung thư
4

1
Hình 2.4. Buồng đếm hồng
c
ầ
u

45
Hình 2.5. Sự phân cắt DNA trong apoptosis
51
Hình 2.6. Sự điện di DNA bị phân cắt trong quá trình
apoptosis
và necrosis trên gel
agarose 52
Hình 3.1. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao
chi
ế
t
cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng.
59
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao
chi
ế
t
cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng.
62
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của các cao chiết

cồn,
các cao chiết phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi
vàng
trên 3 dòng tế bào HeLa, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100
µg/ml
sau 48 giờ cảm ứng
.72
Hình 3.9. Đồ thị thể hiện tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của
cao
chiết cồn nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa sau 48 giờ cảm ứng
74
Hình 3.10. Hình thái tế bào HeLa quan sát dưới kính hiển vi huỳnh
quang

77
Hình 3.11. Kết quả điện di DNA bộ gen của quần thể tế bào HeLa sau khi
đượ
c
cảm ứng với cao chiết cồn Linh chi vàng ở nồng độ 92,6 µg/ml.
79
LỜI MỞ ĐẦU
Theo thống kê gần đây nhất của WHO (World Health Organization), ung
th
ư
gây ra khoảng 7,9 triệu ca tử vong mỗi năm trên thế giới, trong số đó khoảng
70%
(5,5 triệu người) là ở những nước đang phát triển. Ở Việt Nam, số người mắc
b
ệ
nh

v
ớ
i
các nhà khoa học. Hiện nay để điều trị ung thư, người ta vẫn dùng ba liệu pháp
phổ
biến nhất là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Tuy nhiên, các liệu pháp này ít nhiều
cũng
gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người do các tác dụng phụ. Chẳng hạn
ph
ươ
ng
pháp hóa trị liệu vẫn còn bị hạn chế bởi việc liều cao của thuốc chữa ung thư có
th
ể
gây độc, làm giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân
[68].
Con người từ xa xưa đã biết sử dụng nhiều loại dược liệu quý trong tự
nhiên
để chữa bệnh. Chính vì thế, việc tìm kiếm và sàng lọc các hợp chất tự nhiên có
ho
ạ
t
tính kháng ung thư hiện nay đang là đề tài thu hút sự quan tâm của các nhà
khoa
học trên thế giới. Các tổ chức y tế lớn trên thế giới như WHO và NCI
(National
Cancer Institute) đang có những dự án nghiên cứu mở rộng ra khắp các châu
lục
trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới có tiềm năng điều trị được ung thư.
Một

nghiên cứu các loại nấm này [1],[4]. Tuy nhiên ở nước ta, việc tiếp cận theo
h
ướ
ng
nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc in vitro các hợp chất tự nhiên có hoạt tính
kháng
ung thư từ các loại nấm này vẫn còn là bước đầu và chỉ mới có một vài nghiên
c
ứ
u
được công bố [3],[6]. Nhằm làm rõ hơn về tác dụng kháng ung thư của các loại
n
ấ
m
Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng nuôi trồng tại Việt Nam trên ba loại ung
th
ư
được xem là phổ biến nhất hiện nay ở nước ta, trong khuôn khổ luận văn, chúng
tôi
tiến hành thực
hi
ệ
n:
Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết
n
ướ
c
của 7 mẫu nấm (Linh Chi, Vân Chi và Thượng Hoàng) trên ba dòng tế bào là
ung
thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư phổi NCI-H460 bằng

Thử nghiệm
caspase
1.1. Khái quát về ung
thư
Ung thư là thuật ngữ dùng để chỉ bệnh liên quan đến những tế bào bất
th
ườ
ng
phân chia vô hạn (tăng trưởng không kiểm soát). Các tế bào ung thư có thể xâm
l
ấ
n
sang những mô lân cận và chúng có thể di căn sang những cơ quan khác trong
c
ơ
thể bằng cách di chuyển theo các mạch máu và hệ thống bạch huyết. Hầu hết
ung
thư tạo thành khối u, ngoại trừ một vài dạng, như ung thư bạch
c
ầ
u.
1.1.1. Sơ lược về nguyên nhân gây ung
thư
Trong cơ thể, các tế bào tăng sinh một cách có kiểm soát tạo ra các tế bào
m
ớ
i
thay thế cho những tế bào chết đi. Sự cân bằng giữa quá trình tăng sinh và chết
của
tế bào được điều hòa chặt

Nói chung, nguồn gốc căn bản của ung thư là do sự tích lũy nhiều đột biến trong
các
gen dẫn đến sự hoạt động bất thường của tế bào (xem hình 1.1), làm cho các tế
bào
vượt khỏi chu trình kiểm soát thông thường cũng như có khả năng xâm lấn và
di
c
ă
n.
Chương 1. Tổng quan tài
Hình 1.1. Sự hình thành tế bào ung thư
[73].
1.1.2. Đặc tính của tế bào ung
thư
Nhìn chung, các tế bào ung thư bao gồm các đặc điểm sau:
[29]
¾ Không bị kiểm soát bởi các tín hiệu ngoại bào hay nội bào của quá trình
đi
ề
u
hòa chu trình tế
bào.
¾ Không bị cảm ứng
apoptosis.
¾ Tăng sinh vô hạn và không có khả năng biệt
hóa.
¾ Có hoạt động bất thường của emzyme
telomerase
¾ Có khả năng di căn đến các vị trí khác trong cơ
th

1.1.
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis
[11],[17],[20],[67]
Apoptosis Necrosis
Tế bào chết theo “chương
trình”.
Tế bào chết “bất ngờ”
.
Là quá trình sinh lý, nhằm loại
bỏ
những tế bào hư hại hoặc không có
ích
trong cơ thể. Tế bào cũng có thể bị
c
ả
m
ứng apoptosis khi bị sự tác động
của
các tác nhân kích thích như các
h
ợ
p
chất gây độc tế bào, sự thiếu oxi
trong
mô, hoặc nhiễm
virút.
Là quá trình bệnh lý, xảy ra khi tế
bào
bị những tổn thương cơ học
nghiêm

ễ
m
s
ắ
c
cô đặc lại, có hiện tượng tạo
bóng
màng (blebbing), DNA bị phân
c
ắ
t
thành
những phân mảnh có kích thước
50-
300kb.
 Ở giai đoạn giữa, DNA tiếp
tục
b
ị
phân cắt thành những phân
m
ả
nh
có kích thước là bội số của
180bp,
t
ạ
o
thành “thang DNA” khi xuất hiện
trên

phồng lên và cuối cùng là bị ly
gi
ả
i,
giai đoạn cuối cùng này của
apoptosis
được gọi là “secondary
necrosis”
(hình
1.2).
 Chất nhiễm sắc giữ
nguyên
hình
thái. Nhân không thay
đổi.
 Sự phân cắt DNA không
đặ
c
hi
ệ
u,
tạo ra một hỗn hợp phân
m
ả
nh
không đồng nhất, khi xuất
hi
ệ
n
trên

trọng trong việc biến đổi hình thái đặc trưng của
apoptosis.
Các enzyme này thuộc họ cysteine protease, phân cắt protein ở vị trí sau
gốc
aspartic acid, vì thế chúng được đặt tên là caspase. Trong tế bào, một chuỗi
các
caspase tương tác hoạt hóa dây chuyền tạo nên hiện tượng được gọi là
“thác
caspase” (caspase-cascade) (xem hình 1.4). Khi chưa được hoạt hóa, các
caspase
tồn tại ở dạng bất hoạt (procaspase). Dựa trên sự tương đồng trong trình tự
amino
acid, 14 caspase được chia làm 3 nhóm nhỏ: ( xem bảng
1.2)
Bảng 1.2. Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế
bào
Nhóm
Vai
trò
Tên
caspase
I
Khởi sự
apoptosis
(caspase khởi
s
ự
)
Caspase-2
Caspase-8

ạ
t
hóa của procaspase theo cơ chế: hai hoặc nhiều procaspase tập hợp lại gần nhau,
do
procaspase không hoàn toàn mất đi hoạt tính phân cắt protein nên khi chúng tập
h
ợ
p
lại gần nhau, phân tử procaspase sẽ bị cắt tại vị trí gốc aspartic acid tạo ra một
ti
ể
u
phần lớn (khoảng 20 kDa) và một tiểu phần nhỏ (khoảng 10 kDa) đồng thời
phóng
thích prodomain. Sau đó, xảy ra quá trình nhị trùng hợp (dimer hóa), hình thành
liên
kết ái lực giữa đầu C của tiểu phần lớn với đầu N của tiểu phần nhỏ trình hình
thành
cấu trúc tetramer α2β2 gồm 2 tiểu phần lớn và 2 tiểu phần nhỏ [10],[24] ( hình
1.3).
Hình 1.3. Cơ chế tự hoạt hóa của caspase. Phân tử procaspase gồm có 3
phần:
Pro (prodomain) - L (tiểu phần lớn) -S (tiểu phần nhỏ)
[10]

Các caspase khởi sự: gồm có caspase-2, 8, 9 và 10 (xem hình
1.4)
Caspase-8, 9 và 10: có nhiệm vụ hoạt hóa các procaspase hành sự 3, 6 và
7.
Caspase-8 còn có thêm một chức năng gián tiếp tham gia vào con đường hoạt

Ngoài việc được các caspase khởi sự hoạt hóa, các caspase hành sự cũng
có
khả năng hoạt hóa lẫn
nhau.
Caspase-3 là một yếu tố chủ chốt thi hành apoptosis. Nó được hoạt hóa
b
ở
i
caspase-8, caspase-9, caspase-10, granzyme B và các yếu tố khác. Caspase-3
ch
ị
u
trách nhiệm phân cắt nhiều cơ chất mà một vài cơ chất trong số đó là
procaspase-6,
procaspase-9, PARP, ICAD (inhibitor of caspase- activated deoxyribonuclease).
T
ấ
t
cả các cơ chất của caspase-3 thông thường đều có chứa trình tự DEVD
(Asp-Glu-
Val-Asp).
Ngoài các caspase khởi sự, procaspase-6 có thể được hoạt hóa bởi
caspase-3,
nhưng không bị hoạt hóa bởi granzyme B. Caspase-6 cũng có thể hoạt hóa
l
ạ
i
procaspase-3 bằng con đường “positive
feedback”.
Trong khi đó, procaspase-7 lại có thể được hoạt hóa bởi granzyme

s
ẽ
truyền đi tín hiệu
apoptosis.
Những thụ thể gây chết là thành viên của hệ thống thụ thể TNF
(tumor
necrosis factor). Những thành viên của hệ thống thụ thể này thường liên kết
v
ớ
i
những ligand có cấu trúc tương tự TNF. FasL và TRAIL chính là những ligand
có
cấu trúc như thế [10]. TNFR1 và Fas (CD95) là hai trong số những thụ thể có
kh
ả
năng hoạt hóa apoptosis. Sự kết hợp giữa các ligand với receptor đặc hiệu như
sau:
FasL/FasR, TNFα/TNFR1 [20]. Trên domain nội bào của các receptor TNF
này
chứa một vùng đặc biệt gọi là “death domain”
(DD).
Để hoạt hóa yếu tố khởi sự apoptosis, cần phải có các phân tử protein nội
bào
làm cầu nối trung gian, các phân tử protein này được gọi là các adaptor.
TRADD
(TNF receptor – associated death domain) và FADD (Fas-associated death
domain)
là các adaptor tham gia vào quá trình truyền tín hiệu hoạt hóa apoptosis. Trên cả
hai
phân tử TRADD và FADD đều có chứa “death domain” có thể liên kết trực tiếp

Hình 1.6. Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF
[72]
Một phức hợp protein (phần “death domain" của thụ
th
ể
/adaptor/procaspase-8)
được gọi là DISC (death inducing signalling complex). Các caspase được
tuy
ể
n
chọn đến phức hợp DISC chủ yếu là procaspase-8, một vài trường hợp
là
procaspase-10. Trong phức hợp DISC, 2 phân tử procaspase-8 kết hợp với nhau
d
ẫ
n
đến sự tự hoạt hóa procaspase-8 thành caspase-8 hoạt động. Sau đó, con đường
ho
ạ
t
hóa tiếp theo của caspase-8 thay đổi tuỳ loại tế bào. Ở một số dòng tế bào
lympho,
caspase-8 hoạt động mạnh mẽ và có thể hoạt hóa trực tiếp procaspase-3
thành
caspase-3 dạng hoạt động. Ở một số tế bào khác, caspase-8 không hoạt hóa trực
ti
ế
p
procaspase-3 mà hoạt hóa thông qua con đường trung gian ty thể. Khi đó,
caspase-8