ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO THỰC
NGHIỆM CỦA MỘT SỐ BÀI THUỐC CỔ TRUYỀN HOẶC DÂN
GIAN Ở MỨC ĐỘ TẾ BÀO VÀ PHÂN TỬ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)

2.2.3. Phương pháp SRB (Sulforhodamin B) 15
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính caspase 16
2.2.5. Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang 18
2.2.6. Phương pháp phân tích DNA bộ gene (“thang DNA”) 19
2.2.7. Phương pháp flow cytometry. 20
2.2.8. Phương pháp microarray 21
2.2.9. Phương pháp real-time RT-PCR 22
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25
1. TUYỂN CHỌN CÁC BÀI THUỐC CÓ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO 25
2. THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ BÀI THUỐC 27 
3. SÀNG LỌC CÁC CAO CHIẾT DỰA VÀO TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO TRÊN BA
DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ NUÔI CẤY IN VITRO 27

4. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM NGỪNG CHU TRÌNH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG
APOPTOSIS CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA 33

4.1. Khả năng làm ngừng phân bào của bài thuốc BT3 trên dòng tế bào HeLa 33
4.2. Khả năng cảm ứng apoptosis của bài BT3 trên dòng tế bào HeLa 35
4.2.1. Kết quả thử nghiệm caspase 36
4.2.2. Quan sát sự biến đổi hình thái tế bào apoptosis 37
4.2.3. Phân tích sự phân mảnh của DNA bộ gene 38
5. NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA
TỪNG VỊ TRONG SỐ 5 VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA 39

5.1. Kết quả sàng lọc độc tính tế bào của 5 vị trong bài thuốc BT3 39
5.2. Kết quả xác định giá trị IC
50
của nước sắc từng vị 43
5.3. Kết quả xác định khả năng cảm ứng apoptosis của các vị có độc tính tế bào cao
trong bài thuốc BT3 45

50
) và APOPTOSIS
CỦA CÁC VỊ TRONG BT3. 140

7.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÔ MICROARRAY SỰ BIỂU HIỆN GENE 142
7.6. KẾT QUẢ REALIME-PCR ĐỊNH LƯỢNG 192
7.7. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH “dấu vân tay hóa học” BẰNG KỸ THUẬT HPLC 198

i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Thuật ngữ
AIF Apoptosis-Inducing Factor: nhân tố cảm ứng apoptosis
AO acridine orange
ATF4 Activating transcription factor 4
BAX B-cell lymphoma-extra large
BCL-2 B-cell lymphoma 2
BSA Bovine serum albumin
Cdc2 cell division cycle 2
Cdc25C cell division cycle 25 homolog C
CEBPB CCAAT/enhancer-binding protein beta
CHOP Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), Oncovin
(vincristine), and Prednisone/prednisolone
COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Bệnh tắt nghẽn phổi mãn
tính
Cpt Camptothecin
CREB3L2 cAMP responsive element binding protein 3-like 2
CRYAB crystallin, alpha B
Ct Cycle Threshold: Chu kỳ ngưỡng

mRNA RNA thông tin
MTT 3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide
NCCAM National Center for Complementary and Alternative Medicine:
Trung tâm Y học cổ truyền Quốc gia của Hoa Kỳ
NCI National Cancer Institute: Viện Ung thư Hoa Kỳ
NCI-H460 tế bào ung thư phổi
NUPR1 nuclear protein, transcriptional regulator, 1
OD Opticcal density: Mật độ quang
PBS Phosphate buffered saline
pf Primer forward: mồi xuôi
PI propidium iodide
pr Primer reverse: mồi ngược
iii

RD tế bào ung thư cơ
Rf Rate of flow
RNA ribonucleic acid
RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction
SERPINE 2 Serpine peptidase inhibitor, member 2
SRB Sulforhodamine B
STC2 Stanniocalcin 2
STD Standard deviation: độ lệch chuẩn
TRIB3 Tribbles homolog 3
WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế Thế giới
YHCT Y học cổ truyền
HeLa 40

Bảng 9 - Giá trị IC50 của nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá, Bạch thược, Chi tử
trên dòng tế bào HeLa 43

Bảng 10 - Kết quả thử nghiệm caspase-3 trên nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá
và Bạch thược 45

Bảng 11- Kết quả phân tích microarray một số gene tăng biểu hiện ở tế bào HeLa xử lý với
bài thuốc BT3 52

Bảng 12 - Kết quả độ ẩm của Hoàng Liên 55
Bảng 13 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng Liên 55
Bảng 14 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng Liên 55
Bảng 15 - Kết quả định lượng của Hoàng Liên 57
Bảng 16- Kết quả độ ẩm của Hoàng cầm 58
Bảng 17 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng cầm 58
Bảng 18 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng cầm 58
Bảng 19 - Kết quả định lượng của hoàng cầm 59
Bảng 20- Kết quả độ ẩm của Hoàng bá 60
Bảng 21 - Kết quả tro toàn phần của Hoàng bá 61
Bảng 22 - Kết quả tro không tan trong HCl của Hoàng bá 61
Bảng 23 - Kết quả định lượng của Hoàng bá 63
Bảng 24 - Kết quả độ ẩm của Bạch thược 64
Bảng 25 - Kết quả tro toàn phần của Bạch thược 64
Bảng 26 - Kết quả tro không tan trong HCl của Bạch thược 64
Bảng 27 - Kết quả định lượng của Bạch thược 65
Bảng 28 - Kết quả độ ẩm của Chi tử 67
Bảng 29 - Kết quả tro toàn phần của Chi tử 67
Bảng 30 - Kết quả tro không tan trong HCl của Chi tử 67


Hình 11 - Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (400 X) tế bào HeLa có và không
có xử lý thuốc. 37

Hình 12 - Kết quả điện di trên gel agarose của DNA bộ gene 38
Hình 13- Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô chứng (400X) 41
Hình 14 - Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô thử nghiệm(400X) 42
Hình 15 - Đồ thị so sánh các giá trị IC50 của từng vị và toàn bài thuốc 44
Hình 16 - Kết quả thử nghiệm phân mảnh DNA trên tế bào HeLa sau 40 giờ cảm ứng với
nước sắc Hoàng liên và Hoàng cầm 47

Hình 17 - Hình ảnh tế bào HeLa ở mẫu chứng (A, B) và khi xử lí với Hoàng cầm và Hoàng
liên (C, D, E, F) sau 15 giờ và 24 giờ dưới KHV huỳnh quang(400X) 48

Hình 18 - Mức độ biểu hiện một số gene xác định bằng kỹ thuật real-time RT-PCR 52
Hình 19 - Kết quả soi bột của Hoàng Liên 54
Hình 20 - Kết quả sắc ký đồ của Hoàng liên 56
Hình 21 - Kết quả soi bột của Hoàng Cầm 57
Hình 22 - Kết quả sắc ký đồ của Hoàng cầm 59
Hình 23 - Kết quả soi bột của Hoàng bá 60
Hình 24 - Kết quả sắc ký đồ của Hoàng bá 62
Hình 25 - Kết quả soi bột của Bạch thược 63
Hình 26 - Kết quả sắc ký đồ của Bạch thược 65
Hình 27 - Kết quả soi bột của Chi tử 66
Hình 28- Kết quả sắc ký đồ của Chi tử 68
Hình 29 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng liên trong cao toàn phần 70
Hình 30 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng bá trong cao toàn phần 71
Hình 31 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Hoàng cầm trong cao toàn phần 72
Hình 32 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Chi tử trong cao toàn phần 73
Hình 33 - Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Bạch thược trong cao toàn phần 74

Độ, đầu tư mạnh vào nghiên cứu cơ bả
n và ứng dụng trong lĩnh vực này. Trong
vòng 5 năm qua, Trung Quốc đã đầu tư 740 triệu nhân dân tệ (92,5 triệu đô la Mỹ)
cho nghiên cứu phát triển YHCT.
Trong số các bệnh có khuynh hướng tăng dần với mức độ phát triển của xã hội
như tiểu đường, béo phì, tim mạch, ung thư các dạng cũng ngày càng trở thành vấn
đề lớn của lĩnh vực Sức khỏe cộng đồng. Tỉ lệ mắc và t
ử vong do ung thư trên thế giới
hiện nay tăng 22% so với năm 1990. Bên cạnh việc tìm kiếm hoạt chất mới, khả năng
sử dụng phối hợp nhiều hoạt chất đã biết nhằm tạo hiệu quả cộng hưởng là cách tiếp
cận thực tế và mang tính khả thi cao. Nguyên lý của YHCT phù hợp với cách nhìn
hiện đại này. Điều đó được chứng tỏ qua số lượ
ng tăng dần của các công trình nghiên
cứu về YHCT, đặc biệt là YHCT Trung Quốc, chỉ tính riêng trong lĩnh vực điều trị
class="bi x23 y105 w4 h0"
class="bi x23 y105 w4 h0"
2

ung thư, ở nhiều nước tiên tiến. Theo đánh giá của WHO, giống như ở Trung Quốc,
Hàn Quốc và Triều Tiên, YHCT thực sự là một phần của hệ thống Y tế ở Việt Nam,
với khoảng 30% bệnh nhân được điều trị bằng YHCT.
Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào được
công bố về cơ chế hoạt động của bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian m
ặc dù có nhiều
bài thuốc đã được truyền miệng, và sử dụng khá rộng rãi. Việc phát triển những công
cụ cho phép đánh giá hiệu quả tác động, chất lượng của các bài thuốc cổ truyền hoặc
dân gian sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc đánh giá, khai thác vốn quý của
nước ta vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe.
Trong định hướng phát triển về YHCT trên, Đề tài “Nghiên cứu khả n
ăng


Thu nhận 5 bài thuốc dựa trên y văn và thông tin lưu truyền
Thu dịch chiết nước từ 5 bài thuốc
Khảo sát khả năng gây độc của 5 bài thuốc trên 3 dòng tế bào ung thư
Chọn bài có khả năng gây độc tế bào cao nhất
Nghiên cứu khả năng cảm ứng apoptosis của bài thuốc đã chọn trên

(8) Kết quả phân tích bằng microarray biểu hiện một số gene chủ chốt trong quá
trình phân bào và gây apoptosis trên một dòng tế bào ung thư nuôi cấy. Chọn
khoảng 06 gene có sự thay đổi biểu hiện quan trọng nhất dùng làm “dấu ấn
sinh học”
(9) 06 quy trình realtime RT-PCR để nghiên cứu biểu hiện của 06 gene đã chọn.
(10) Quy trình Western blot với một số kháng thể đặc hiệu cho các protein
nghiên cứu.
(11) Sắc ký đồ của dịch/cao chiết nước hoặc methanol
(12) Kết quả ΔCt của 06 gene nghiên cứu.
(13) K
ết quả về giá trị sử dụng của “dấu vân tay” hóa học và sinh học trong
việc đánh giá chất lượng và độ ổn định của bài thuốc.
(14) Kết quả Western blot
(15) Báo cáo toàn văn, báo cáo tóm tắt, đĩa CD.
5

TỔNG QUAN
Ung thư các dạng ngày càng trở thành vấn đề lớn của lĩnh vực Sức khỏe cộng
đồng. Theo báo cáo của WHO (2003), khoảng 10 triệu ca mắc mới được ghi nhận
hàng năm với trên 6 triệu ca tử vong. Năm 2002, các con số này là 11 triệu và 7 triệu
người chết do ung thư các loại. Tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư trên thế giới hiện nay
tăng 22% so với năm 1999.
Hướng nghiên cứu về dượ
c liệu, đặc biệt là dược liệu chống ung thư, đã phát
triển từ khá lâu trên thế giới và đã góp phần cung cấp một số hoạt chất kháng ung thư
hữu hiệu đang được sử dụng cho điều trị như Taxol, Vinblastin, Bên cạnh hợp chất
tự nhiên chiết từ cây-con, các bài thuốc cổ truyền ngày càng được nhiều nhóm quan
tâm nghiên cứu bằng nhiều công cụ hiện đại như các ph
ương pháp sàng lọc độc tính tế
bào (MTT, SRB), các phương pháp nghiên cứu cơ chế chống ung thư ở mức độ phiên

mong muốn của vị chính, (4) sứ dược, có tác dụng dẫn thuốc và điều hòa các vị trong
bài thuốc. Hơn 100 loại dược liệu thường được phối hợp trong các bài thuốc được
phân thành 6 nhóm: thanh nhiệt giả
i độc (45 %), hành khí hoạt huyết (21 %), hóa đàm
trừ thấp (12 %), nhuyễn kiên tán kết (7 %), dĩ độc trừ độc (8 %), bổ dưỡng (7 %).
Theo báo cáo đánh giá của WHO (2008), YHCT, bao gồm ba nền y học cổ
truyền lớn là YHCT Trung quốc, Ấn độ (Ayurveda) và Hy lạp/Ả rập (Unani), có vai
trò quan trọng không chỉ ở khu vực kém phát triển trên thế giới mà còn có ảnh hưởng
tăng dần ở các nước phương Tây. Tuy nhiên “việc tăng sử dụng các phương pháp và
sản phẩm của YHCT không đi đôi với sự tăng về số lượng cũng như chất lượng của
các chứng cứ khoa học tương ứng”. Ý thức về những hạn chế và nhu cầu cải thiện
tình hình hiện tại của YHCT trên thể hiện rõ ở mức quốc gia và khu vực với sự hình
thành những trung tâm nghiên cứu lớn về YHCT trên toàn thế giới. Ở châu Á, cái nôi
củ
a hai nền YHCT lớn, nhiều trung tâm nghiên cứu quốc gia về YHCT hoạt động
mạnh ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ. Châu Phi thống nhất xây dựng Bản Tuyên bố
Abuja 2000 về vai trò YHCT trong phòng chống và điều trị sốt rét (Abuja Declaration
on Roll back Malaria) với sự tham gia của 53 quốc gia của Lục địa Đen. Nghị viện
châu Âu ra tuyên bố “Cách tiếp cận của châu Âu đối với các nền y học không truyền
thống” (A European Approach to Non-conventional Medicines) năm 1999 nhằm thúc
đẩy sự thừa nhận chính thức YHCT trong các trường đại học y và khuyến khích việc
sử dụng YHCT trong các bệnh viện. Song song đó, cơ quan châu Âu về đánh giá sản
phẩm từ dược liệu (European Agenecy for the Evaluation of Medicinal Products) cũng
bắt đầu phát triển việc xác lập các tiêu chuẩn về an toàn, hiệu quả và chất lượng của
thảo dược từ 1997. Hoa Kỳ có nền nghiên cứu về YHCT phát triển với nhiều trung
tâm nghiên cứu YHCT đặ
t tại các trường đại học lớn như Maryland, Harvard,
Columbia, và Trung tâm Quốc gia Hoa Kỳ về YHCT (US National Center for
7


để xác định “dấu vân tay” hóa học của các bài thuốc (Liang & cs, 2004; Chavan & cs,
2006). Trong phương pháp này, người ta dựa vào một số chất chuẩn có hiện diện
trong hợp chất/bài thuốc để kiểm tra sự lặp lại của phổ sắc ký của hợp chất/bài thuốc
cho mỗi lần tách chiết. Từ đó đánh giá được độ ổn định về thành phần hóa học của sản
phẩm khi sử dụng những nguyên liệu và quy trình thu nhận xác định.
8

Để đánh giá tính ổn định về mặt sinh học của hợp chất tự nhiên/bài thuốc thì gần
đây, phương pháp “dấu vân tay đáp ứng sinh học” (biological response fingerprinting)
được đề xuất dựa trên sự biểu hiện của một tập hợp các gene chỉ thị cho đáp ứng của
tế bào chủ đối với một hợp chất xác định. Một số công trình cho thấy có thể sử dụng
“dấ
u ấn đáp ứng sinh học ở mức độ bộ gene” để kiểm soát chất lượng của hợp chất có
hoạt tính sinh học, và cả những bài thuốc cổ truyền có thành phần phức tạp (Liang &
cs, 2004; Chavan & cs, 2006). Trước tiên, người ta so sánh biểu hiện các gene trong
toàn bộ bộ gene ở tế bào có xử lý “thuốc” với biểu hiện tương tự ở tế bào không xử lý
dựa trên phương pháp microarray. Từ kết quả
phân tích trên microarray, người ta chọn
ra một tập hợp gene có liên quan đến hoạt tính sinh học mong muốn và có biểu hiện
tăng/giảm rõ rệt khi xử lý “thuốc”. Biểu hiện của tập hợp gene này được xem là “dấu
ấn đáp ứng sinh học ở mức độ bộ gene” của một hợp chất hay bài thuốc xác định và sẽ
được định lượng bằng kỹ thuật realtime RT-PCR (để xác định mức độ tăng/gi
ảm biểu
hiện). Mức độ tăng/giảm biểu hiện của các gene “chỉ thị” xác định được chính là chỉ
số dùng để kiểm soát chất lượng của hợp chất/bài thuốc cho những lần thử nghiệm
hay sản xuất sau đó. Do bản chất về mặt hóa học của bài thuốc là vô cùng phức tạp
nên việc sử dụng “dấu vân tay hóa học” không thể hiện hết các biế
n động về thành
phần các hoạt chất hiện diện trong bài thuốc mà chỉ cho thấy vài hoạt chất có hàm
lượng cao (mặc dù chưa chắc có hoạt tính sinh học chủ chốt). Do đó, phương pháp

nhiều phản hồi về việc trong chế phẩm có chứa các thành phần tạp nhiễm nguy hiểm
như estrogene diethylstilbestrol (DES – là một dạng thuốc tránh thai, có nguy cơ gây
ung thư tử cung và ung thư vú), warfarin và indomethacin (một dạng thuốc kháng
viêm không thuộc họ steroid). Điều này đã khiến Trung tâm YHCT Quốc gia của Hoa
Kỳ (National Center for Complementary and Alternative Medicine –NCCAM) ngừng
cung cấp kinh phí cho các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng của PC–SPES. FDA
c
ũng đã thu hồi toàn bộ sản phẩm PC-SPES có trên thị trường và khuyến cáo người
dân ngừng sử dụng chế phẩm này vào cuối năm 2002 cho đến khi thành phần của bài
thuốc được chuẩn hóa chặt chẽ (Ruan & cs, 2006).
Bài thuốc “Hoàng liên giải độc thang” gồm 4 vị: Hoàng liên (Coptis sinensis
Franch), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr), Hoàng cầm (Scutellaria
baicalensic Georg), và Chi tử (Gardenia fzorida L) cho thấy khả năng ức chế tăng
sinh dòng tế bào u tủy và cảm ứng apoptosis theo con đường trung gian ti th
ể (Ma &
cs, 2005). Bài thuốc làm giảm hàm lượng cyclin A, cyclin B1, Cdc2 và Cdc25C, làm
ngừng chu trình tế bào. Nó cũng làm tăng sự biểu hiện của Bax và Bak, giảm sự biểu
hiện của Bcl-2 và Bcl-XL, khởi động con đường apoptosis qua ti thể trên dòng tế bào
HepG2 và PLC/PRF/5. Hiệu quả ức chế của bài thuốc lên sự tăng trưởng khối u cũng
10

đã được chứng minh trong mô hình chuột nude với khối u dị ghép tế bào ung thư gan
(Hsu & cs, 2008).
Bài thuốc Wikyungtang gồm 4 loại thảo dược là Phragmitis rhizome (từ rễ cây
Pragmites cimmunis T.), Coicis semen (hạt cây Ý dĩ -Coix lachryma-jobi var),
Benincasae semen (hạt cây Benincasa hispida), Persicae semen (hạt cây Đào –Prunus
persica B.) có nguồn gốc từ Trung Quốc. Các nghiên cứu in vitro trên bài thuốc cho
thấy bài thuốc có tính kháng viêm thông qua sự ức chế biểu hiện cyclooxygenease-2
(COX-2) và ức chế sự tăng sinh và c
ảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi

bắt đầu được công bố nhiều trong thời gian gần đây. Hoạt tính sinh học được quan
tâm khá phong phú và được chiết xuất từ mộ
t phổ thực vật rộng bằng các phương
pháp hóa học phù hợp. Các hoạt tính sinh học này bao gồm tính kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng ung thư, chống oxy hóa và nhiều tính năng điều trị khác (Ninh Khắc Bản
& cs, 2004; Nguyễn Quốc Khang & cs, 2004). Riêng đối với hoạt tính kháng ung thư,
các nhóm nghiên cứu chủ yếu sử dụng một số dòng tế bào ung thư người như MCF-7
(ung thư vú), HepG-2 (ung thư gan), RD (ung thư cơ), KB (ung thư biểu bì), Hep-2
(ung thư thanh quản),
để thử tính gây độc tế bào của hợp chất tự nhiên bằng phương
pháp MTT (cytotoxic assay) (Đỗ Khắc Hiếu & cs, 2004; Lê Mai Hương & cs, 2005;
Lê Minh Hà & cs, 2007; Đỗ Thị Thảo & cs, 2007). Một số ít công trình sử dụng mô
hình chuột gây ung thư in vivo để thử hoạt tính kháng ung thư của hợp chất tổng hợp
hay tự nhiên (Trần Công Yên & cs, 2005). Kết quả cho thấy nhiều cây, và cả nhiều chi
cây bản địa có tác dụng gây độc tế bào rất cao, cần
được nghiên cứu sâu hơn, hướng
đến khả năng sử dụng làm thuốc trị ung thư. Trong nước hiện chưa có công trình nào
công bố về việc nghiên cứu bài thuốc chống ung thư bằng các phương pháp hiện đại.

3. Cơ sở thực hiện hướng nghiên cứu của đề tài.
Trong điều trị ung thư, một trong những mục tiêu quan trọng là nhắm đến việc
khởi phát con đường ch
ết theo chương trình (apoptosis) ở tế bào khối u.
Đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số bài
thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử” là sự tiếp nối các đề tài
của nhóm nghiên cứu từ trước đến nay. Trong giai đoạn 2002-2005, nhóm nghiên cứu
đã xây dựng các phương pháp và quy trình thực nghiệm để: (1) nuôi cấy các dòng tế
bào ung thư người, (2) sàng lọc tính gây độc tế
bào (các phương pháp MTT, SRB,
Trypan blue, clonogeneic), (3) khảo sát hiện tượng apoptosis (chết theo chương trình)

Citrus reticulata) 20 g, sử dụng
phần vỏ (pericarpium citri reticulatae), Bán hạ chế (Typhonium divaricatum) 30 g,
Bạch linh (Poria cocos) 30 g, Cam thảo (Glycyrrhiza spp.) 10 g, Bán chi liên
(Scutellaria barbata) 30 g
- Hoàng liên giải độc thang (BT3) gồm: Hoàng liên (Coptis chinensis) 30 g,
Hoàng bá (Phellodendron chinense) 30 g, Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) 30 g,
Bạch thược (Paeonia lactiflora) 20 g, Chi tử (Gardenia jasminoides) 20 g.
- Tiểu tích nhuyễn kiên phương (BT4): Bán chi liên (Scutellaria barbata) 30 g,
Bạch hoa xà (Hedyotis diffusae) 30 g, Bạch thược (Paeonia lactiflora) 30 g, Mẫu lệ
(Ostrea gigas) 30 g
Bốn bài thuốc trên do PGS TS Nguyễn Thị Bay, khoa Y học cổ truyền, Đạ
i học
Y Dược Tp HCM cung cấp.
- Nam địa long (BT5) gồm: Giun đất (Pheretima aspergillum) 10 g, Đậu xanh
(Vigna radiata) 20 g, Đậu đen (Vigna unguiculata) 20 g, Bù ngót (Sauropus
androgynus L Merr.) 40 g.
MCF-7 HeLa NCI-H460
H
ình 1 - Các dòn
g
tế bào sử dụn
g
tron
g
đề tài
14

Bài thuốc do Lương y Nguyễn An Định cung cấp công thức. Dược liệu khô sử
dụng trong đề tài đến từ Công ty cổ phần Dược Trung Ương Mediplantex –Hà Nội.
2.2. PHƯƠNG PHÁP

lại 3 lần).
- Cho 2 ml dung dịch Trypsin/EDTA vào để tách tế bào (khoảng 3 phút).
- Loại bỏ nhanh Trypsin/EDTA, vỗ
nhẹ hai thành bình. Thêm 1 ml môi trường
nuôi cấy. Dùng pipette huyền phù nhẹ tế bào. Chuyển dịch tế bào vào bình Roux. Bổ
sung 5 ml môi trường nuôi cấy vào bình.
15

- Ủ trong tủ ấm 5% CO
2
, 37
0
C.
- Thay môi trường mới sau 2 ngày nuôi cấy.
2.2.3. Phương pháp SRB (Sulforhodamin B)
Chúng tôi sử dụng có biến đổi quy trình do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ
(NCI) công bố (In Vitro Cancer Cell Line Screen – Manual of Operations (08/2005)).
Nguyên lý của phương pháp dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm màu SRB với
protein hiện diện trong mẫu nhờ liên kết tĩnh điện, từ đó đo lượng protein tổng. Lượng
SRB đo được sẽ tỉ lệ thuận vớ
i lượng protein và phản ánh tình trạng sống/chết của tế
bào.
Thiết kế thí nghiệm: mỗi đĩa bao gồm 1 mẫu chứng dương (Camptothecin 0.01
µg/ml), 1 mẫu chứng âm (môi trường) và 1 mẫu chứng dung môi pha thuốc. Mỗi mẫu
thử gồm một giếng trắng (blank) và 3 giếng tế bào lặp lại.
Quy trình như sau:
- Các dòng tế bào ung thư (từ thế hệ 4 đến 20) được nuôi trong môi trường
E’MEM có bổ sung 10 % FBS (Fetal Bovine Serum) ở 37
0
C và 5 % CO