BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUỲNH THỊ NGÂN TÂM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
CỦA CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN



Giảng viên hướng dẫn:
Ks VŨ LỆ QUYÊN
Th.s NGUYỄN THỊ THANH HẢI
Nha Trang - 2012

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Họ, tên SV: Huỳnh Thị Ngân Tâm Lớp: 50CB
Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã ngành: 102
Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN
PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP ”
Số trang: 63 Số chương: 03 Tài liệu tham khảo:

NHẬN XÉT:
KẾT LUẬN: Nha Trang, ngày tháng năm 2012
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN


Trang
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ iii
MỞ ĐẦU iv
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1
1.1.Tổng quan về chitin-chitosan, chitosan phân tử lượng thấp 1
1.1.1. Chitin-chitosan 1
1.1.2. Chitosan phân tử lượng thấp 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất chitosan và chitosan oligosaccharide 7
1.1.4. ứng dụng của chitosan và chitosan oligosaccharide 8
1) ứng dụng của chitosan 8
2) ứng dụng của chitosan oligosaccharide 16
1.2. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của một số vi sinh vật 16
1.2.1. E.Coli 16
1 2.2. Staphylococcus aureus 17
1.2.3. Salmonella 18
1.2 4. Listeria 19
1.6.Cơ chế kháng khuẩn của chitosan 20
• Đặc tính kháng khuẩn của chitosan 20
• Cơ chế kháng khuẩn của chitosan 20
1.7. Một số nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng
thấp 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 ii

4 Salmonella Salmonella typhi
5 Listeria Listeria monocytogenes
6 COS Chitosan olygosaccharide

vDANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

STT

Tên hình Trang

1 Hình 1: Chitosan dạng vảy. 9
2 Hình 2: Công thức cấu tạo của chitin và chitosan. 11
3 Hình 3: Chitosan phân tử lượng thấp. 12
4 Hình 4: Hình ảnh kết quả kháng E.Coli. 36
5 Hình 5: Biểu đồ kết quả kháng E.Coli của C, C1 ở 60 phút (a), 90 phút
(b), 10 phút (c).
37
6 Hình 6: Biểu đồ kết quả kháng E.Coli của C (a), C1 (b) theo nồng độ và
thời gian.

Là một trong những ngành kinh tế trọng tâm của nền kinh tế quốc dân, ngành thủy
sản đã góp một phần không nhỏ vào nền kinh tế. Cùng với nhịp độ phát triển của nền
kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những
thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến thủy sản cũng như xuất nhập khẩu. Nhưng đi
cùng với sự phát triển của ngành, vấn đề phế liệu trong chế biến thủy sản là một điểm hạn
chế do lượng phế liệu thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản hàng năm là rất lớn. Nếu
không có biện pháp xử lý thích hợp sẽ gây ra ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Vì vậy
những yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh mà chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ đang
ngày càng trở nên cấp bách. Đây là nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất chitin -
chitosan và chitosan phân tử lượng thấp. Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất
chitin-chitosan và chitosan phân tử lượng thấp là rất quan trọng để nâng cao giá trị sử
dụng phế liệu này và làm sạch môi trường.
Chitosan là một polysaccharide có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua, ghẹ. Đặc tính của
chitosan là không tan trong nước, có thể hòa tan trong acide nhẹ và có khả năng kháng
khuẩn cao. Hiện chitosan đang được các nhà công nghệ chế biến nghiên cứu sử dụng
trong nhiều lĩnh vực công nghệ. Trong công nghệ sau thu hoạch, chitosan được sử dụng
làm màng bao bên ngoài của các các loại trái cây như xoài, chôm chôm,… để hạn chế sự
thoát hơi nước và kháng khuẩn. Vì thế khi nhúng chitosan bên ngoài trái cây sẽ tạo cho
trái cây có cảm quan đẹp bóng, giúp kéo dài thời gian bảo quản trái cây. Trong lĩnh vực
chế biến thủy sản, chitosan được dùng để xử lý thịt, cá, tôm nhằm hạn chế sự hao hụt
khối lượng trong quá trình cấp đông cũng như hạn chế sự phát triển của VSV gây hư
hỏng sản phẩm, không những thế thủy sản sẽ có chất lượng cảm quan tốt hơn
Từ chitosan, Thái Viết Chiêu đã nghiên cứu thủy phân chitosan thành chitosan
phân tử lượng thấp với mục đích nâng cao khả năng kháng khuẩn và tăng khả năng hòa
tan của chitosan, từ đó mở rộng phạm vi ứng dụng của chitosan. vii
Hiện nay các hóa chất bảo quản thực phẩm như hàn the, Urea bị cấm sử dụng
trong lĩnh vực xuất khẩu thủy sản, thì đây là một con đường mới để chúng ta nghiên cứu


Trong đó, n: thay đổi tùy thuộc từng loại nguyên liệu
Ví dụ: Tôm thẻ: n = 400 – 500
Tôm hùm: n = 700 – 800
Cua: n = 500 – 600
- Phân tử lượng trung bình của chitin = (203,09)
n
[2]
Chitin-chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, chúng
được tạo ra trung bình 20g/năm/m
2
bề mặt trái đất. Đây là một loại phân tử đã tồn tại trên
trái đất từ rất lâu với hóa thạch thuộc kỷ Oligocene cách đây 24,7 triệu năm ( Stankiewicz
et al.1997 ). Lịch sử của chitin bắt đầu bằng sự phát hiện của một giáo sư người Pháp,
Henri Braconnot năm 1811 đăng trên tạp chí khoa học Ann. Chim. Phys. ( Paris ) với tựa
đề “Sur la nature des champignons ” ( Tạm dịch: Các nghiên cứu về bản chất của các loài
nấm ); trong đó, ông mô tả một loại vật liệu không hòa tan trong kiềm từ các loại nấm
bậc cao mà ông đặt tên là “fungine”. Hai mươi năm sau, Odier tách chiết được một phân
đoạn tương tự từ vỏ côn trùng mà ông đặt tên là Chitin theo gốc từ Hy Lạp có nghĩa là vỏ
bọc. Sinh tổng hợp của chitin trong sinh quyển rất lớn từ các loài động thực vật khác
nhau. Chỉ tính riêng cho các loài giáp xác trong thủy quyển, ước tính khối lượng chitin
sinh tổng hợp mỗi năm khoảng 2,3x10
9
tấn ( Jeuniaux et al.,1993 ).[3]
Chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết với protein dưới dạng phức hợp,
cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết. Chitin
là một polysaccharide được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu
nối 1,4 - glucozide. Chitin có cấu trúc hóa học giống cellulose và có thể xem là một dẫn
xuất của cellulose với nhóm acetamido ở cacbon số 2. Chitin đóng vai trò là thành phần
tạo nên độ cứng chắc của vỏ giáp xác. Hàm lượng chitin biến đổi theo từng loại nguyên

3

• Chitosan Hình 1: Chitosan dạng vảy

Công thức phân tử của chitosan [C
6
H
11
O
4
N]
n

acetic, acide propionic, acid citric, acide lactic…Khi hòa tan chitosan trong môi trường
acid loãng tạo thành keo dương, nhớt và trong suốt. Đây là một điểm rất đặc biệt của
chitosan vì đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dương
sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm, có khả năng tạo phức với các ion
kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm… , nhờ đó mà keo chitosan không
bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb, Hg,…
- Chitosan kết hợp với aldehyde trong điiều kiện thích hợp, hình thành gel, đây là
cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. 5

- Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod
trong môi trường H
2
SO
4
cho phản ứng màu tím, phản ứng này có thể dùng để phân tích
định tính chitosan.[3],[4]

1.1.2. Chitosan phân tử lượng thấp
Hình 3: Chitosan phân tử lượng thấp

Chitosan phân tử lượng thấp thu được bằng quá trình thủy phân chitosan trạng thái
rắn bằng hydroperoxit. Tùy theo từng điều kiện, chế độ thủy phân mà các chitosan phân
tử lượng thấp này có khối lượng phân tử khác nhau (số n khác nhau).
Tốc độ hấp thụ của chitosan oligosaccharide trong cơ thể con người là gần 100%

môi trường thủy sản 2,…Trong đó, các kết quả công bố gần đây của các nhà khoa học
thuộc trường Đại học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở
bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ
enzyme.
Đáng kể nhất là các công trình của Trần Thị Luyến và các cộng sự đã sử dụng
enzyme papain, chitinase và vi khuẩn lactic trong công nghệ sản xuất chitosan. Những
kết quả này đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu thủy sản, giảm thiểu
nguồn ô nhiễm môi trường ở nước ta và trước những yêu cầu khắt khe về chất lượng
chitin-chitosan trên thị trường hiện nay.
Như vậy, với tính ưu việt của chitosan như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,
chống mất nước trong quá trình bảo quản, dễ rửa trôi trước khi đưa thực phẩm vào chế 7

biến, dễ tiêu hủy, đặc biệt dễ hòa hợp và không gây độc đối với người sử dụng, chitosan
ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm. Với những tính chất của nó,
có thể chitosan còn rất nhiều những ứng dụng tiềm ẩn mà các nhà khoa học đang nghiên
cứu, khám phá.
Năm 1996, nhóm tác giả Lưu Văn Chính, Châu Văn Minh, Phạm Hữu Điền, Trịnh
Đức Hưng, Đặng Lan Hương thuộc Viện hóa học các hợp chất hữu cơ, Trung tâm Khoa
học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã nghiên cứu điều chế chế phẩm bảo quản thực
phẩm BQ - 1 từ hỗn hợp dung dịch 1,5% chitosan (trong dung dich acid acetic loãng) và
0,5% hỗn hợp các chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa và thối rữa thực phẩm, đồng
thời đã thử nghiệm khả năng bảo quản trứng gà tươi ở nhiệt độ thường. Theo nhóm tác
giả này, sau 12 ngày trứng gà đã qua xử lý BQ-1 vẫn giữ nguyên phẩm chất của trứng gà:
lòng đỏ tươi đều, còn nguyên vẹn, mùi tươi trong khi mẫu đối chứng đã vữa hoàn toàn.
[5], [6]
Qua nghiên cứu của Châu Văn Minh và cộng sự thuộc Viện Hóa học các hợp chất
tự nhiên, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã diều chế được chế

kiện môi trường bình thường.[4], [9]
• Trong công nghiệp thực phẩm
- Chitosan được sử dụng để bảo quản thực phẩm, trái cây do dịch keo chitosan
(keo dương) có tác dụng chống mốc, chống sự phá hủy của một số nấm men, vi sinh vật
Gram (-) trên các loại hoa quả.
- Chitosan được sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh,
làm đông thực phẩm.
- Chitosan được sử dụng như một polymercationit trong sản xuất agarose chất
lượng cao từ agar có chất lượng kém.
- Chitosan có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các chất khác nên nó được
ứng dụng vào việc khử màu đồ uống.
- Do chitosan có tính diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói
thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước.
- Màng mỏng chitosan dùng trong thực phẩm: Chitosan không hòa tan trong
nước, kiềm, alcol và cetol nhưng tan trong dung dịch axit loãng, chitosan tạo trạng thái
keo. Dung dịch keo này khi bao phủ trên mặt sản phẩm sẽ tạo thành một lớp màng bảo vệ 9

bán thấm. Các phương pháp dùng chitosan bảo quản quả tươi dựa trên tính chất này, lớp
màng bảo vệ này có thể hạn chế sự bay hơi nước của rau quả, giảm bớt cường độ hô hấp.
Phương pháp sử dụng màng Chitosan đã cho kết quả tốt ở Anh, Úc khi bảo quản táo và
một số rau quả ôn đới khác trong thời gian từ 5 – 6 tháng.
Phòng Polymer Dược Phẩm -Viện Hóa Học- Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên Và
Công Nghệ Quốc Gia đã nghiên cứu công nghệ bảo quản rau quả. Chế phẩm dùng để bảo
quản rau quả là PDP, nó là một dung dịch trên cơ sở Chitosan, PDP không độc, có hoạt
tính sinh học cao, có tác dụng tạo màng, ức chế sự phát triển các loại vi khuẩn và nhiều
loại nấm. Bảo quản quả tươi bằng PDP: Quả tươi đã lựa chọn sau đó nhúng vào dung
dịch khử trùng 1%, sau đó vớt ra để ráo và tiếp tục nhúng vào dung dịch PDP trong 1

phẫu thuật phá da. Màng polymer được nghiên cứu trên fibrolasts và tế bào lòng mạch,
đó là 2 yếu tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình liền vết thương, đặc biệt ở giai đoạn
sớm.
Kết quả bước đầu cho thấy màng polymer sinh học thu được có những tính năng
cần thiết để điều trị vết thương. Màng trong suốt có độ mềm, dẻo và đàn hồi. Màng có tác
dụng tốt trên tế bào, không gây độc cho tế bào biểu mô, có tác dụng kháng nấm, kháng
khuẩn làm vết thương mau lành. Qua nghiên cứu người ta thấy rằng sử dụng màng
polymer sinh học đã hạn chế đáng kể số lần thay băng, tiết kiệm thuốc, nhanh khỏi bệnh
và giảm sự đau đớn của bệnh nhân.
- Dùng làm thấu kính tiếp xúc: Ở Mỹ, Revlon Bave Hing đã được cấp bằng sáng
chế của Đại học Wasington là sản xuất ra thị trường một thấu kính tiếp xúc không có tính
chất quang học từ dẫn xuất của Chitin. Các nhà nghiên cứu nghĩ rằng nó có thể giúp cho
việc làm sẹo hóa các giác mạc bị tổn thương.
- Dùng làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng: Khoa Dược – Trường
Đại học Y Dược Tp.HCM đã nghiên cứu từ chitin – chitosan điều chế ra các loại gel: Gel
chitosan, gel chitosan+ Al(OH)
3
, gel chitin.
Gel chitosan: Hòa tan Chitosan trong dung dịch HCl 15% sau đó thêm dung dịch
NaOH để cho pH = 8 – 8.5, rửa với nước và sấy khô.
Gel chitosan + Al(OH)
3
: Hòa tan Chitosan trong dung dịch HCl 15% sau đó thêm
dung dịch NaAlO
2
(8.6 g/l) để có gel Chitosan + Al(OH)
3
rửa với nước và sấy khô.
chuột được tiêm Staphylococus aureus. Những nghiên cứu giờ đây hướng vào các
olygomere của glucosamine và N- axetyl glucosamine mà nó cũng có tính chất của
polymer tương ứng nhưng nó có ưu điểm là tan trong nước và rất dễ hấp thụ.
- Đặc tính làm giảm cholesterol: Năm 1980, Sugano và cộng sự đã chứng minh
đặc tính làm giảm cholestorol của Chitosan trên chuột bạch và nó không gây tác dụng
phụ. Khoa Dược - Trường Đại Học Y Dược TP HCM đã nghiên cứu sử dụng Chitosan 12
và olygomereChitin để sản xuất một số chế phẩm hạ cholesterol trong máu, có thể dùng
riêng biệt hoặc kết hợp một số chất khác dưới dạng chế phẩm như thuốc, thực phẩm,
nước giải khát… Mức cholesterol giảm tới 20 – 30 % sau khi dùng 20 ngày, không gây
độc hại cho cơ thể, mức độ ảnh hưởng chỉ tác động khi vượt quá 18g/ngày/1kg thể
trọng.[4], [9]
• Trong sinh học
Chitosan được sử dụng khá rộng rãi làm vật liệu cố định enzyme và tế bào thông
qua cầu nối glutaraldehyt hoặc được nhốt trong gel. Tuy nhiên vật liệu Chitosan còn biểu
hiện nhiều nhược điểm về tính chất cơ lý, độ bền hóa học và hoạt tính enzyme còn thấp.
Để khắc phục nhược điểm này nhiều công trình nghiên cứu đã cho phép sử dụng xạ
styrene, metyl, metacaylat, acrylonitrit lên chitosan, tạo ra những vật liệu compolyme có
độ bền cơ lý và hóa học cao.
Khoa Sinh Học Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM và Phòng Công
Nghệ Bức Xạ - Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt đã nghiên cứu phép bức xạ
compolyme của HEMA (Hydroxyl Ethyl Methacrylat) với Chitosan để cố định enzyme
trypsin.
Phương pháp ghép compolymer được trình bày như sau: Dung dịch Chitosan
1.5% được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong dung dịch axit acetic 1%, monome HEMA
được khuếch tán đều trong dung dịch Chitosan, sau đó được chiếu xạ trong nguồn gama
Co 60 ở 30
o

Làm vải chịu nước không bắt lửa: Hòa tan Chitosan trong axit acetic loãng cùng
với axetat nhôm và axit stearic thu được hỗn hợp, hỗn hợp này được đem sơn lên vải, khi
khô tạo màng mỏng chắc bền, chịu nước và không bắt lửa, vải này được sử dụng để sản
xuất đồ bảo hộ lao động.
Xuất phát từ tính chất lý hóa của Chitosan, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo của trường
Đại học Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất vải colle bằng cách phối trộn dịch keo
Chitosan 6% với chất phụ gia tạo thành dịch hồ, sau đó đem dịch hồ này đi hồ vải, cán,
giặt sạch, làm khô được vải colle. Vải này được dùng trong may mặc, kết quả cho thấy
vải này có màu trắng, khi khô thì cứng, khi ướt thì mềm mại như vải, không gãy, tạo nếp
khi gấp, vải colle bền trong dung dịch xà phòng, nước javen, nước sôi, không bị thoái hóa
ở nhiệt độ cao.
Làm sợi Chitin: Vì Chitin thuộc loại polysaccharide, do đó có thể dùng nó để sản
xuất sợi Chitin theo phương pháp sản xuất sợi keo dính, đây là một loại sợi nhân tạo, nó
có thể dùng với sợi bông, sợi hóa học sản xuất từ nguyên liệu khác để tăng nguyên liệu
cho ngành dệt. Sợi Chitin được sản xuất bằng cách ngâm Chitosan trong dung dịch 14
Na
2
SO
4
bão hòa rồi đem kéo sợi. Đem sợi này trộn với sợi cellulose tỷ lệ 30:70 thu được
sợi Chitin – Cellulose. Khả năng bắt màu tăng khi tăng tỷ lệ sợi Chitin. [4], [9]
- Trong mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng để sản xuất kem giữ ẩm cho da, do tính
chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên lớp biểu bì của da nhờ các nhóm -NH
4
+
,
các nhóm này liên kết với tế bào sừng hóa của da. Nhờ vậy các nhà khoa học đã nghiên