BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH.
KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ
NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA
GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN
MÃ SỐ: CS 2000-15

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11 năm 2002


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH.
KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ
NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH

2. Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ ................................................................................ 9
3. Độc tính của các thuốc chữa ung thƣ ........................................................................... 10
IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ..................................................... 11
1. Đặc điểm của tế bào động vật ...................................................................................... 11
2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật ........................................................................... 12
PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP .............................................................................. 15
I. VẬT LIỆU ............................................................................................................................ 15
1. Gossypol ...................................................................................................................... 15
2. Plumbagin .................................................................................................................... 16
3. Các dòng tế bào ung thƣ .............................................................................................. 17
II. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................................. 18
1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào: ...................................................................................... 18
2. Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay): .................. 18
3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay): ................................................................................ 19
4. Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay): .............................................................. 20
5. Phƣơng pháp xử lý thống kê ........................................................................................ 20
PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ..................................................................................... 21
I. TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 ........................................... 21
II. TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 ...................................... 23
PHẦN V: KẾT LUẬN ............................................................................................................. 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 28


PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thƣ là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao trên thế giới
cũng nhƣ ở Việt Nam. Đây là dạng bệnh lý có liên quan đến hiện tƣợng rối loạn trong quá
trình điều hòa sự phân chia tế bào ở các mô trong cơ thể. Khối u hình thành do những tế bào
ung thƣ phân chia liên tục không đƣợc kiểm soát, ban đầu khối u định vị tại một mô nhƣng
sau đó tế bào ung thƣ có thể di căn khắp cơ thể, làm cơ thể suy kiệt và dẫn đến tử vong. Ung
thƣ hiện vẫn là vấn đề nan giải của Y học, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra hoạt chất hay phƣơng

Đa số ngƣời bị ung thƣ hình thành các khối u. Khác với khối u lành tính (chỉ phát
triển tại cho thƣờng rất chậm, có vỏ bọc chung quanh), các khối u ác tính (ung thƣ) xâm lấn
vào các tổ chức lành xung quanh giống nhƣ hình "con cua" với các càng cua bám vào các tổ
chức lành trong cơ thể hoặc giống nhƣ rễ cây lan trong đất. Các tế bào của khối u ác tính có
khả năng di căn tới các hạch bạch huyết hay các tạng ở xa hình thành các khối u mới và cuối
cùng dẫn đến tử vong.
Đa số ung thƣ có biểu hiện mãn tính, có quá trình phát sinh và phát triển lâu dài qua
nhiều giai đoạn. Trừ một số nhỏ ung thƣ ở trẻ em có lẽ do đột biến gen ở giai đoạn bào thai,
còn phần lớn ung thƣ đều có giai đoạn tiềm tàng lâu dài, có khi hàng chục năm không có dấu
hiệu gì trƣớc khi phát hiện thấy dƣới dạng các khối u. Khi các khối u phát triển nhanh mới có
triệu chứng ung thƣ. Triệu chứng đau chỉ xuất hiện khi ung thƣ ở vào giai đoạn cuối.

2. Sự khác nhau của mỗi loại ung thƣ:
Ngƣời ta biết đƣợc có đến 200 loại ung thƣ khác nhau trên cơ thể ngƣời. Những loại
ung thƣ này tuy có những điểm giống nhau về bản chất nhƣng chúng có nhiều điểm khác
nhau nhƣ sau:
2.1. Khác nhau về nguyên nhân
Qua các nghiên cứu dịch tễ học của R.Doll và Petro trên 80% tác nhân sinh ung thƣ là
bắt nguồn từ môi trƣờng sống, trong đó có 2 tác nhân lớn nhất là: 35% do chế độ ăn uống gây
nhiều loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa và khoảng 30% ung thƣ do thuốc lá (gây ung thƣ phổi, ung
thƣ đƣờng hô hấp trên . . .).
Các tác nhân khác gồm:
- Tia phóng xạ: có thể gây ung thƣ máu, ung thƣ tuyến giáp.
- Bức xạ tử ngoại: có thể gây ung thƣ da.

2


- Virus Epstein - Barr: gây ung thƣ vòm họng, u lympho ác tính.
- Virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) dẫn đến ung thƣ gan . . .

cơ thể cá biệt, có hệ thống miễn dịch tự điều chỉnh, tiêu diệt đƣợc các tế bào ung thƣ sau khi
đã phát sinh. Nhƣng trên căn bản nếu không điều trị thì chắc chắn bệnh nhân sẽ sớm dẫn đến
tử vong. Càng điều trị ung thƣ ở giai đoạn sớm, bệnh nhân càng có cơ may trị khỏi bệnh ung
thƣ. Ở những giai đoạn muộn hơn cũng cần điều trị để tạm thời ổn định hoặc kéo dài thời
gian sống hoặc giảm các triệu chứng của ung thƣ.
Mỗi loại ung thƣ, mỗi giai đoạn bệnh có phƣơng pháp điều trị khác nhau.
- Điều trị phẫu thuật: thƣờng áp dụng cho ung thƣ ở giai đoạn sớm chƣa có di căn.
- Điều trị tia xạ: thƣờng áp dụng cho những ung thƣ ở giai đoạn tƣơng đối muộn hơn.
Thƣờng phối hợp với phẫu thuật làm thu nhỏ bớt khối u để dễ mổ hoặc diệt những tế bào u tại
chỗ và hạch khu vực mà khi mổ nghi ngờ chƣa lấy hết hạch, hoặc áp dụng tia xạ cho ung thƣ
ở các vị trí không thể mổ đƣợc.
- Điều trị hóa chất: trƣớc đây áp dụng cho những loại ung thƣ có tính chất toàn thân
hay ở giai đoạn muộn, có di căn, nhƣng ngày nay số ung thƣ ở giai đoạn sớm (trên lâm sàng)
nhƣng tính chất ác tính cao, dễ di căn hoặc nghi có vi di căn (ung thƣ vú, tinh hoàn, buồng
trứng, ung thƣ rau . . . ) ngƣời ta cũng sử dụng hóa trị để phòng ngừa và nâng cao hiệu quả
điều trị.
- Điều trị miễn dịch: là 1 trong 2 phƣơng pháp điều trị toàn thân, còn đang đƣợc
nghiên cứu và có nhiều hy vọng. Có nhiều thử nghiệm đã áp dụng nhƣ điều trị kích thích
miễn dịch không đặc hiệu, điều trị bằng interferon, các lymphokin và gần đây là các nghiên
cứu dùng kháng thể đơn dòng đã điều trị một số bệnh ung thƣ có kết quả tốt.
2.4.Khác nhau về tiên lƣợng bệnh
Tiên lƣợng ung thƣ phụ thuộc rất nhiều yếu tố trên từng bệnh nhân. Những yếu tố
chính là:
- Giai đoạn ung thƣ: càng sớm tiên lƣợng càng tốt và ngƣợc lại.
- Loại ung thƣ: những ung thƣ ở bề mặt có tiên lƣợng tốt hơn (dễ phát hiện, dễ điều
trị) nhƣ ung thƣ da, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ vú, ung thƣ giáp trạng, ung thƣ khoang
miệng, ung thƣ đại trực tràng . . .

4


U ác tính

Tế bào biệt hóa cao

Ít biệt hóa

Hiếm có phân bào

Luôn có phân bào

Phát triển chậm

Phát triển nhanh

Không xâm lấn

Xâm lấn lan rộng

5


Không có hoại tử

Hay có hoại tử trung tâm

Có vỏ bọc

Không có vỏ hoặc ranh giới

Rất ít tái phát

2.1. Nguồn gốc tế bào ung thƣ
Có một số giả thuyết khác nhau nhằm giải thích các quan sát về quần thể tế bào ung
thƣ.
2.7.7. Thuyết đơn dòng tế bào

6


Là quan niệm kinh điển: khối u sinh ra từ 1 tế bào mẹ nhân lên.
Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy trên phụ nữ da đen thấy tế bào đồng nhất thƣơng tổn
nhiễm sắc thể 10. Các tế bào ung thƣ đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydrogenase.
2.7.2. Thuyết đa dòng tế bào
Khi quan sát về hình thái và chức năng ngƣời ta thấy:
- Tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên chẩn đoán hình thái học dễ nhầm
lẫn.
- Về chức năng: nhiều chất chỉ điểm sinh học.
2.1.3. Thuyết về kém ổn định gen của tế bào ung thƣ
Có thể ban đầu là một dòng, do gen tế bào ung thƣ không ổn định nên có các tế bào
biến dị tạo nên hàng loạt các tế bào hỗn hợp.
Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ. Các loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp,
ung thƣ liên kết hỗn hợp.
2.2. Các đặc tính tế bào ung thƣ
- Hình thái học: tăng kích thƣớc nhân, tăng tỷ lệ nhân so với bào tƣơng, không còn ức
chế tiếp xúc.
- Chức năng:
+ Hai đặc tính tại cho: xâm lấn lan rộng, tế bào thoát mạch di chuyển và đi căn do
hiện tƣợng phân bào mạnh.
+ Tế bào biệt hóa thấp, không làm đƣợc chức năng bình thƣờng, nếu bị thiếu dƣỡng
chất dễ bị hoại tử nhất là vùng trung tâm u.
+ Đôi khi tiết ra những hoạt chất lạ mà qua đó ta có thể gián tiếp thấy đƣợc sự hiện

Một số gen gây ung thƣ

Gen

Vị trí

Apc

5q

Mcc

5q

Raa

1p

Loại ung thƣ

Sai lạc

Hội chứng Gadner, ung thƣ trực tràng
Khuyết đoạn

Đa polip trực tràng
Ung thƣ đại tràng, hội chứng lynch
Ung thƣ đại tràng

P53


5q

Khuyết đoạn

p: Nhánh ngắn nhiễm sắc thể

U Wilm, carcinoma
Nhiều loại ung thƣ
q: Nhánh dài nhiễm sắc thể

+: Nối đoạn [1]

III. ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ
1. Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thƣ
Các thuốc chữa ung thƣ có tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá trình tổng
hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng nhƣ quá trình tổng hợp protein ở các tế bào ung thƣ
vào các thời kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào.
Ở các mô ung thƣ của ngƣời có khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ không phân chia
(G0). Sự phân chia của tế bào có thể phân thành 4 giai đoạn:
- Giai đoạn G1 là thời kỳ sau gián phân. Thời gian của giai đoạn này rất khác nhau tùy
theo loại tế bào. Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho tổng hợp DNA.
- Giai đoạn s là giai đoạn tổng hợp DNA.
- Giai đoạn G2 là giai đoạn tiền gián phân. Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp RNA và
các protein đặc hiệu của ung thƣ.
- Giai đoạn M là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào). Giai đoạn này lại chia
thành prophase, metaphase, anaphase và telophase.
Các thuốc chữa ung thƣ không ảnh hƣởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác động lên các
giai đoạn s, Gọ và M, thậm chí có thuốc chỉ tác động lên một kỳ nào đó của giai đoạn M mà
thôi.

- Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn mửa
- Rụng tóc
- Trên tủy xƣơng: làm yếu chức năng tủy, hạn chế tạo huyết cầu.
- Ảnh hƣởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến vô sinh.
- Làm chậm tăng trƣởng và phát triển ở trẻ em.
- Gây ung thƣ thứ phát do dùng thuốc.
- Gây tổn thƣơng mạch máu và đau khi truyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi điều trị
một thời gian.
- Rối loạn tính cách, hành vi.
- Sút cân, ngƣời yếu, không còn khả năng làm việc.
- Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm. Vì vậy ngƣời đã dùng thuốc
chữa ung thƣ thì không nên có con nữa. [2]

10


IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Đặc điểm của tế bào động vật
1.1. Tính cơ học yếu
Tế bào động vật không vách nhƣng kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 μm) nên
tính bền cơ học yếu. Do đó khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi
khuấy trộn để tách tế bào, thao tác v.v... Trong trƣờng hợp việc nuôi cấy tế bào động vật cần
khuấy hay quay thì tốc độ không đƣợc quá 100rpm (vòng/phút).
Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động; vật cũng cố gắng sao cho ngắn nhất,
thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ. Trong bảo quản, di chuyển các mẫu tế bào
cũng cố gắng thật nhẹ nhàng.
1.2. Tăng trƣởng và phân chia chậm
Thời gian tăng gấp đôi số lƣợng của tế bào động vật trong điều kiện sinh lý là 20-40
giờ. Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm.
Do đó cần có thời gian dài và khối lƣợng tế bào lớn khi chúng ta muốn sản xuất chất có hoạt

với môi trƣờng, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh,
hormon... để tăng trƣởng và phân chia.

2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi
trƣờng nuôi cây vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các công trình đầu tiên về nuôi cây tế
bào động vật ngƣời ta dùng hỗn hợp dung dịch muôi sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phôi
gà làm môi trƣờng nuôi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phôi gà rất rất phức
tạp, khó ổn định nên ngƣời ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo các môi trƣờng
tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần môi trƣờng và ổn định
môi trƣờng trong những lần nuôi cấy khác nhau.
Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập đƣợc thuần hóa với môi trƣờng tổng hợp
hoàn toàn, đa số các dòng tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tổng hợp có bổ sung 5 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh). Thông thƣờng huyết thanh
bê đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả, nhƣng có một số loại tế bào cần phải sử dụng huyết thanh
bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS).
Một vài loại môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động
vật:
- Môi trường EM (Basal Medium): đây là môi trƣờng cơ bản do H. Eagle thiết lập, khi
dùng phải bổ sung; 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lƣợng tùy
loại tế bào. Thƣờng sử dụng nuôi cây tế bào Hela, tế bào L.
- Môi trường E'MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi trƣờng tối
thiểu, do H.Eagle thiết lập. Đây là môi trƣờng BM có chứa nồng độ cao

12


hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.
- Môi trường D'MEM (Dulbecco - Modified Eagle Medium) là môi trƣờng E'MEM do
Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp
4 lần so với môi trƣờng khác để nuôi đƣợc nhiều loại tế bào hơn.

trƣờng khác nhau cũng nhƣ còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế
bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với dòng
tế bào nuôi cấy). Vì các lý do đó mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trƣờng nuôi cấy
tế bào động vật không dùng huyết thanh hay dùng với lƣợng thấp.
Có 2 phƣơng pháp điều chế môi trƣờng không có huyết thanh là phƣơng pháp của G.
Sato và phƣơng pháp của R.G. Ham. Cả 2 phƣơng pháp này đều thay huyết thanh bằng
những yếu tố khác nhƣ: kích thích tố, nhân tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, nhân tố kết
dính và kéo dài, các chất dinh dƣỡng, khoáng ... [3]

14


PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP
I. VẬT LIỆU
1. Gossypol
Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bông Gossypium
hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C. Hàm lƣợng gossypol trong hạt
bông biến đổi từ 0.1 - 6.64% tùy theo giống.
Trong kỹ nghệ cây bông, gossypol đƣợc xem nhƣ là phế phẩm có độc tính và thƣờng
đƣợc khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thƣờng dùng làm thức ăn gia súc.
Nhƣng hiện nay, sossypol có tầm quan trọng đặc biệt. Vào năm 1950, một bác sĩ
Trung Hoa đã phát hiện có sự gia tăng bất thƣờng các cặp vợ chồng không có con trong vùng
dùng nhiều dầu bông còn chứa gossypol.
Những thí nghiệm trên động vật và sau đó trên con ngƣời cho thấy gossypol có tính
diệt tinh trùng.
Về cấu trúc hóa học gossypol gồm 2 đơn vị naptalen đối xứng mang 3 nhóm chức
phenol và 1 chức aldehid. Công thức nguyên C30H30O8, trọng lƣợng phân tử là 518.54, có
nhiệt độ nóng chảy là 1820 C.

Tác dụng sinh học của gossypol:

Công thức phân tử :C11H8O3
Trọng lƣợng phân tử : 188,18

Tính chất hóa học của plumbagin:
- Không tan trong nƣớc.
- Tan tốt trong CHCl3, C6H6, AcOH, (CH3)2CO...

16


- Cho màu đỏ máu với FeCl3
- Kết tủa xanh lục với Cu(AcO)2 trong alcol.
Tác dụng sinh học của plumbagin:
- Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin đƣợc sử dụng để trị các bệnh đƣờng tiêu hóa,
phong ghẻ.
- Plumbagin có tác dụng diệt khuẩn, nấm.
Plumbagin đƣợc sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả.
- Plumbagin có tác dụng mạnh với nhiều loài vi khuẩn Gram (+) , vi khuẩn Gram (-),
nấm, vi khuẩn kháng acid. Ví dụ nhƣ: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercuosis,
Escherichia coli. [4]
- Một số tài liệu cho thấy plumbagin có hoạt tính kháng ung thƣ. [11,12]

3. Các dòng tế bào ung thƣ
3.1. Dòng tế bào RD (Rhabdomyosarcoma)
Ký hiệu: ATCC CCL 136 RD (từ Catalogue of American Type Culture Collection,
ATCC).
Dòng tế bào RD đƣợc thiết lập bởi R.M. McAllister từ khối u cơ ở vùng chậu của một
bé gái 7 tuổi ngƣời Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968. Các tế bào mọc thành những
lớp đơn trong môi trƣờng lỏng và tạo thành cụm tế bào (coloni) trên môi trƣờng E'MEM
Agar (Eagle'Minimum Essential Medium) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal


NaHCO3 7.5%

7.5 ml

HEPES 1M

10 ml

Amphotericin B 0.1%

125 μl

Penicillin

50.000 UI

Streptomycin

50 mg

Phenol đỏ 0.4%

1 ml

Huyết thanh
(Fetal bovine serum)

50 ml


Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm
Mật độ tế bào đối chứng

100%
[6]

3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay):
Phƣơng pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5
diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím bởi enzyme hô hấp ở ti
thể của tế bào. Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật
độ quang OD570 của dung dịch.
Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách
rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng; mỗi giếng
gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào).
Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi
trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở
nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào
HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO.
Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.
Sau thời gian ủ, môi trƣờng xử lý đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa 0.5 mg/ml MTT.
Sau 4 giờ ở 37.50 C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl
(0.04M). Đo OD570 của các lô thí nghiêm và đối chứng. Khả năng ức chế sự phát triển các
dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: [7,8,9,10]
Tỷ lệ ức chế (%) =

OD570đối chứng - OD570thí nghiệm
OD570đối chứng

100%


Bảng 1: Tác động của gossypol lên dòng tế bào RD

Nồng độ
(μg/ml)

Tỷ lệ ức chế phân bào (%)
Trypan blue

MTT
C

Clonogenic
C

0.1
1
5

18.72 ± 12.18
28.68 ± 23.76 C
72.89 ± 11.98 B

4.56 ±10.52
3.52 ±5.06 C
71.47 ± 16.86 B

21.98 ± 23.1 B
24.78 ±23.67B
95.72 ± 1.93 A


MTT và clonogenic.
Ở nồng độ 10-5μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua
tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ không có
colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả

21


các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2
thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp hơn 100% (khoảng
70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 5-10
μg/ml.
Ở nồng độ thấp hơn 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol cũng làm giảm số tế bào RD có
khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic
Bảng 2: Tác động của gossypol lên hai dòng tế bào HEp2 là khoảng trên 20%.

Nồng độ
(μg/ml)

Tỷ lệ ức chế phân bào (%)
Trypan blue
D

MTT
0.00 ±4.88

Clonogenic
C

10.85 ± 16.48 B

10.06

18.73

Tỷ lệ ức chế(%)

Biểu đồ 2: Tác động của gosypol lên HEp2

Nồng độ gossypol (ug/ml)

22