BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
---------

BÙI THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE TÁI
TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA
ENZYME

LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2014
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
---------

BÙI THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GELATINASE
TÁI TỔ HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH
CỦA ENZYME
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60. 42. 01. 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ: KHOA HỌC SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A
AMP

: Aeromonas
: Ampicillin

bp

: Bazơ pair

BSA

: Bovine Serum Albumin

BLAST

: Basis Local Aligment Search Tool

EDTA

: Ethyllene diamine tetra acetic acid

EtBr

: Ethidium Bromide

LB


TAE

: Tris - acetate - EDTA

UV

: Ultra violet

4


MỤC LỤC

PHẦN I. MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI.......................................................................................1
2. MỤC TIÊU ..........................................................................................................2
2.1. Mục tiêu chung..................................................................................................................................2
2.2. Mục tiêu cụ thể..................................................................................................................................2

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................2
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU....................................................2
4.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................................................3

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI................................................................................3
PHẦN II. NỘI DUNG.......................................................................................................................... 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................ 3
1. Tổng quan về gelatin và gelatinase.....................................................................................................3
2. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase.......................................................................7

2.12. Phương pháp thu enzyme gelatinase...........................................................................................33
2.13. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô ...............................33
2.14. Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase..........................................................................33
2.15. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn...................................................................................................34
2.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinh khối và
hoạt tính enzyme gelatinase...................................................................................................................35
2.17. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase................35
2.18. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase......................36
2.19. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase..............36
2.20. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu.........................................................................................36
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................................36

1. Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21..................36
1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A.................................................................................36
1.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ...................................................................40
1.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp.............................................................42

2. Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase...................44
2.1. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa gelatinase.................44
2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp gelatinase của
chủng vi khuẩn tái tổ hợp.......................................................................................................................47
2.3. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ.......................................................................................................51
2.4. Ảnh hưởng của yếu tố pH...............................................................................................................53
2.5. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian nuôi cấy.......................................................................................55
2.6. Ảnh hưởng các ion kim loại............................................................................................................57

3. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp ......................................................58
3.1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột...............................................................................58
3.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp..........................................................................60
3.3. Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp......................................................................63

gelatinase ......................................................................................................................
............ 66
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme
gelatinase.................................................................................................................. 67

DANH MỤC CÁC HÌNH
7


Hình 1. Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin ...........................................................4
Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A ..................................................................................6
Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B ..................................................................................6
Hình 3. Hình thái A. hydrophila……………………………………………………………8
Hình 4. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila…………………………………………………...9
Hình 5. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa............................................10
Hình 6. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas……………...…………………………….11
Hình 7. Sơ đồ pET32a+ dùng trong biểu hiện gen ...................................................19
Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng giữa GelE phân lập và GeneBank ...............38
Hình 1.2. Hình ảnh điện di gen GelE và vector pET32 a(+) cắt bằng các enzyme
giới hạn Bam HI và Xho I .......................................................................................39
Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa
gelatinase.................................................................................................................. 40
Hình 1.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BamHI và
XhoI ..........................................................................................................................41
Hình 1.5. Kết quả biến nạp vector pET32a/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3) và
nuôi trên môi trường LBAmp .....................................................................................42
Hình 1.6. Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE ..........43
Hình 1.7. Điện di protein gelatinase tinh sạch trên SDS-PAGE .............................44
Hình 1.8. Hình ảnh phân giải gelatinase của enzyme thu được từ chủng E.coli
BL21/pET 32-GelE .................................................................................................45

Hình 3.1. Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin ở 370C …………………60
Hình 3.2. Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí......................... 61
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase ............................ 62
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase …… 63
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase .................................... 64

9


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào
nhiều ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất
thành sản phẩm nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản
ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản
ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn đối với con người và thiên nhiên.
Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất
enzyme tái tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông
nghiệp. Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có
chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn
chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ
hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen”. Đề tài nghiên cứu công nghệ
sản xuất enzyme protease và lipase từ chủng vi sinh vật tái tổ hợp để ứng dụng
trong công nghệ thuộc da và sản xuất chất tẩy rửa. Đề tài “Nghiên cứu sản xuất
enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng
dụng sản xuất nước chấm”.
Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác
dụng có thể thủy phân được gelatin. Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn
gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không
vị, trong suốt hoặc có màu hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong

1. Nghiên cứu tạo chủng biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3. Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp.
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
4.1. Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp.
4.2. Nguyên liệu nghiên cứu: Gen mã hóa gelatinase nhóm A (kích thước 501bp)
được tách dòng từ 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.4.1; và A.hydrophila C4.1.1.

2


4.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng
9/2014.
-

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Sinh học
Viện Đại Học Mở Hà Nội.

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI
- Hệ thống hóa được các kỹ thuật trong công nghệ tạo enzyme tái tổ hợp nói
chung và trong công nghệ tạo gelatinase tái tổ hợp nói riêng.
- Đưa ra các điều kiện để chế tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong xử lý
phụ phẩm chế biến cá da trơn.

PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan về gelatin và gelatinase
1.1. Gelatin

Loại acid amin
Alanine

Tỉ lệ (% )
8.6 - 10.7

4


2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Arginine
Aspartic acid

16.2 - 18.0
2.9 - 4.13
2.2
0.44 - 0.91
2.5 - 2.8 2,519

1.2. Gelatinase
Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn
và động vật bậc cao. Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase,
xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và
peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, peptone. Hoạt tính của enzyme
không chỉ phụ thuộc vào hoạt lực của nó mà còn phụ thuộc nhiều vào các tác nhân
môi trường mà nó xúc tác. Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúc ngoại
bào như elastin, collagen và gelatin.
Ở cơ thể con người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A
và gelatinase B (hình 2a, 2b). Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là
collagenase 72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, được mã hóa bởi gen GelE có kích
thước là 501bp. Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92
kDa typ IV thuộc nhóm MMP-9, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là
615bp. Enzyme này chủ yếu được sinh ra bởi các tế bào đại thực bào, tiểu cầu, bạch
cầu đa nhân, bạch cầu trung tính, xơ phôi và tế bào sừng. Chức năng chính của
gelatinase là phối hợp với các MMPs khác để chỉnh sửa các mô sinh dưỡng, hỗ trợ

5


sự phát triển của phôi thai, hình thành mạch máu, tham gia quá trình rụng trứng,
chữa lành vết thương, tham gia hình thành xương.
Trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư, gelatinase 92
kDa được sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của enzyme, còn trong chẩn


6


Pseudomonas fluorescens

+

Serratia plymuthica
Serratia liquefaciens
Serratia rubidaea
Peudomonas anguilliseptica

+
+
+
+

2. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
2.1. Vi khuẩn Aeromonas hyrophila
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Aeromonadales
Họ: Aeromonadacea
Giống: Aeromonas
Loài: A.hyrophila
A.hydrophila là một loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn. Kích
thước chiều rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm. Chúng không
có khả năng hình thành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC).
A. hydrophila có khả năng di động nhờ vào tiên mao ở một đầu của vi khuẩn.


8


2.2. Vi khuẩn Pseudomonas
Phân loại khoa học
Giới (Domain): Bacteria
Ngành (phylum): proteobacteria
Lớp (class): Gramma proteobacteria
Bộ (ordo) : Pseudomonadales
Họ (familia): Pseudomonadaceae
Chi (genus): Pseudomonas
Migula(1894)
Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans ,
Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn
Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên
mao) và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh
hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Chúng thường sinh ra
sắc tố, các sắc tố này thường biểu thị cho độc tính của loại vi khuẩn này, chúng gây
tổn thương hoặc làm mất hoạt tính sinh lý bình thường của các tế bào biểu mô trong
đường hô hấp.

Hình 5. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở nhiều nơi trong môi trường. Khả năng
biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều
môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây, trên và trong các động vật. Trong số

9

bằng Sông Cửu Long có 3.749 héc ta nuôi cá tra, trong đó Đồng Tháp, An Giang
với 2.340 héc ta. Do có ưu điểm như dễ nuôi, lớn nhanh, thịt ngon nên tiềm năng
nuôi cá tra vẫn còn khá lớn. Việc phát triển nuôi cá tra sẽ làm tăng sản lượng cá
nuôi nước ngọt trong cả nước, tăng thêm lượng thủy sản xuất khẩu và góp phần
phát triển ổn định nghề nuôi.
Tuy nhiên, so với năm 2009, trong những tháng qua, giá cá tra trên thị
trường quốc tế giảm từ 2,28 đô la Mỹ xuống còn 2,13 đôla Mỹ/kg, đã gây khó khăn
không ít cho các doanh nghiệp xuất khẩu. Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan
tâm hơn tới việc tăng doanh thu từ các nguồn khác như các mặt hàng chế biến sẵn,
các mặt hàng giá trị gia tăng, tận dụng phế phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sử
dụng cho phế phẩm. Mặt khác, nếu không tận thu lượng phụ phẩm sau chế biến này
sẽ gây thất thoát lãng phí lớn trong sản xuất và ô nhiễm môi trường. Trong khi đó,
chúng ta lại hoàn toàn có thể tận dụng các phụ phẩm này thành các sản phẩm thủy
phân có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và sản
xuất nông nghiệp… đáp ứng được một lượng lớn nhu cầu ngày càng tăng cao về các
sản phẩm chống lão hóa, các sản phẩm làm đẹp, dược phẩm, thực phẩm chức năng,
thức ăn nuôi trồng thủy sản hay các sản phẩm sử dụng trong nông nghiệp.
Thành phần chủ yếu của phụ phẩm là các phần thừa, khó chế biến xử lý. Da
chứa 85% collagen, một loại protein có 19 acid amin, trong đó có 8 acid amin
không thay thế, và có thể coi đây là một nguồn protein khá hoàn chỉnh, trong đó
axit amin glycine, hydroxyproline và proline chiếm tới 50% tổng lượng acid amin
trong collagen. Để xử lý nguồn phụ phẩm da cá tra thành acid amin, enzyme
gelatinase được coi là giải pháp đem lại hiệu suất cao, tạo ra sản phẩm an toàn và ít
gây ô nhiễm môi trường.
Như trên đã nói, hàng năm tại các nhà máy chế biến lượng da cá thải ra rất
lớn. Từ thực trạng và bài toán kinh tế đó, Công ty Cổ phần Vĩnh Hoàn, Đồng Tháp
là công ty đầu tiên trong nước xây dựng nhà máy sản xuất collagen từ da cá tra/ cá
ba sa với công xuất 1000 tấn/ năm. Theo dự báo kết quả kinh doanh nhà máy sản

11

Da cá

Da cá

tuyếta

Alaska

Hakea

Megrima

Cá rô
phic

12

Bì lợnd


Alanine
Glycine
Hydroxyproline
Proline

96
344
50
106


phân của các acid amin, đây là nguyên nhân làm mất hoạt tính của acid amin. Vì
vậy, công nghệ enzyme được lựa chọn như giải pháp tối ưu (Waldner và cộng sự,
1997).
5. Biến nạp
Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN. Thông tin của
tế bào vi khuẩn nằm trên một phân tử ADN mạch kép vòng tròn đơn được gọi là
genophore, hay "nhiễm sắc thể". Gần đây đã phát hiện thấy rằng ít nhất ở một số
vi khuẩn có ADN tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi
nhiễm sắc như histon ở NST Eukaryote. Ngoài ra ở một số vi khuẩn còn có thêm
plasmid là phân tử ADN vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập.
Biến nạp được nghiên cứu kỹ nhất ở các chủng vi khuẩn Streptococcus
pneumonice, Baccilus subtilis, Haemophilus influenzae và một số nhóm vi khuẩn
khác.
6. Vector biểu hiện
6.1. Vector biểu hiện
Vector biểu hiện gen là những vector được thiết kế dùng để biểu hiện một tính
trạng hay tạo ra một loại protein. Vector biểu hiện mang tất cả các đặc điểm của
vector tách dòng như:
-

Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin) để có khả năng tự sao chép trong tế

bào chủ.
- Phải có trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.

13


- Có gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu…) cho phép
dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận.


rãi nhất hiện nay thông qua quá trình sử dụng các plasmid đặc thù cho các loại sản
phẩm (protein ngoại lai) mà ta cần quan tâm.
Vi khuẩn E.coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực biểu hiện gen do có
nhiều ưu điểm:
-

Dễ nuôi, không đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, thiết bị, dụng cụ đơn
giản, rẻ tiền góp phần hạ giá thành sản phẩm.

-

Trong ứng dụng là dòng E.coli đã được xử lý nên dễ dàng tiếp nhận plasmid
tái tổ hợp cũng như quá trình nhân lên và biểu hiện của đoạn gen đó. E.coli
dễ dàng biểu hiện rất nhiều gen có nguồn gốc cả Prokaryota và Eukaryota.

-

E.coli chứa một số promotor mạnh, có khả năng biểu hiện mạnh.

-

E.coli có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái
tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩm
protein tái tổ hợp. Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50mg/l – 500mg/l.

-

Cấu trúc bộ gen của E.coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu khá
đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu và sản xuất khi sử

Chuyển plasmid TTH vào E. coli BL21

Tinh sạch protein TTH

16

Điện di SDS-PAGE

PCR kiểm tra