BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LINH ANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LINH ANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .............................................................3
1.1.1. Tổng quan về Clarithromycin và Azithromycin ........................................3
1.1.2. Tổng quan về Sulfamethoxazol và Trimethoprim .....................................5
1.1.3. Một số nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Clarithromycin,
Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước thải .....................7
1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu .................................11
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................11
1.2.2. Phương pháp chiết pha rắn .......................................................................15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................18
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ........................................................18
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ...............................................................................18
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị ...........................................................................18
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................19
2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu sơ bộ ...................................................................19
2.2.2. Xử lý mẫu .................................................................................................19
2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS ...........................20
2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ............................................20
2.2.5. Lấy mẫu, phân tích một số kháng sinh trong thực tế ...............................21
2.3. Phương pháp xử lý số liệu ...........................................................................21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................22
3.1. Xây dựng phương pháp phân tích ..............................................................22
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ ...........................................22


: Thuốc thử phân tích (Analytical reagent)

CLA

: Clarithromycin

HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
IS

: Chuẩn nội (Internal Standard)

LC – MS
: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – mass
spectrometry)
LOD

: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

m/z

: khối lượng/ điện tích

MeOH


TMP

: Trimethoprim


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm Macrolid ............................... 3
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu
trong nước thải trên thế giới ............................................................................. 7
Bảng 2.3. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ...................................18
Bảng 3.4. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa ....................................24
Bảng 3.5. Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên
cứu............................... ....................................................................................24
Bảng 3.6. Điều kiện khảo sát pha động ..........................................................27
Bảng 3.7. Hiệu suất chiết các kháng sinh khi rửa giải với các thể tích khác
nhau (n=2) .......................................................................................................34
Bảng 3.8. Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích mẫu chiết 100ml và
200ml ...............................................................................................................35
Bảng 3.9. Quy trình phân tích các kháng sinh nghiên cứu .............................36
Bảng 3.10. Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS ..............38
Bảng 3.11. LOD và LOQ của các kháng sinh (Tính trên mẫu ban đầu) ........41
Bảng 3.12. Kết quả xây dựng đường chuẩn các kháng sinh nghiên cứu ........42
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng và độ lặp lại của phương pháp ............44
Bảng 3.14. Kết quả nồng độ kháng sinh trong các mẫu thử (nồng độ
ng/ml).................................. ............................................................................46


DANH MỤC CÁC HÌNH


trạng kháng kháng sinh. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các
kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ
biến [16,17].
Hầu hết các kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra môi trường
dưới nhiều hình thức khác nhau như bài tiết, tồn dư kháng sinh trong các dụng
cụ, bông, băng y tế… điều này đã góp phần vào sự tồn dư trong nước thải.
Trong đó hiện nay, các kháng sinh như Clarithromycin, Azithromycin,
Trimethoprim, Sulfamethoxazol cũng đang được sản xuất và sử dụng rộng rãi.
Theo thống kê từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 của Cục Quản lý Dược,
Clarithromycin có 95 số đăng ký, Azithromycin có 53 số đăng ký,
Sulfamethoxazol và Trimethoprim có 79 số đăng ký trong nước, chiếm tỷ lệ
tương đối so với kháng sinh các nhóm khác. Các nhà máy sản xuất các kháng
sinh này đều đạt tiêu chuẩn GMP và có quy trình, hệ thống xử lý nước thải
sau sản xuất. Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh trong nước thải
ở các cơ sở này vẫn chưa được quan tâm đúng mức và chưa có yêu cầu của cơ

1


quan nhà nước về giới hạn nồng độ của các kháng sinh trong nước thải của
các nhà máy sản xuất. Bên cạnh đó, các kháng sinh này khá bền, khó phân
hủy nên sự tồn dư, có mặt lâu dài trong môi trường nước sẽ ảnh hưởng đện hệ
vi sinh vật gây ra tình trạng kháng kháng sinh. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt
Nam chủ yếu các nghiên cứu dư lượng kháng sinh Clarithromycin,
Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim đều trong trong nước sông,
nước thải chăn nuôi, còn với nước thải y tế thì mới có một số nghiên cứu
bước đầu. Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải nhà máy dược
phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, với mục tiêu là:
1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng các kháng sinh

tử carbon trên vòng, Macrolid được chia làm nhóm vòng lacton 14C, 15C,
16C.
Bảng 1.1. Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm Macrolid

Vòng lacton 14C
(erythromycin, roxithromycin,
clarithromycin)

Vòng lacton 15C
(azithromycin)

3

Vòng lacton 16C
(midecamycin, spiramycin,
josamycin)


Ngoài ra, ngườii ta còn phân loại
lo Macrolid
acrolid thành các nhóm th
thế hệ I, II,
III,, trong đó Clarithromycin và Azithromycin được
đư xếpp vào nhóm th
thế hệ II.
[19].
 Clarithromycin (CLA)
- CTCT: C38H69NO13
- KLPT: 747,953


ruột và chỉ có tác dụng yếuu trên m
một số chủng vi

4


khuẩn
n Gram âm khác như H. influenzae và N. meningitidis
meningitidis, tuy nhiên lại có
tác dụng khá tốtt trên các chủng
ch
N. gonorrhoeae. Kháng sinh nhó
nhóm macrolid
tác dụng tốtt trên các vi khuẩn
khu
nội bào như Campylobacter jejuni, M.
pneumoniae, Legionella pneumophila, C. trachomatis, Mycobacteria (bao
gồm M. scrofulaceum, M. kansasii, M. avium-intracellulare
avium intracellulare – nhưng không
tác dụng trên M. fortuitum).
fortuitum Một số chủng liên cầu huyếtt tán beta nhóm A và
tụ cầu kháng lạii macrolid. [5].
1.1.1.4. Cơ chế tác dụng
d
Clarithromycin và Azithromycin có cùng cơ chế
ch tác ddụng của nhóm
Macrolid: có tác dụng
ng kìm khuẩn
khu do ức chế tổng hợpp protein ccủa tế bào vi
khuẩn do gắn với tiểu


5


coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus indol,
Klebsiella, Haemophilus influenzae…[5]
influenzae…
- Cơ chế tác dụ
ụng: SMX có cấu trúc tương tự acid para aminobenzoic
(PABA). Nó cạnh
nh tranh với
v PABA nhờ có ái lựcc cao vvới dihydropteroat
synthease (ức chế giai đoạn
đ
I của quá trình tổng hợpp acid folic ccủa vi khuẩn)
[5].
1.1.2.2. Trimethoprim (TMP)
Trimethoprim là kháng sinh tổng
t
hợp dẫn xuấtt pyrimidin.
- CTCT: C14H18N4O3
- KLPT: 290,32

- Tính chất vậtt lý: ít tan trong cloroform, ethanol ho
hoặc aceton, tan nhẹ,
gần như không hòa
òa tan trong nước,
n c, tan trong acid acetic băng [4,7].
- Phổ tác dụng:
ng: TMP chống lại tác nhân gây nhiễm

- CTCT: C14H18N4O3
- KLPT: 293,32

1.1.3. Một số nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Clarithromycin,
Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước thải
1.1.3.1. Trên thế giới
Hiện nay trên thế giới, những nghiên cứu về các kháng sinh nói chung
và kháng sinh nhóm macrolid, cotrimoxazol nói riêng rất phong phú với nhiều
nền mẫu khác nhau từ các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh
viện, công ty dược. Một số nghiên cứu của các tác giả nước ngoài phân tích
các kháng sinh CLA, AZI, TMP và SMX trong nước thải được tổng hợp ở
bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu
trong nước thải trên thế giới

Tài Hoạt
liệu chất

20

Điều kiện sắc ký

LOD
(ng/l)

Độ
thu
hồi
(%)



7


24

Chiết SPE cột
ENVI-18 500mg,
SMX
rửa giải bằng 5ml
TMP
methanol
chứa
acid formic 0,1M

26

Chiết SPE cột
C2/ENV+ 1g hoặc
SMX ENV+ 200mg, rửa
TMP giải bằng 5ml
methanol chứa 5%
triethylamin

18

AZI

Chiết lỏng lỏng
bằng methyl tertbutyl ether

mm; 5µm
- Pha động: nước chứa acid
formic 0,1%: acetonitril chứa
acid formic 0,1% (gradient
nồng độ)
- Detector: ESI - MS
- IS: sulfamethazin
- Cột:C18; 30mm x 2,0 mm;
5µm
- Pha động: acetonitril:
methanol: tetrahydrofuran:
amoni hydroxyd 0,04M
(50:24:2:24)
- Detector: ESI - MS
- IS: erythromycin
- Cột:C18; 125 mm x 2,0
mm; 5µm
- Pha động: hỗn hợp đệm
amoni acetat 10mM pH 6 và
acetonitril
(90:10)
:
acetonitril (gradient nồng độ)
- Detector: ESI - MS
- Cột : C18; 250 mm x 2,1
mm; 5µm
- Pha động: hỗn hợp 10%
acetonitril và 90% amoni
acetat 10mM (pH 6):
acetonitril (gradient nồng độ)


23

CLA
AZI
SMX
TMP

15

CLA
AZI
SMX
TMP

27

CLA
AZI
SMX
TMP

Chiết SPE cột
polymeric
RP
200mg, rửa giải
bằng 2×2,5mL
acetonitril:
methanol 1:1 và
2×2,5

12
22
7

- Cột:C18; 150 mm x 2,0
mm; 3µm
- Pha động: nước chứa acid
0,606
formic 0,1%: methanol chứa
0,303
acid formin 0,1% (gradient
3,667
nồng độ)
1,21
- Detector: ESI - MS
- IS: tylosin, josamycin,
sulfamerazin
- Cột:C18; 50 ×2.1 mm, 1,8
Chiết SPE cột µm
Oasis HLB 500 - Pha động: (1:10 (gradient 1,43
mg, rửa giải bằng nồng độ)
– 22
2x3ml methanol
- Detector: ESI - MS
- IS: josamycin

100
92
68
104

Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu ở hai khu vực sông Hồng miền Bắc và khu
vực sông Mê Kông miền Nam nhưng chỉ lấy mẫu và chiết mẫu ở Việt Nam,
sau đó phân tích LC – MS/MS ở Nhật [25,29].
Các nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải y tế ở
Việt Nam chủ yếu được thực hiện trong những năm gần đây và với đối tượng
là các kháng sinh nhóm quinolon, cephalosporin, macrolid, sulfamethoxazol,
metronidazol [3,6,13,14]. Trong đó, có nghiên cứu của Dương Hồng Anh và
cộng sự tiến hành định lượng Quinolon trong nước thải bệnh viện sử dụng kỹ
thuật chiết pha rắn dùng cột silicagel tự tạo, phân tích các chất bằng HPLC
với detector huỳnh quang [3]. Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế xây dựng
phương pháp xác định dư lượng kháng sinh cefixim trong nước thải nhà máy
dược áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng bằng cloroform, phân tích bằng
HPLC detector DAD [9]. Còn lại đa phần các nghiên cứu đều lựa chọn
phương pháp chiết pha rắn và phân tích bằng LC-MS để tiến hành định lượng.
Đối tượng là sulfamethoxazol có nghiên cứu nhóm tác giả Đại học
Dược Hà Nội (2013) thực hiện trên mẫu nước thải bệnh viện, nhưng mới chỉ ở
giai đoạn bước đầu, đồng thời cũng chưa có quy trình định lượng và áp dụng

10


trên mẫu nước thải công nghiệp dược. Tương tự, nghiên cứu xác định dư
lượng nhóm macrolid trong nước thải công nghiệp dược (2015) cũng mới
thực hiện phân tích đồng thời 2 hoạt chất Clarithromycin và Azithromycin,
bước đầu đưa ra điều kiện phân tích và chưa áp dụng thử trên các mẫu nước
thải thực tế [8].
Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển phương pháp phân
tích các kháng sinh clarithromycin, azithromycin, sulfamethoxazol và
trimethoprim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược phẩm để áp dụng quy
trình định lượng vào mẫu nước thải thực tế. Hy vọng đề tài sẽ góp phần vào

Tứ cực thứ
nhất

Buồng va
chạm

Tứ cực thứ
hai

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên
cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất
đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một
điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z)
có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động trong điện trường hay từ trường của
ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng
của ion đó.
 Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)
- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị
khối phổ. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của
cột sắc ký.
- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion
phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành
các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao.
Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta
tính được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích).

12



vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion
mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon. Kỹ thuật phân tích
khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng
để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành
phần .
- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến,
khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô
và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính
toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi
phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :
+ Quét toàn phổ (SCAN)
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để
cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.
Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ
lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa
chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo
thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền
nhất
+ Selected Ion Monitoring (SIM)

14


Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc
trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã
được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với
các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường
được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

vào pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào các ống nhỏ.
Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ
lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác
phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể
tích dung dịch mẫu. Vì thế chiết pha rắn ngoài tác dụng làm sạch có thể thực
hiện thêm bước làm giàu mẫu. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương tự
như trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên
kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết. Tùy theo đặc tính của pha rắn mà
có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha
đảo hay trao đổi ion.
Có 2 cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu nhờ chiết pha rắn:
+ Các chất tạp được rửa giải khỏi cột, chỉ có chất phân tích được lưu giữ lại
sao cho lượng tạp chất trong chất phân tích được giảm thiểu tối đa, chất phân
tích sau đó được rửa giải bằng một dung môi rửa giải mạnh, bay hơi tới cắn
hoặc trực tiếp đem đi phân tích.
+ Tạp chất được giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha lỏng được thu
hồi.
Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:
- Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha
rắn có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào lượng chất phân tích
trong mẫu mà lựa chọn cột có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác
nhau. Lượng pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền
từ 125 µL đến 20 mL.

16


- Qui trình chiết (SPE cột pha đảo): gồm 4 giai đoạn
1. Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt
hóa các nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào