BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN VĂN THUẬN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT
SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC/MS-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THUẬN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT
SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC/MS-MS


Học Viên
Nguyễn Văn Thuận LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3
1.1.2. Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin
nghiên cứu 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
1.2.1. Các phương pháp chiết tách 6
1.2.2. Tổng quan về phương pháp săc ký lỏng- khối phổ 11
1.2.2.1. Thiết bị khối phổ 11
1.2.2.2. Một số kỹ thuật ghi phổ 14
1.2.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng- khố
i phổ 15
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ
TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 15
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn 20
2.1.2.

4.3.2. Nghiên cứu dư lượng kháng sinh trong môi trường tại Việt Nam 58
KẾT LUẬN 60
KIẾN NGHỊ 61
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril
BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia)
IS Internal standard (chuẩn nội)
C18 Octadecyl carbon chain
DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector)
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography)
LC-
MS/MS
Sắc kí lỏng khối phổ 2 lần (High perform liquid chromatography
–
Tandem
Mass Spectrometry)
t
R
Thời gian lưu
S
píc
Diện tích pic
S
IS
Diện tích pic của chuẩn nội
TB Trung bình
MeOH Methanol
mg Milligram
ml Mililit

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin 3
Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ 1 2
Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chương trình pha dộng 29
Hình 3.2. Kết quả khảo sát cột sắc ký 32
Hình 3.3: Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 34
Hình 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động 36
Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết của 2 qui trình chiết pha rắn 38
Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 45
Hình 3.7. Sắc ký đồ m
ẫu LOD 50
Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử thứ nhất 52
Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử thứ hai 53 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc sử dụng kháng sinh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát đang trở thành vấn đề
thời sự của ngành y tế, trong đó việc gia tăng tình trạng kháng kháng sinh đang
là hậu quả nghiêm trọng. Bên cạnh nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không
hợp lý thì một lý do khác đang được quan tâm là sự tồn tại dư lượng kháng sinh

ược
phẩm bằng phương pháp LC/MS-MS” với các mục tiêu như sau:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích và qui trình xử lý mẫu để xác
định đồng thời dư lượng các kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim trong
nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng kỹ thuật LC/MS-MS ở nồng độ ppb.
2. Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và
bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá d
ư lượng kháng sinh trong nước
thải của nhà máy sản xuất dược phẩm.

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
* Công thức chung của cephalosporin

S
N
NH
R
1
O
R
2
H
O
OOH
H
H
R

I
Cephalexin
Cephalothin
Cephazolin
…
- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn
Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu
kháng methicillin).
Thế hệ
II
Cefaclor
Cefuroxim
Cefotetan…
- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác
dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng
trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn.
Thế hệ
III
Cefixim
Cefoperazon
Cefotaxim
Cefdinir…
- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β-
lactamase, tác dụng trên cả P. aeruginosa.
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1.
Thế hệ
IV
Cefepim… - Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3.
Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn
Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas,

S
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Ít tan trong nước, tan trong
aceton, ethyl acetat và methanol,
ít tan trong ethanol.
- Độ tan trong nước: 0,284 g/l.
- pK
a1
= 3,15; pK
a2
= 1,1

2.Cephalexin
I

C
16
H
17
N
3
O
4
S

C
16
H
15
N
5
O
7
S
2 -Bột trắng hoặc gần như trắng. Ít
tan trong nước, aceton, glycerin,
tan trong methanol, propylen
glycol, hơi tan trong ethanol, thực
tế không tan trong ether, ethyl
acetat và hexan, hầu như không
tan trong dung dịch sorbitol 70%
-Độ tan trong nước: 0,104 g/l.
-Hằng số pK
a1
= 3,45; pK
a2

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.2.1. Các phương pháp chiết tách
a. Chiết lỏng- lỏng
Chiết lỏng- lỏng là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung
môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất. Các
dạng chiết xuất bao gồm:
+ Chiết các chất dạng acid, base hoặc chất lưỡng tính.
+ Chiết các chất dạng nội phức.
+ Chiết cặp ion.
Chiết lỏng- lỏng là kỹ thuật đơn giản, dễ
thực hiện và được sử dụng phổ biến
nhất trong các phương pháp xử lý mẫu huyết tương và mẫu có nền mẫu tương
đối phức tạp. Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm: dùng nhiều dung môi, khó
khăn kết nối với các thiết bị như GC hay HPLC, có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch
kết quả.
b. Chiết pha rắn
Chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE) là một phương pháp chiết d
ựa vào
sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được

7
chiết từ pha lỏng vào pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào
các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ
được giữ lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung
môi khác phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so
với thể tích dịch ban đầu. Vì thế qua chiết pha rắn, ngoài tác dụ
ng làm sạch có
thể thực hiện thêm bước làm giàu mẫu. Ngoài ra, người ta có thể sử dụng luồng
khí nóng để rửa giải các chất từ pha rắn, đây là cách thuận tiện để chuyển các
chất vào phân tích trên sắc ký khí [6], [10], [29].

2
).
Silica là một polymer vô cơ có cấu trúc chung là (SiO
2
)
x
, có thể được tạo
thành nhờ quá trình polymer hóa acid silicic. Bề mặt silica có chứa các nhóm
hydroxyl (-OH) và thường được gọi là nhóm silanol (SiOH).
Tùy theo đặc tính của pha liên kết mà có thể chia thành một số loại cột có
bản chất khác nhau, có thể kể ra bao gồm pha đảo, pha thuận và trao đổi ion.
- Pha đảo: Nền silica gắn thêm các nhóm không phân cực như C8, C18…
- Pha thuận: Nền silica gắn thêm các nhóm phân cực như –NH
2
, -CN,
diol…
- Trao đổi ion: Nền silica gắn thêm các nhóm trao đổi cation (dẫn chất
phenylsulfonic) hoặc anoin (dẫn chất amoni bậc 4).
* Florisil (Magnesi silicat)

9
Magnesi silicat (MgSiO
3
) là các loại hạt có đường kính từ 25-200 µm kích
thước thông thường từ 60-100 µm. Đây là loại chất hấp phụ ít phân cực và tính
acid yếu hơn so với Silica. Vì có bản chất phân cực yếu nên Florisil thường được
dùng cho các HCBVTV rất phân cực, những chất mà không thể sử dụng cột
silica do liên kết quá mạnh với các nhóm silanol.
* Graphite cacbon (than chì)
Nền than chì cũng đã được một số tác giả nghiên cứu làm pha rắn trong

* Mixed mode.
Cột Mixed mode (tính năng trộn lẫn) là cột có nhiều cơ chế lưu gữ khác
nhau, nhằm đạt hiệu quả cao hơn trong quá trình làm sạch mẫu. Thông thường,
cột mixed-mode có hai cơ chế lưu giữ khác nhau.
* Ái lực miễn dịch.

Chiết bằng ái lực miễn dịch (IAC) dựa trên liên kết kháng nguyên – kháng
thể trong đó một loại imunoglobulin được dùng để gứn với chất phân tích. Bởi vì
imunoglobulin liên kết chọn lọc với chất kháng nguyên dùng để sản xuất ra nó
nên đây là kỹ thuật lý tưởng để phân tích chọn lọc một một chất hoặc một nhóm
chất nào đó. Ứng dụng của IAC còn khá hạn chế do kỹ thuật này có ứng dụng
hạn chế và khá tốn kém. 11
1.2.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ [1],[13]
Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry) là một phương pháp phân
tích dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Phương
pháp này nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân
tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử
trong một điện trường hoặc từ trường nhất định.

Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được
chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích
hợp. Các ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối
phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion
dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về
ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến h
ơn.
1.2.2.1.Thiết bị khối phổ [13],[31]

Trong đó:
1: Bộ nạp mẫu (Inlet)
2: Bộ nguồn ion hóa (Ion source)
3: Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)
4: Bộ phận phát hiện (Detector)
5: Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
54
3
2
1

13
Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ
phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương
thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình
phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất
khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại
hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương
đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Để khắc phục những khó khăn trên, cần
phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện
(interface technology) như chùm tia hạt, bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục
… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80 nhờ
kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API)
mới tạo ra bước đột phá thật sự cho phương pháp LC-MS/MS.
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển
ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước
đó cho LC-MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous
Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS)
đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft
ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được

cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa
chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện
có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để
khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

15
+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ
thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
− SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò
để phát hiện.
− MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng
nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ
MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ
cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng
va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan
tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.2.3.Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ
Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà
khối phổ thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành
phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong
dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản,
chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi
trường. Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định
mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích.
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ
TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
Hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh và các loại dược phẩm nói chung

17
levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ tại các thời điểm
khác nhau. Dư lượng ciprofloxacin được phát hiện là 2,20 – 236,6 µg/l và
norfloxacin là 6,4 – 29,6 µg/l. Một nghiên cứu khác cũng đã xây dựng phương
pháp để xác định các nhóm thuốc kháng sinh fluoroquinolon, sulfonamid,
trimethoprim, beta-lactam (penicillin và cephalosporin), nitroimidazol và
tetracyclin trong nước thải bệnh viện. Kết quả cho thấy nồng độ chất phân tích
khác nhau dao động trong phạm vi sau đây (đơn vị µg/l): ciprofloxacin 3,6-
101,0; metronidazol 0,1-90,2; sulfamethoxazol 0,4-12,8; ofloxacin 0,2-7,6;
trimethoprim 0,6-7,6; và doxycyclin 0,6-6,7 [35],[36].
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI
Nghiên cứu của Xiao-Lin Hou và cộng sự (2013) đã xây dựng và đánh giá
dư lượng của 10 cephalosporins (cefalexin, cefquinome, ceftiofur, cefacetrile,
cefalonium, cefapirin, cefazelin, cefoperazone, cefradine, cefotaxim) và
desacetylcefapirin trong sữa bò bằng kĩ thuật UHPLC-ESI-MS/MS. Các mẫu
được chiết pha rắn qua cột HLB sau khi pha loãng với dung dịch đệm phosphate
(pH 8,5). Mẫu được phân tích bằng LC-MS/MS trên cột UPLC BEH RP18
(2,1mm × 100 mm, 1,7µm) với gradient rửa giải (acid formic 0,1% và MeOH).
Nghiên cứu đã sử dụng chuẩn nội là Ceftiofur-D
3
. Các giá trị LOD từ 0,004
µg/kg đến 0,60 µg/kg; LOQ từ 0,014 µg/kg đến 2,0 µg/kg. Phương pháp được
ứng dụng để phân tích 40 mẫu sữa thu thập trên thị trường và 9 mẫu sữa bò sau
khi tiêm dưới da Cephalexin [37].
Một nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phương pháp
xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược. Đề tài sử

Trích đoạn Nghiên cứu dư lượng kháng sinh trong môi trường tại Việt Nam

---