BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG
NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC
BẰNG LC- MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG
NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC
BẰNG LC- MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon.............................................. 3
1.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon................................................. 3
1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu............................................ 5
1.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ ............................ 6

1.2.1. Sắc ký lỏng ......................................................................................... 6
1.2.2. Khối phổ ............................................................................................. 7
1.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ.................................................................... 11

1.2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng 2 lần khối phổ......................................... 12
1.2.5. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký..................................... 12
1.3. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải..... 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 15
2.2. Phương tiện nghiên cứu......................................................................... 15
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn...................................................... 15
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ .............................................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử.................................. 16
2.3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký ........................................... 17
2.3.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu...................................................... 18


ACN

Acetonitril

MeOH
MOXI
OFLO
CIP
NOR
HPLC

tR

Methanol
Moxifloxacin
Ofloxacin
Ciprofloxacin
Norfloxacin
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
Sắc kí lỏng khối phổ (High performance liquid chromatography
–Mas Spectrometry)
Thời gian lưu

S

Diện tích pic

TB


ESI

Ion hóa tia điện (Electrospray Ionizaton)

APCI

Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Chemical Ionization)

APPI

Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric
Pressure Photoionization)
Dược điển Mỹ 38 (The United States Pharmacopoeia) (bản
online)

HPLC-MS

USP 38


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon ... 48
Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu ……5
Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu .. 15
Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS ...................... 23
Bảng 3.2 : Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích chiết ....................... 31
Bảng 3.3: Hiệu suất chiết các kháng sinh khi dùng các dung môi rửa giải
khác nhau ...................................................................................... 32

nhiễm khuẩn và chi phí bắt buộc cho việc thay đổi kháng sinh cũ bằng kháng
sinh mới. Trong khi các kháng sinh mới ra đời ngày càng ít, thì việc kháng
các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế
hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người. Nguyên nhân do
trình độ dân trí còn hạn chế, lạm dụng kháng sinh liều cao, kháng sinh mạnh,
sử dụng kháng sinh mà không có chỉ định của bác sĩ làm gia tăng tỷ lệ kháng
kháng sinh. Ngoài ra, lượng kháng sinh tồn dư trong nước thải sinh hoạt, bệnh
viện hay từ các công ty sản xuất dược phẩm cũng là nguyên nhân quan trọng
dẫn tới sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn [7]. Theo kết quả nghiên cứu
ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng (2009- 2010)
về tình trạng kháng thuốc kháng sinh, tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm
cephalosporin thế hệ 3,4 là 66-83%, fluoroquinolon 60%, imipenem 35% [9].
Theo qui định của cục Quản lý Dược hiện nay, các công ty sản xuất
thuốc nói chung và các công ty sản xuất kháng sinh nói riêng muốn sản xuất
kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP với hệ thống xử lý nước thải. Tính từ
năm 2009 đến tháng 7/2014, theo số liệu của Cục quản lý Dược Việt Nam, số
kháng sinh sản xuất trong nước nhóm quinolon được cấp số đăng ký chiếm tỷ
lệ tương đối so với các kháng sinh nhóm khác. Nếu như kháng sinh
Ciprofloxacin có 49 lượt, Ofloxacin có 31 lượt cấp phép đăng kí sản xuất thì
Cefadroxil có 27 lượt, Metronidazol 37 lượt được cấp số đăng kí. Tuy vậy,
theo quy định hiện hành về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường của
Bộ Tài nguyên và Môi trường năm 2011, lại chưa có quy định giới hạn mức
hàm lượng cụ thể của kháng sinh trong nước thải [3]. Trong khi đó, chỉ một
lượng nhỏ tồn dư kháng sinh trong môi trường tích tụ lâu ngày sẽ làm biến

1


đổi gen của các vi sinh vật. Nguyên nhân này góp phần làm gia tăng tỷ lệ
kháng kháng sinh ở nước ta. Vì vậy, vấn đề cấp thiết đặt ra là phải có phương

trong thế kỷ trước, các kháng sinh quinolon không phân lập từ các sinh vật
sống, mà được tổng hợp bởi các nhà hóa học.
* Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
Công thức cấu tạo chung

Phân loại và phổ tác dụng: có nhiều cách phân loại quinolon như phân loại
dựa trên phổ tác dụng và công dụng, dựa vào phân tử có hoặc không có fluor.
Ngày nay, các quinolon được phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:

3


Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon
Quinolon

Phổ tác dụng

Công dụng

Thế hệ I

Enoxacin

Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), Nhiễm khuẩn tiết
đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu chưa biến chứng
niệu Enterobacter, Không tác dụng
trên P.aeruginosa

Flumequin


Đợt cấp của viêm phế
quản mạn tính, viêm
phổi mắc phải ở cộng
đồng, nhiễm khuẩn
mô mềm, xương

Ciprofloxacin
Ofloxacin
Norfloxacin
Lomefloxacin
Thế hệ III
Levofloxacin
Moxifloxacin

Thế hệ IV
Grepafloxacin
Trovafloxacin
Alatrovafloxacin

Như thế hệ III. Phổ mở rộng với các
vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không
điển hình.
Một số có thời gian bán thải dài hơn.

Như thế hệ I, II, III
(trừ nhiễm khuẩn
niệu phức tạp), nhiễm
khuẩn đường hô hấp,
ổ bụng, vùng chậu


Bột kết tinh màu hơi vàng.
Tan trong nước, khó tan
trong MeOH, EtOH.

C17H18FN3O3 , MW: 367.80
Norfloxacin

pKa1 = 5,76; pKa2 = 8,68
Bột kết tinh màu trắng ngà
đến ánh vàng.
pKa1 = 5,77 ; pKa2 = 8,68

C16H18FN3O3 ; 319.34
Ofloxacin

Tinh thể hình kim không
màu. Ít tan trong H2O hoặc
EtOH
pKa1 = 5,45; pKa2 = 6,2
C18H20FN3O4, 361.38

5


1.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ là phương
pháp phân tích được sử dụng rộng rãi hiện nay để nghiên cứu các chất với khả
năng xác định hàm lượng vết chất phân tích và ứng dụng trong quá trình nhận
biết, phân tích cấu trúc phân tử của các chất hữu cơ.

giải phù hợp.
Yêu cầu:
- Độ tinh khiết cao.
- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh.
- Không có bọt khí, không có tiểu phân (siêu âm, lọc).
Có 2 cách dùng pha động để rửa giải:
- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá
trình sắc ký.
- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc
ký. Chế độ gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần
với khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ
phân giải.
Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà
còn góp phần vào khả năng ion hóa của chất. Chúng có những yêu cầu cao
hơn về độ tinh khiết, hàm lượng các tạp chất. Có những dung môi được sản
xuất riêng cho LC-MS/MS.
1.2.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) [1], [12], [22]
Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ
(phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá

7


các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích
hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng
cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion...).
1.2.2.1 Nguyên tắc

Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi
qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong


Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
b. Bộ phận phân tích khối (Mass analyzer)
Các ion hình thành ở nguồn ion hoá sẽ đi vào bộ phận phân tích khối.
Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau
thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi
đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.
Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích
tứ cực, bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight- TOF). Bộ phân tích
khối tứ cực chập ba được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây
cũng là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một
khoảng trống để các ion bay qua, được đóng vai trò như bộ lọc khối. Khi một
trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện
thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào

9


tỉ số m/z và trường RF. Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi
qua được bộ lọc này.
Bộ phân tích khối tứ cực chập ba gồm ba tứ cực được ghép nối với
nhau. Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion
mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực
thứ 2 (Q2) với áp suất cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ
có mặt như khí N2, Ar, He. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách
Q3 có nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận phát hiện.

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba
c. Bộ phận phát hiện (detector)

thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
* SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction

Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường
được sử dụng là SRM và MRM.
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để
phát hiện.
MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi
phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ
cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va
chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ

11


cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.4. Ứng dụng của LC-MS/MS
- Nghiên cứu hợp chất mới, đặc biệt là nghiên cứu phát triển thuốc.
- Nghiên cứu, xác định hợp chất sinh học phức tạp, định dạng protein.
- Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng trưởng.
- Phân tích, định lượng thuốc trong dịch sinh học: theo dõi thông số dược
động học, sinh khả dụng, theo dõi điều trị.
- Phân tích, định lượng thuốc trong các mẫu nước thải bệnh viện, nước thải
của các nhà máy sản xuất dược phẩm, các mẫu nước tự nhiên.
1.2.5. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
Các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức
tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc

cột khoảng 0,5 – 1 ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột
nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra
khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này
phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường
rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút.
1.3. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải ở
Việt Nam và trên thế giới
Các kháng sinh quinolon có phổ tác dụng rộng, hoạt lực mạnh, được sử
dụng trong nhiều trường hợp, nên đây là những kháng sinh được quan tâm
nghiên cứu nhiều với nền mẫu phong phú như: trong chế phẩm, dịch sinh học,
các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh viện, công ty dược.
Phương pháp định tính, định lượng cũng đa dạng từ phương pháp vi sinh,
quang học, HPLC detector huỳnh quang với độ nhạy và tính chọn lọc cao,
nhưng lại khó có thể phân tích các nhóm kháng sinh có trong nước thải với
mức giới hạn cho phép thấp (ppb). Các nghiên cứu sử dụng trên thống HPLC13


MS/MS trên nền mẫu nước thải cũng được thế giới nghiên cứu, nhưng chưa
được áp dụng với nước thải công nghiệp dược ở Việt Nam. Một số nghiên
cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon như sau:
- Dương Hồng Anh và cộng sự (2007) đã phân tích lượng vết một số kháng
sinh họ Floquinolon trong nước thải bệnh viện dựa trên hai giai đoan chiết
tách và làm giàu bằng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết cation hỗn
hợp, định tính, định lượng bằng HPLC với detectơ huỳnh quang. Quy trình có
hiệu suất thu hồi cao (trung bình 84 - 101%), giới hạn định lượng 0,5 - 1 μg/L
[2].
- Jay E.Renew và Ching Hua Huang (2004) đã định lượng đồng thời các
kháng sinh fluoroquinolon trong nước thải bằng phương pháp LC- MS sử


cứu:

Moxifloxacin,

Ofloxacin,

Norfloxacin,

Ciprofloxacin, Ciprofloxacin 13C3.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn
Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Tên chất
Hóa chất, Acetonitril
thuốc thử
Methanol
HCl
Acid formic
Na2EDTA
Triethanolamin
Nước cất
Chất chuẩn Moxifloxacin
Ofloxacin
Norfloxacin
Ciprofloxacin
hydroclorid
Ciprofloxacin
13C3 (IS)


99,14%
93,47%
99,99%


2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ gồm có :
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LCMS/MS (Mỹ)
- Cột Agilent SB C18 (1,8 μm; 2,1 x 50mm) ; Cột Agilent Eclipse XDBC18 (3,5μm; 3,0 x 150mm).
- Cột chiết pha rắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, Oasis
(Mỹ)
- Máy lắc siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn quốc)
- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)
- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 (chính xác đến 0,1mg) (Thụy Sỹ)
- Cân Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg) (Thụy Sỹ)
- Máy lọc hút chân không
- Màng lọc 0,45 μm và 0,2 μm Cellulose acetat, Sartorius (Đức)
- Máy lọc nước siêu tinh khiết
- Tủ lạnh
- Dụng cụ thủy tinh các loại: bình định mức 10 ml, pipet chính xác, các
dụng cụ thủy tinh, micro pipet, vial...
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử
Thời gian lấy mẫu: 1/8 – 17/08.
Vị trí lấy mẫu: lấy mẫu tại bể nước thải trước khi đổ ra môi trường của
các công ty sản xuất dược phẩm.
Lọc, điều chỉnh đến pH = 2.
Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2- 80C nếu phân tích ngay trong 24 giờ hoặc
bảo quản ở tủ lạnh sâu – 300C trong vòng 1 tháng.



17