BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY DUNG
MÃ SINH VIÊN: 1101085

KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH PROTEASE
VÀ MK-7 CỦA Bacillus subtilis natto
TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CHỨA ĐẬU TƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY DUNG
MÃ SINH VIÊN: 1101085

KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH PROTEASE
VÀ MK-7 CỦA Bacillus subtilis natto
TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CHỨA ĐẬU TƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
Ds. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto và chế phẩm Natto .................................3

1.1.1.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto ..............................................................3

1.1.2.

Chế phẩm natto và tác dụng ....................................................................4

1.2.

Protease và Nattokinase ..............................................................................5

1.2.1.

Protease ...................................................................................................5

1.2.2.

Nattokinase .............................................................................................6

1.2.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto.............................................................7
1.3.


1.3.8.

Các chế phẩm chứa MK-7 trên thị trường ............................................13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng ...................................................................15
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng ...................................................................................15
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng .................................................................15
2.1.3. Môi trường ................................................................................................15
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................17


2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease
của Bacillus subtilis natto……………………………………………….…… 17
2.2.2. Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi
trường canh thang chứa đậu tương ………………..………………...… 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................17
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto .....................17
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính enzym protease .............................................18
2.3.3. Phương pháp chiết MK-7 từ dịch lên men ...............................................18
2.3.4. Phương pháp chiết MK-7 từ chế phẩm Natto...........................................18
2.3.5. Phương pháp sắc kí lớp mỏng định tính MK-7 ........................................19
2.4. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm ..............................19
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ .......................................................21
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh
protease của Bacillus subtilis natto .....................................................................21
3.1.1. Khảo sát nguồn nguyên liệu đậu tương dạng hạt và dạng bột tới hoạt
tính enzym protease ............................................................................................21
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đậu tương tới khả năng sinh enzym Proteae

Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả
năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu)

Gla

Axit γ-carboxyglutamic

HPLC

High-performance liquid chromatography

mmHg

Milimet thủy ngân

MK-7

Menaquinone 7

NCBI

National center for Biotechnology
Information (Trung tâm quốc gia về thông
tin công nghệ sinh học)

pI

Điểm đẳng điện

TLC

Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi bổ sung hạt đậu
tương tại các nồng độ ................................................................................................24
Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men tại các thời điểm ...26
Bảng 3.4: Kết quả định tính MK-7 trong dịch lên men và chế phẩm Natto .............29


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto ............................................4
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của menaquinone – 7 ....................................................9
Hình 1.3: Cơ chế tác động của MK-7 .......................................................................11
Hình 1.4: Vipteen – Công ty CPDP Vinh Gia...........................................................14
Hình 1.5: Vững cốt Vinh Gia – Công ty CPDP Vinh Gia ........................................14
Hình 2.1: Bản mỏng sắc kí ........................................................................................19
Hình 3.1: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men B. subtilis natto với
đậu tương dạng hạt và dạng bột ................................................................................22
Hình 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men nuôi cấy B subtilis
natto trong môi trường canh thang có hạt đậu tương ................................................24
Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải casein sau các khoảng thời gian nuôi cấy B.
subtilis natto trong môi trường có đậu tương ............................................................26
Hình 3.4: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 3) ........................................29
Hình 3.5: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 3) .............................................29
Hình 3.6: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 2) ........................................30
Hình 3.7: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 2) .............................................30


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bacillus subtilis natto là một phân loại dưới loài thuộc loài Bacillus subtilis,
được tìm thấy năm 1905. Kể từ đó, nó đã được ứng dụng trong sản xuất thuốc thú y,

tiêu:
 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease
của Bacillus subtilis natto.
 Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi
trường canh thang chứa đậu tương.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto và chế phẩm Natto

1.1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [64].
1.1.1.1. Phân loại khoa học
B. subtillis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Giới: Bacteria;
Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus;
Loài: Bacillus subtilis. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto [59].
Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi
sinh vật mới. Hiện nay B. subtilis natto được phân loại là một dòng thuộc loài B.
subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác ở khả năng lên men tạo sản phẩm natto
[18].
1.1.1.2. Nguồn gốc
B. subtilis natto được phân lập từ Natto – món ăn truyền thống của người Nhật.
Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên đậu tương đã nấu chín,
chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực phẩm có nguồn gốc động
vật như cá, thịt, tôm, cua,… [18], [53].

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều sản phẩm trao đổi chất như MK-7, γ-PG theo Bhat [8], levan (fructan) theo
Santos và cộng sự [12], nhóm enzym ngoại bào như 𝛾-transpeptidase, phytase,
amylase, cellulase và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease [14],
[13].
1.1.2. Chế phẩm Natto và tác dụng
Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản đã có từ cách đây hơn 1000


5

năm, có mùi nồng đặc trưng và độ nhớt cao. Natto truyền thống được làm bằng cách
ủ hạt đậu đã luộc chín trong các bó rơm hoặc phủ rơm lên, do trong rơm rạ có B.
subtilis natto. Việc tìm ra vi khuẩn gây ra quá trình lên men này là nhờ tiến sĩ Shin
Sawamura (đại học Tokyo). Năm 1905, ông phân lập được loại vi khuẩn có khả
năng lên men tạo Natto bằng cách sử dụng duy nhất nó và đặt tên là Bacillus natto
Sawamura [64]. Năm 1913, ông công bố kết quả của mình qua nhiều mẫu nghiên
cứu và kết luận vi khuẩn chủ yếu có trong Natto là Bacillus subtilis natto; đồng thời
mô tả chi tiết đặc điểm vi khuẩn, enzym và nhu cầu dinh dưỡng [64].
Năm 1980, Tiến sĩ Hiroyuki Sumi đã phát hiện ra Natto có khả năng làm tan
huyết khối. Thành phần có tác dụng tuyệt vời này được ông đặt tên là Nattokinase, là
một loại enzym serine protease trong Natto. Tác dụng tiêu huyết khối của Nattokinase
lớn hơn gấp 4 lần plasmin, đồng thời hoạt hóa pro-urokinase, tăng tạo plasmin. Tác
dụng hạ cholesterol và hạ huyết áp của Natto cũng đã được ghi nhận. Năm 2006, tại
hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand, giáo sư Masafumi
Kitakaze khẳng định tác dụng làm giảm rõ rệt chứng mỡ máu cao và kêu gọi cộng
đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ Natto [65].
Một tác dụng quan trọng khác của Natto là ngăn chặn loãng xương, được coi là
kết quả của nhiều yếu tố. Trong đậu tương có chất Isoflavon, có tác dụng tương tự
như hormon sinh dục nữ, giúp ngăn ngừa xốp xương [58]. Đồng thời, Natto chứa hàm


Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác subtilisin NAT hay

subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275
gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27.728Da [31],
[33], [63].


Elastase: theo nghiên cứu của Sumi, elestase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7 [21].

Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa; ổn định hoạt tính trong
khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 500C [36].


Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp [60].


Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; trung tâm hoạt động là bộ ba xúc

tác: Asp33, His81, Ser259 [18].
Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu,
ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.
1.2.2. Nattokinase


7

Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất


protease hơn 20% so với môi trường canh thang thường, tuy nhiên các enzym tạp
cũng tăng lên [1].
Năm 2005, Junguo Liu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE.
Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu tương
8,28 %, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300U/ml [25].
Năm 2008, Deepak và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng
hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Hoạt tính Nattokinase đạt 3.194 U/ml với
thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5%
[9].
LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất Nattokinase từ vi
khuẩn Bacillus subtilis natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%,
CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu tương 3% [45].
Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus
sp.7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzym Nattokinase 470FU/g
trên môi trường thạch đậu tương hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên
khay từ một số chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập giống của Viện sinh học nhiêt
đới và phân lập từ thực phẩm Natto [2].
1.3.

Vitamin K2 và MK-7

1.3.1. Nguồn gốc
Vitamin K2 ( gồm MK-7 và các MK-n khác) là một nhóm vitamin thuộc
nhóm vitamin K.
1.3.2. Sơ lược về Vitamin K
Vitamin K lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1929 bởi Henrik Dam [20].
Vitamin K thuộc nhóm vitamin tan trong dầu, giống nhau ở cấu trúc vòng
naphthoquinone, có nhóm thế methyl tại vị trí cacbon số 3, đóng vai trò quan trọng



10

Màu sắc: tinh thể màu vàng [32].
Điểm sôi: 2000C tại 0,0002 mmHg [32].
Điểm nóng chảy: 540C [29].
Độ hòa tan: không tan trong nước, tan được trong dầu, mỡ [39].
1.3.6. Tác dụng và cơ chế tác dụng
1.3.6.1.

Tác dụng và cơ chế tác dụng

Vitamin K được xem là “ Vitamin đông máu” từ khi được phát hiện năm 1929,
do tác dụng của nó tới quá trình đông máu trong cơ thể. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu
chỉ ra chức năng khác của Vitamin K ngoài vai trò cổ điển của nó, bao gồm tăng
cường cấu trúc xương, điều biến sự vôi hóa thành mạch, từ đó giúp cải thiện sức khỏe
xương và giảm các rủi do về tim mạch.
Tất cả các Vitamin K được cho rằng có chung một tác dụng quan trọng, do
chung cấu trúc vòng naphthoquinon [44]. Vitamin K là một đồng yếu tố với enzyme
γ-glutamate carboxylase (GGCX), giúp chuyển đối gốc glutamat trong cấu trúc
protein thành γ-carboxyglutamate, có ái lực mạnh mẽ với canxi. Các protein này được
gọi là protein phụ thuộc Vitamin K, hay các Gla protein [44].
Hiện nay có mười chín thành viên viên nhóm Gla được biết đến, trong đó có
Osteocalcin ở xương và Matrix GLA protein (MGP) chủ yếu ở sụn và thành mạch
máu liên quan đến quá trình tạo xương mà không liên quan đến đông máu.
Osteocalcin tạo ra từ tế bào sinh xương nhờ được cảm ứng bởi vitamin D3, cần
vitamin K hoạt hóa để có thể gắn và vận chuyển calci vào [11], [34], [40]. MGP có
thể ngăn chặn lắng đọng canxi quá mức trong [51], [52], [62] và ngăn lắng đọng
canxi thành mạch, giúp giảm vôi hóa thành mạch [24], [30]. Vitamin K2 được cho là

dài, (MK-7 và lớn hơn) với việc giảm nguy cơ tử vong 9% với liều bổ sung
10mg/ngày. Trong khi đó, lượng vitamin K1 không liên quan đáng kể đến bệnh động
mạch [16]. Geleijnse và cộng sự, nghiên cứu đánh giá trên gần 5000 người, thấy rằng
một lượng cao của K2 ( ≥ 32 mcg mỗi ngày), nhưng không phải K1, giảm vôi hóa
động mạch 50%, tử vong do bệnh tim mạch 50% và tất cả các nguyên nhân cái chết
là 25% [17] . Như vậy, có lẽ chỉ Vitamin K2, chứ không gồm Vitamin K1 có tác dụng
trong phòng ngừa các bệnh về tim mạch. Và trong các Vitamin K2, thì menaquinon
chuỗi dài có liên quan mật thiết hơn.
Thời gian bán thải của Vitamin K1 và MK-4 là vài giờ [37], thời gian bán thải
của MK-7 là vài ngày [46], [49]. Với cùng lượng sử dụng hằng ngày, nồng độ của
MK-7 trong huyết tương có thể cao gấp năm lần Vitamin K1. Theo GS.TS. Hoàng
Tích Huyền, đại học Y Hà Nội, MK-4 có thời gian bán thải ngắn, khá khó khăn trong
sử dụng, hiện nay MK-7 được sử dụng phổ biến hơn.
1.3.6.3.

Áp dụng trong điều trị

MK-7 được sử dụng để dự phòng và giúp phòng ngừa loãng xương, còi xương,
gãy xương, giúp xây dựng và bảo vệ xương khỏe mạnh, làm chậm quá trình mất
xương do tuổi, cải thiện chất lượng xương trong nhiều nguyên nhân bệnh lý như mãn
kinh, do dùng thuốc (như corticoid), bệnh Parkinson, xơ gan mật, chán ăn [41][70].
Đối với tim mạch, MK-7 giúp chống xơ vữa động mạch, chống tắc nghẽn mạch,
tránh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực [70].
1.3.7. Các nghiên cứu định tính, định lượng và sản xuất MK-7
1.3.7.1.

Sản xuất MK-7

Hiện nay MK-7 có thể được sản xuất bằng các phương pháp hóa học tổng hợp
hoặc thông qua quá trình lên men, thường sử dụng các chủng vi khuẩn Bacillus

thực phẩm bằng HPLC sử dụng cột C-18 pha đảo [48].
1.3.8. Các chế phẩm chứa MK-7 trên thị trường
Sản xuất MK-7 bằng phương pháp lên men đã được ứng dụng nhiều trên thế
giới, tạo ra các sản phẩm thương mại tiện dụng, đem lại nhiều lợi ích về kinh tế. Tại
Việt Nam cũng có công ty CP Dược phẩm Vinh gia sản xuất sản phẩm cung cấp MK7 như Vững cốt Vinh Gia, Vipteen Vinh Gia. Việc tiếp tục nghiên cứu sâu để phát
triển sản phẩm là rất cần thiết và tiềm năng.


14

Hình 1.4: Vipteen – Công ty CPDP

Hình 1.5: Vững cốt Vinh Gia – Công

Vinh Gia

ty CPDP Vinh Gia


15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
Bacillus subtilis natto – (chủng được phân lập từ chế phẩm Natto Nhật Bản
trên thị trường được lưu giữ tại phòng Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường
Đại học Dược Hà Nội).
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Trung Quốc

Thạch bột

Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
a) Công thức môi trường thạch thường (MT1)
Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g

Cao thịt

0,5g

NaCl

0,5g

Thạch thường

2,3g

Nước máy vđ



Pepton

1,0g

Cao thịt

0,5g

NaCl

0,5g

Bột đậu tương

Tùy nồng độ

Nước máy vđ

100ml

d, Công thức môi trường canh thang đậu hạt (MT4)
Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g



Máy lắc

Đức (Bioshaker)

Tủ ấm, tủ sấy

Đức (Memmert)

Tủ lạnh

Nhật (Toshiba)

Nhật (ALP)

Cân kỹ thuật

Đức (Satorius)

Hàn Quốc (Daewoo)

Máy li tâm

Nồi hấp tiệt
trùng
Lò vi sóng

Đức (Rotofix)
(Universal)


ống giống trong tủ lạnh 4-50C. Việc cấy truyền được thực hiện 1-2 tháng/lần [11].
b) Phương pháp nhân giống trong bình nón