Đồ án tốt nghiệp

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

1


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

2


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

DANH MỤC VIẾT TẮT
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
BHM : Bushnell Haas medium
EG



SS

:

Suspended Solids

DNS

:

3,5-dinitrosalicylic

Vòng/ phút

QCVN :

Quy chuẩn Việt Nam

QHTN :

Quy hoạch thực nghiệm

TCCP :

Tiêu chuẩn cho phép.

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

3

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 26 tháng 4 năm 2016
Sinh viên
Phạm Thị Hằng Nga

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

5


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

TÓM TẮT
Hằng năm có khoảng 230 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo ra từ quá trình quang hợp ở
thực vật, trong đó có khoảng 70 tỉ tấn (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất
nông nghiệp, chất thải các nhà máy giấy, đường và dệt may. Cellulose không tan
trong nước và chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với kiềm hay acid hoặc bị thủy phân
bởi các enzyme cellulase. Hiện nay, lượng phế phụ phẩm nông nghiệp cũng như
chất thải từ các nhà máy đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường. Ngoài ra,
Việt Nam là một nước nông nghiệp, hàng năm lượng phụ phẩm nông nghiệp tạo ra
từ ngành chế biến nông sản là vô cùng lớn và đa dạng, phong phú như: rơm, rạ, cây
ngô, bã mía, bã dong riềng, bã sắn ... Miến dong là một loại sản phẩm trong số đó,
miến dong được sản xuất từ dong riềng và được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡng
cũng như mùi vị của nó. Quá trình chế biến tinh bột dong từ củ dong riềng tạo ra
một lượng chất thải lớn là bã dong. Lượng bã này tại một số làng nghề sản xuất
được tận thu và tái sử dụng rất ít còn lại xả thẳng ra môi trường mà không qua xử lý
gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, ô nhiễm đất cũng như bầu không khí tại

luôn tạo ra một lượng chất thải. Việc không tận thu, tái sử dụng cũng như không xử
lý nguồn thải này gây lãng phí và gây ô nhiễm môi trường từ đó đòi hỏi một khoản
tiền lớn để giải quyết triệt để.
Miến dong là một sản phẩm dạng sợi được sản xuất từ tinh bột dong riềng và nổi
tiếng với nhiều làng nghề ở Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hưng Yên, Hà Nội,… Việc sản
xuất tinh bột dong tạo ra lượng bã thải bằng khoảng 80% so với lượng nguyên liệu
[10].Thành phần bã thải này chủ yếu là cellulose – một dạng hợp chất hữu cơ cấu
trúc phức tạp, trong tự nhiên phân hủy với tốc độ chậm và không hoàn toàn nên nên
về lâu dài thì đây là nguồn thải có nguy cơ gây ô nhiễm môi trườngnghiêm trọng.
Một trong những giải pháp hiệu quảvà kinh tế nhất nhằm chuyển hóa được nguồn
cơ chất cellulose này thành các sản phẩm có giá trị là sử dụng enzyme cellulase loại enzyme có khả năng phân cắt cellulose.
Từ những lý do trên, em lựa chọn đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và khảo sát các
điều kiện nuôi cấy của chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để
ứng dụng trong xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong”
Đề tài trên em tiến hành nghiên cứu với mục đích:
-

Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase
cao.
Khảo sát, tối ưu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp cellulase
của chủ

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

7


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Hành còn tổ chức thu mua dong riềng ở các xã lân cận về để sản xuất, chế biến
thành bột dong riềng cung cấp cho thị trường...Theo thống kê từ Trung tâm khuyến
nông tỉnh, toàn tỉnh có trên 600 ha dong riềng; diện tích dong riềng phân bố tập
trung chủ yếu ở các huyện: Yên Sơn 300 ha, Chiêm Hóa 160 ha, huyện Lâm Bình
40 ha; năng suất bình quân đạt 80 tấn/ha; sản lượng trên dưới 48.000 tấn củ
tươi/năm[33].
Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

8


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Và theo thống kê của sở Công thương, diện tích trồng dong riềng tại Bắc Kạn
đã tăng đột biến lên tới khoảng 2.900ha (tăng 56,97% so với năm 2012 và đạt
138,14% kế hoạch năm). Với dự ước năng suất thu hoạch đạt từ 50-70 tấn củ/ha thì
tổng sản lượng củ dong riềng thu hoạch năm 2013 trên địa bàn tỉnh sẽ ước đạt
182.166 tấn. Sau khi để giống cho vụ trồng dong năm 2014 khoảng 3.400 tấn tương
đương 1.700ha (theo kế hoạch trồng dong riềng năm 2014 trên địa bàn tỉnh do Sở
Nông nghiệp và Phát triển nông thông xây dựng) thì sản lượng củ dong riềng đưa
vào chế biến tiêu thụ năm 2013 trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn ước khoảng 178.766 tấn .
Hiện nay trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn có 112 cơ sở, hộ gia đình hoạt động chế
biến dong riềng (bao gồm cả các cơ sở, hộ gia đình đầu tư mới, nâng công suất trong
năm 2013). Trong đó, 24 cơ sở, hộ gia đình vừa chế biến tinh bột, vừa sản xuất
miến; 14 cơ sở, hộ gia đình chuyên sản xuất miến; 74 cơ sở, hộ gia đình chuyên chế
biến tinh bột. Đối với 98 cơ sở, hộ gia đình (vừa sản xuất bột, miến và chuyên sản
xuất bột cộng lại) có tổng công suất chế biến tinh bột dong riềng trên địa bàn tỉnh
khoảng 1.170 tấn củ/ngày tương đương sản lượng củ dong riềng được chế biến


Quy trình sản xuất miến dong:

Từ củ dong riềng, thông qua quá trình chế biến, thu được tinh bột dong riềng. Có
hai loại tinh bột dong riềng là tinh bột khô và tinh bột ướt. Hiện nay, miến được sản
xuất chủ yếu từ tinh bột dong riềng ướt.Thông thường, tinh bột dong riềng ướt được
sản xuất ở các vùng người dân làm nghề sản xuất miến và vùng nguyên liệu trồng củ
dong. Tinh bột dong riềng ướt được bảo quản kín trong bao hoặc trong hầm kín và
sử dụng để làm miến cả năm. Tính trung bình, 1000 kg củ dong riềng sau khi chế
biến thu được 250- 300 kg tinh bột ướt. Từ tinh bột ướt, đem phơi nắng hoặc sấy
khô sẽ thu được tinh bột dong riềng khô, có thể bảo quản được trong thời gian dài.
•

Quy trình chế biến tinh bột dong:

Công nghệ chế biến các loại củ, đặc biệt là củ dong riềng có tính chất truyền
thống và tương đối phổ biến, làm tăng giá trị sử dụng của cây dong riềng đồng thời
góp phần làm tăng thu nhập cho bà con nông dân. Sản phẩm chính thu được là tinh
bột dong riềng.

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

10


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Củ dong

Củ dong sau khi rửa được đưa tới hệ thống máy nghiền, xát.Trong công đoạn này
củ dong được nghiền, xát dưới tác động của mâm (hoặc lô) nghiền, xát quay ở tốc
độ cao, tạo thành hỗn hợp lỏng gồm bã, nước tinh bột.
Bước 3: Lọc tinh bột dong riềng
+ Đối với phương pháp nghiền lọc không liên hoàn:
Quá trình nghiền và tách lọc tinh bột, bã được thực hiện trên 02 máy móc thiết bị
khác nhau. Hỗn hợp bã, tinh bột, nước sau nghiền được đưa tới hệ thống bể chứa,
sau đó được bơm sang các máy tách bã (hình trụ tròn, có mô tơ, cánh khuấy, màng
lọc), hoà thêm nước, dưới tác động quay của cánh khuấy tinh bột sẽ được tách ra
qua màng lọc xuống bể chứa và lắng tinh bột. Quá trình đánh lọc được tiến hành liên
tục cho đến khi lượng tinh bột được tách ra hoàn toàn, xơ bã sẽ được xả ra khu bể
chứa tập trung để xử lý.
+ Đối với phương pháp nghiền lọc liên hoàn:
Quá trình nghiền và tách tinh bột, bã sẽ được thực hiện đồng thời trên cùng một
máy nghiền lọc liên hoàn.Trong quá trình nghiền, hỗn hợp tinh bột, nước được tách
ra khỏi xơ bã và qua màng lọc vào bể lắng tinh bột.
Bước 4: Lắng, rửa tinh bột dong riềng. Sau công đoạn tách bã, tinh bột được để
lắng, tách nước, tách bột non, tiếp đó sẽ được đánh, lọc, lắng, nhằm rửa sạch phần
nhựa của củ dong và loại bỏ tạp chất làm cho tinh bột trắng sạch. Công đoạn đánh
lọc, lắng tinh bột này được tiến hành cho đến khi nước không còn vẩn đục. Kết thúc
giai đoạn lắng, sau khi gạn hết nước và phần cặn bã phía trên, sẽ thu được tinh bột
ướt, có độ ẩm từ 38- 40% có thể sử dụng ngay làm nguyên liệu sản xuất miến hoặc
bảo quản kín hàng năm trong bao nilon chôn dưới đất 15 (hoặc trong bể xi măng)
hay phơi nắng để có tinh bột khô tùy theo mục đích sử dụng.
Bước 5: Làm khô tinh bột :

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

12



4,6

6,8

5,5 – 9

C

28,5

29,7

26,5

40

Độ màu

Co - Pt

1140

407

-

150

COD


247

100

∑N

mg/l

13

145,6

95,4

40

∑P

mg/l

1,6

27,5

23,8

6

Chỉ tiêu

tiêu

K1

K2

K3

QCVN 05 –
2009

Đơn vị

1.

Bụi

0,28

0,11

0,381

0,2

mg/m3

2.

NO2


4,12

7,36

1

mg/m3

5.

NH3

0,221

0,112

0,47

0,05

mg/m3

6.

H2 S

0,32

0,26

phần chính gây ô nhiễm môi trường đất và trực tiếp gây ô nhiễm môi trường không
khí cũng như ảnh hưởng đến chất lượng nước mặt và nước ngầm ở làng nghề.

Bảng 1.3: Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu [24]
Vật
liệu

Nguyên liệu đầu vào (tấn)
2000

2001

2008

2010

2000

2001

2008

2010

Củ
sắn

116.00
0


0

16.00
0

22.00
0

25.600

Tổn
g

177.00
0

216.00
0

253.000

57.00
0

64.00
0

73.00
0


bón

Bã sắn

30

0

60

10

Bã dong

0

5

0

95

Tại làng nghề Dương Liễu bã thải từ sắn hầu như được sử dụng lại, trong khi bã
thải từ dong riềng không được tái sử dụng. Để quản lý và xử lý lượng bã thải này
sao cho tạo ra lợi ích kinh tế và giảm tác động của nó với môi trường xung quanh là
một thách thức lớn đối với địa phương.

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

15

0,5

P

0,11

K

0,16

Trong 90% lignicellulose đó thì cellulose chiếm từ 35 – 50%. Ta thấy lượng bã
dong thải ra với thành phần cellulose rất cao. Do đó mà nên có phương pháp tái sử
dụng hiệu quả để tận thu chất thải và thân thiện môi trường.
1.4.1. Cellulose và cấu trúc :
Cellulose là thành phần chủ yếu của tổ chức thực vật (chiếm khoảng 35-50%
trọng lượng khô của xác thực vật) và đặc biệt là ở rễ. Ở tế bào thực vật và một số tế
bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến
nhất trong tự nhiên. Hằng năm một lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 10 12 tấn)
được tạo thành chủ yếu từ quá trình quang hợp [19].

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

16


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

bâc 2 và bậc 3 rất phức tạp, tạo thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên
kết Hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, ngoài ra còn có lực Vander Wall
tạo ta mạng lưới gồm các sợi song song hoặc đan chéo nhau có độ bền cao.
Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có
khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản
phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải
hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có
khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase
[11].
1.4.2. Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase
1.4.2.1. Enzyme cellulase :
Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiều
enzyme khác nhau. Cellulase là các enzyme thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D
– glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides.
Có 3 loại enzyme cellulase chính:
-

-

-

Endoglucanases (1,4- β – D – glucan – 4 - glucanohydrolases) có khối lượng
phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và
tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose, lichenin và β– D glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và
glucose.
Exoglucanases, gồm 2 loại là 1,4 –β-D-glucan glucanohydrolases
(cellodextrinases) và 1,4 –β–D –glucan-cellobiohydrolases
(cellobiohydrolases). Exoglucanases có hoạt tính thủy phân trên cả 2 đầu khử
và không khử của mỗi đoạn cellodextrin. Trong đó cellodextrinases tạo ra sản
phẩm là glucose và cellobiohydrolases tạo ra sản phẩm chính là cellobiose.


Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

19


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

1

2

3

Hình 1.5. Ba loại phản ứng xúc tác cellulase
Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase như
endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Thiếu một trong ba loại enzyme trên
thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.
Từ những nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động
tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận
chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo
thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế
tác động của cellulase, cụ thể cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase như
sau: đầu tiên EG tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết
β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp đó CBH tấn công cắt ra từng đoạn
cellobiose từ đầu mạch được tạo thành. Kết quả tác động của EG và CBH tạo ra các
celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose. BG thủy phân tiếp và tạo thành
glucose.

chứa các nguồn cellulose khác nhau[15,16]. Trong số các vi sinh vật sinh tổng hợp
cellulase đáng chú ý nhất là vi khuẩn, Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn). Hầu hết
các loại nấm có thể sử dụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose [25], trong khi
ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate,
cellulose. Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặc
điểm này được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn. Nấm
Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại bào. Hầu
hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung vào các loài nấm
(Trichoderma,Humicola, Penicilium, Aspergillus, Actinomucor), vi khuẩn
Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes và Streptomyces).
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạp
-được sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [18]. Mặc dù những

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

21


Đồ án tốt nghiệp

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên, thế nhưng vi khuẩn lại
có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn để được dùng trong
việc sản xuất cellulase. Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase
của các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm.
Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của vài giống vi khuẩn như Cellulomonas,
Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga, Bacillus và Micrococcus đã được
nghiên cứu và báo cáo trên thế giới [18].
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả trong

∗

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Nguồn Carbon:

Carbon có trong thành tế bào, tế bào chất, trong tất cả các phân tử enzyme, axit
nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy những hợp chứa carbon có ý
nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật.
Các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đòi hỏi nguồn carbon khác nhau.
Nguyễn Đức Lượng và cộng sự khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces
griseus với nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cưa [7]. Đối với nấm
sợi Aspergillus fumigutus và các loại nấm mốc ưu nhiêt, nguồn carbon thích hợp
nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc. Môi trường cám và bã củ cải đường là môi
trường thích hợp nhất đối với Trichoderma reesei [6].
∗

Nguồn nitơ:

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu thành nên các protein cấu trúc
cũng như các enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật có
thể là nitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ.
Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase.
Điều này phụ thuộc điều kiện sinh lý của từng chủng giống. Theo Tăng Thị Chính
và cộng sự một số chủng vi khuẩn ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải có khả năng
sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng phát triển trong môi trường với nguồn nitrogen
là pepton và cao nấm men [2].
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với vi sinh vật sinh cellulase là nguồn
nitrat. Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo
thành cellulase.

enzyme của chúng, mỗi enzyme đều có một vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của
enzyme là cao nhất.
Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng nấm sợi
có khả năng phân giải cellulose caovới pH tối ưu 4 – 7 [3]. Theo Nguyễn Đức
Lượng và cộng sự khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus tối ưu
với điều kiện pH ban đầu là 6;7 [7]. pH tối ưu cho khả năng sinh enzyme cellulase của
chủng Bacillus khoảng 6,5-7,5 [26].
∗

Ảnh hưởng của nồng độ oxy:

Các loài vi sinh vật khác nhau có phản ứng khác nhau với nồng độ oxy của môi
trường. Vi sinh vật sinh tổng hợp celluase có thể là các loài hiếu khí, hiếu khí tùy
tiện và yếm khí do đó nồng độ oxy ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển cũng
như khả năng tổng hợp cellulase của chủng.
1.6. Các phương pháp sinh học xử lý bã thải rắn để làm tăng giá trị nguyên liệu
Phương pháp xử lý bã dong hiệu quả nhất là tận dụng bã để sản xuất ra các sản
phẩm có giá trị, vì như thế có thể tiết kiệm được toàn bộ hoặc đáng kể chi phí xử lý
bã, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho cơ sở sản xuất.
∗

Làm thức ăn chăn nuôi:

Tận dụng các thành phần dinh dưỡng trong bã dong để làm thức ăn cho chăn nuôi
đang là vấn đề được quan tâm trong ngành nông nghiệp hiện nay. Bởi vì lượng chất
dinh dưỡng trong bã dong cao, nguồn nguyên liệu dồi dào. Hiện nay có 2 phương
pháp xử lý bã dong làm thức ăn gia súc
Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

24

riềng làm thức ăn gia súc và phân bón hữu cơ tại tỉnh Bắc Kạn” của Viện Môi
trường Nông Nghiệp đã xây dựng quy trình chế biến thức ăn chăn nuôi từ bã dong
riềng theo 2 phương pháp là ủ chua và lên men vi sinh. Đưa ra mô hình chế biến bã
dong riềng làm thức ăn bổ sung cho lợn với quy mô 2 tấn/năm. Qua đánh giá ảnh
hưởng của thức ăn chăn nuôi đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của đàn lợn
cho thấy sử dụng thức ăn chăn nuôi từ bã dong riềng đã giảm bớt 10 - 20% lượng
thức ăn và cho hiệu quả kinh tế cao hơn[27].
∗

Làm phân bón:

Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56

25