LỜI CẢM ƠN
Hiện nay, trong quá trình học tập tại các trường Đại học chủ yếu chú
trọng đào tạo cho Sinh viên nắm vững kĩ thuật lý thuyết, và kiến thức tổng quan
ngành nghề, và những hiểu biết về khoa học nói chung. Nên chưa thể đi sâu vào
thực tế. Việc tham gia nghiên cứu khoa học là 1 cơ hội cho sinh viên tiếp cận,
ứng dụng những kiến thức đã được học trên ghế nhà trường vào cuộc sống cụ
thể, đem lại cho sinh viên những kinh nghiệm bổ ích, và tinh thần hăng say lao
động, thêm yêu ngành nghề mình đã chọn. Bên cạnh đó còn rèn luyện kĩ năng
thực hành, rèn cho sinh viên sự nhạy bén, sáng tạo điều rất cần thiết cho Sinh
viên sau này khi ra trường.
Báo cáo nghiên cứu khoa học đã được hoàn thành tại Viện Công nghệ
Sinh học, trường Đại học Lâm Nghiệp - thị trấn Xuân Mai - huyện Chương Mỹ Thành phố Hà Nội. Để hoàn thành báo cáo này, chúng em luôn được sự quan
tâm của nhà trường, sự động viên của bạn bè và sự giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt
tình của các thầy cô.
Nhân dịp này, cho phép chúng em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
ThS. Nguyễn Thị Minh Hằng đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ chúng em trong suốt
quá trình nghiên cứu. Xin được cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp,
trường Đại học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá
trình nghiên cứu để hoàn thành bản báo cáo này.
Do trong quá trình nghiên cứu khoa học còn có nhiều hạn chế về mặt thời
gian và kinh nghiệm, báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô giáo để báo cáo nghiên cứu khoa
học được hoàn thiện hơn.
Chúng em xin trân thành cảm ơn!

1


MỤC LỤC

2


Czapek Dox Agar.

PDA:

Potato Dextrose Agar.

ISP :

International Streptomyces Project

LB:

Lysogeny Broth.

TSB:

Tryptone - casein soy broth.

VSVKĐ:

Vi sinh vật kiềm định.

HTKS:

Hoạt tính kháng sinh.

CKS:

Chất kháng sinh.

(Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn
chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử
6


dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ
lệ loài có khả năng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh
có khả năng chống nấm mạnh. Cho tới nay , trong khoảng hơn 8.000 chất kháng
sinh được biết đến trên thế giới thì 80% là do xạ khuẩn sinh ra
(Dhanasekaranetal., 2012). Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh chất kháng sinh kháng nấm bệnh cây có thể góp phần vào công tác bảo
vệ cây trồng và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng em thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu khả năng đối kháng của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng
rừng đối với một số loại nấm vật gây bệnh thực vật phổ biến ở miền bắc Việt
Nam”.

7


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Nấm được xếp vào nhóm sinh vật, nhưng không giống như Rong Tảo,
nấm không chứa diệp lục tố. Cấu tạo thường là đơn bào hoặc đa bào, có thể quan
sát dưới kính hiển vi hoặc nhìn bằng mắt thường, chúng có thể đo được từ vài
microns cho tới vài centimeters có khi tới vài metters, trường hợp nấm có quả
thể ở Lớp Đảm khuẩn (Basidiomycetes). Nấm có cơ quan sinh trưởng dạng sợi,
phân nhánh. Một tập hợp nhiều sợi nấm sinh trưởng tạo thành tản nấm là thể
dinh dưỡng của nấm. Sợi nấm không có màng ngăn gọi là sợi đơn bào và sợi
nấm có nhiều màng ngăn gọi là sợi đa bào. Chiều rộng của sợi nấm biến động

gốc bị thối cây sẽ bị đổ và chết. Thường cây được 2-3 năm tuổi dễ bị nhiễm
bệnh, tuy nhiên cây non vẫn bị bệnh. Cây con gieo từ đất có mầm bệnh có thể
mang mầm bệnh và sau khi trồng nếu điều kiện thích hợp bệnh sẽ phát
triển.Bệnh thường phát triển nặng vào đầu mùa mưa, do nấm pythium
aphanidermatum thuộc lớp Phycomycetes gây ra. Có nhiều loài Pythium gây
bệnh này nhưng chủ yếu là P.aphanidermatum. Nấm có đặc điểm như: túi bào
tử có hình cầu tròn.

Hình 1.1 Triệu chứng đốm thân cây đu đủ do nấm P.aphanidermatum gây ra.
* Bệnh phồng lá chè:
- Thường phát sinh ở các bộ phận: lá non, lá bánh tẻ, đôi khi xuất hiện ở
cành non và quả non. Ban đầu vết bệnh là những đốm nhỏ màu vàng nhạt, xung
quanh vết bệnh bong lên bất thường, sau đó vết bệnh lớn dần, mặt trên lõm
xuống, mặt dưới phồng lên. Trên vết bệnh phủ một lớp phấn màu trắng, cuối
cùng vết bệnh chuyển sang màu nâu, vết phồng khô xẹp xuống.

9


- Bệnh do nấm exsobasidium vexans gây ra. Dưới điều kiện độ ẩm cao,
nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh. Các thời điểm bệnh thường phát sinh mạnh
thường từ tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9- 10. Nhiệt độ thích hợp là 15–20 0C.
Nhiệt độ 11-120C không có lợi ích cho sự phát triển của bệnh và trên 26 0C bệnh
không phát triển.

Hình 1.2 Triệu chứng phồng lá chè do nấm exsobasidium vexans gây ra.
* Bệnh thán thư trên cây xoài:
- Là loại bệnh nguy hiểm nhất, thường gây hại trong mùa mưa hoặc
những lúc đêm có sương. Nấm bệnh tấn công trên cành non, lá non, hoa và quả.
Trên hoa bệnh là rụng hoa, ở lá đốm bệnh màu xám nâu, tròn hay góc cạnh, tạo


Hình 1.5 Triệu chứng bệnh phấn đen ở bắp ngô do nấm Ustilago zeae
Shwein Unger gây ra.
* Bệnh khô cành lá cây cà phê:
Bệnh do nấm Colletotrichum cofeanum gây ra trên cây cà phê, bệnh phát triển
đặc biệt vào mùa mưa. Khi bị bệnh trên cành, lá ban đầu chỉ xuất hiện những
đốm tròn màu nâu đen,

sau đó lan rộng dần,

trên đó có các vòng

tròn đồng tâm. Nếu bị

nặng các vết bệnh liên

kết với nhau thành

từng mảng khô, màu

nâu hay đen sẫm.

12


Hình 1.6. Triệu chứng bệnh khô cành lá cây cà phê do nấm Colletotrichum
cofeanum gây ra
1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.2.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố

chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc. Đường kính
mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan,1998).
Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bề
mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình
tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng
tâm (xem hình 1.7), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn,
khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc
sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn
có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp
hơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có thể mang các
màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím.

14


Hình 1.7. Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn
Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường
là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung
cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. Đường
kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn
và không bị đứt đoạn. Tuỳ loại môi trường mà khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra
môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc
tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ.
Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên
những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống sinh
bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể mọc
đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh bào tử
có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 – 7nm
(hình1.8).



Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở
chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó
ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [8].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có
thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số
hợpchất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [9].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein,
pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôni…Khả
năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.
1.2.4. Đặc điểm sinh lý hóa của xạ khuẩn
1.2.4.1. Đặc điểm sinh lý nuôi cấy
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ
khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung ở nhiều lớp đất
trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều có mặt
của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa
nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính.
Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sử
dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng
bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton, cao ngô,
…(nguồn nitơ hữucơ).
1.2.4.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn
Có nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điều
trị bệnh nhưng nhìn chung có thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất có
nguồn gốc vi sinh vật và thực vật có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt
một số vi sinh vật khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp. Chất

kiện của môi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau
tùy vào từng chủng và tuổi của bào tửgiống.
- Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp
nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chất
18


kháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên
men có khuấy đảo và sụckhí.
* Thành phần môi trường nuôi cấy:
- Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môi
trường lên men. Trước hết là nguồn C, N và phosphat vô cơ. Các vi sinh vật khi
đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi trường lên men
có nguồn gốc C, N và các thành phần môi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng
sinh các chất khác nhau.
- Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh
chịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua các nguồn cacbon khác nhau. Tuỳ thuộc vào
từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose,
Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng có thể là các
loại tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường, đại
mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng có hoạt tính amylaza cao nên nguồn
cacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột.
- Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh
hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ
chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh như
Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng
sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi
trường. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu
tương, bột đậu xanh, cao ngô… nguồn nitơ vô cơ là: muối amon hoặc nitrat.
1.3. Giới thiệu về Bacillus

được khi có sự hiện diện của oxi và có thể tạo thành dạng đặc biệt khi tế bào ở
trạng thái nghỉ được gọi là nội bào tử (endospore). B.subtilis là vi khuẩn đại diện
cho loài (genus) Bacillus của họ Bacillaceae (family). Năm 2004, dựa trên
phương pháp phân tích 16S rRNA người ta phân chia loài Bacillus thành nhiều
họ và loài vi khuẩn tạo bào tử khác nhau. Những thành viên của họ Bacillus
được đề cập ở đây là loại vi khuẩn “ gram dương, kỵ khí hay kỵ khí tùy tiện, tạo
nội bào tử”.
* Vị trí phân loại:
20


Giới (kingdom): Bacteria
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (order): Bacillales
Họ (family): Bacillaceae
Loài (genus): Bacillus
* Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilus phân bố hầu hết ở trong tự nhiên. Phần lớn
chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu
CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc thì Bacillus subtilus rất hiếm.
Nước và bùn cửa sông cũng như ở biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus
subtilus (Vũ Thị Thứ, 1996).
1.3.2. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, là vi khuẩn Gram dương,
kích thước 0,5 - 0,8 μm × 1,5 - 3μm, đứng đơn lẽ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi
khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế
bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8μm. Bào tử phát triển
bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu
nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000).

2000).
* Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:
- Hình thành vách ngăn.
- Sự tạo tiền bào tử.
- Tạo lớp vỏ bào tử.
- Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
- Sự giải phóng bào tử.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và
nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc
và tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp
22


màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng.
1.3.6. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả
năng chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột.
Chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.
Với các vi sinh vật gây bệnh, khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện
của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng,
cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh
hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường,
đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt
đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ
đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó
bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm,
thậm chí hàng thế kỉ.
Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai

dụng kháng khuẩn của chúng”, (Tạp chí sinh học, tập 34, số 1, tr.99 - 106)
- Năm 2013, Đỗ Thị Tuyến và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Đặc điểm
phân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè tại
Thái Nguyên”, (Tạp chí Khoa học & Công nghệ, tập 107, số 07, tr.97 - 102).
- Năm 2014, Vũ Thúy Nga đã nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn chủng vi
khuẩn Bacillus đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên một số
cây trồng cạn.
- Năm 2014, Trần Thị Hồng và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Phân lập vi
sinh vật đối kháng một số nguồn bệnh nấm thực vật và đánh giá hoạt tính của
chúng in vitro và in vivo”, (Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52, số 4). Kết
quả nhận được cho thấy có 31 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ khuẩn phân lập đối
kháng nấm F.oxysporum, tất cả 37 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn ức chế
sinh trưởng của F.sonali, 10 chủng vi khuẩn và 6 chủng xạ khuẩn đối kháng với
Phytophthora sp.
24


- Năm 2015, Nguyễn Thị Thu Thủy và cộng sự đã nghiên cứu đề tài
“Đánh giá tính đa dạng và hoạt tính sinh học của xạ khuẩn ở rừng ngập mặn
Xuân Thủy - Nam Định”, (Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh thái và tài
nguyên sinh vật lần thứ 6, 2015).
- Năm 2015, Nguyễn Thị Thúy Nga đã thực hiện nghiên cứu “Phân lập,
tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nội sinh tạo chất kích thích sinh trưởng
Indole - 3 - acetic acid (IAA) và đối kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ cây thông”,
(Tạp chí Khoa học Lâm Nghiệp, tr. 3948 - 3959). Kết quả đã xác định được loài
Bacillus subtilis đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thông.

CHƯƠNG II
MỤC TIÊU – NỘI DUNG – ĐỐI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU