LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn
sâu sắc tới TS. Ngô Tất Trung – Khoa Sinh học phân tử và TS. Đinh Nho Thái – Bộ
môn Di truyền học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi
thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Hữu Song, TS. Bs. Phan Quốc Hoàn
đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện
Trung ương quân đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện
Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và lãnh
đạo Khoa đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,
giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày

tháng

năm 2015

Học viên

Đào Thanh Quyên


MỤC LỤC
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết ở ngƣời ...................................................... Error! Bookmark not defined.


2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................... Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm .................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.2. Các máy và thiết bị chính ................................ Error! Bookmark not defined.
2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu .............................................. Error! Bookmark not defined.

2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồiError! Bookmark not defined

2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứuError! Bookmark not def
2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm ......... Error! Bookmark not defined.

2.4.5. Phƣơng pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổError! Bookm
2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi ......................... Error! Bookmark not defined.
2.4.8. Giải trình tự gen.............................................. Error! Bookmark not defined.
2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồiError! Bookmark not defined.
2.4.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng toán thống kêError! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................ Error! Bookmark not defined.
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT
HIỆN VI KHUẨN......................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh..... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻError! Bookmark not defined.
3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh ........... Error! Bookmark not defined.
3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ
Enterobacteriaceae.................................................... Error! Bookmark not defined.

3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn SalmonellaError! Bookma
3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
pneumoniae................................................................ Error! Bookmark not defined.

3.1.3.4. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilisError! Bookmark

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................... Error! Bookmark not defined.
KIẾN NGHỊ .................................................................. Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC


DANH MỤC HÌNH
Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR . Error! Bookmark not defined.

Hình 2. Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ƣu hóa PCR đa mồiError! Bookmark not d

Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phƣơng pháp loại bỏ ADN ngƣờiError! Bookmark not d

Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnhError! Book
Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn
gây bệnh .................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình.6.Kết quả PCR các mồi đơn trên ADN mẫu đƣợc tách chiết từ mẫu chuẩn
dƣơng trong điều kiện PCR chuẩn ............................ Error! Bookmark not defined.
Hình.7. Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trƣng cho họ
Enterobacteriaceae ................................................... Error! Bookmark not defined.

Hình 8. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn Salmonella spError! Bookmark

Hình 9. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn K. pneumoniaeError! Bookmar

Hình 10. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn Proteus mirabilisError! Bookm

Hình 11. Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trƣng cho vi khuẩn E. coliError! Bookmar
Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội
chuẩn ......................................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng8: Hàm lƣợng và chất lƣợng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn
E.coli ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 9. Kết quả đo OD các ADN tách chiết từ mẫu máu có vi khuẩn sử dụng các
phƣơng pháp tách chiết ............................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 10. So sánh kết quả nuôi cấy và PCR đa mồi trên mẫu nhiễm khuẩn
huyết…………………………………………………………………………………..
53


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid deoxyribonucleic

aldA

Aldehyde dehydrogenase A

Bộ mồi EPKS

Gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E. coli, Proteus
mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella. sp

bp

base pair

dNTP


MCLB1

Manmanlian cellular lysis Buffer 1

NKH

Nhiễm khuẩn huyết

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

Pol

polymerase

SD

Standard Deviation

Se

Độ nhạy

Sp


Phạm Hùng Vân, T P Bình, K T L Anh et al. (2008), "Nghiên cứu đa trung tâm
khảo sát tình hình đề kháng các kháng sinh của các trực khuẩn gram âm dễ mọc
gây nhiễm khuẩn bệnh viện phân lập từ 1/ 2007 – 5/ 2008", Tạp chí Y học TP Hồ
Chí Minh.
Tiếng Anh
8.
Bekal S., Brousseau R., Masson L. et al. (2003), "Rapid identification of
Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA microarrays",
J Clin Microbiol, 41(5), pp. 2113-25.
9.
Bloos F., Sachse S., Kortgen A. et al. (2012), "Evaluation of a polymerase chain
reaction assay for pathogen detection in septic patients under routine condition:
an observational study", PLoS One, 7(9), pp. e46003.
10.
Chamberlain J. S., Gibbs R. A., Ranier J. E. et al. (1988), "Deletion screening of
the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification",
Nucleic Acids Res, 16(23), pp. 11141-56.
11.
Chen, J.Zhang, L.Paoli et al. (2010), "A real-time PCR method for the detection
of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by
comparative genomic analysis", Int J Food Microbiol, 137(2-3), pp. 168-74.
12.
Deen J., von Seidlein L., Andersen F. et al. (2012), "Community-acquired
bacterial bloodstream infections in developing countries in south and southeast
Asia: a systematic review", Lancet Infect Dis, 12(6), pp. 480-7.
13.
Feng P., Lum R., Chang G. W. (1991), "Identification of uidA gene sequences in
beta-D-glucuronidase-negative Escherichia coli", Appl Environ Microbiol, 57(1),
pp. 320-3.
14.

28.

Gosiewski T1, Jurkiewicz-Badacz D, Sroka A et al. (2014 ), "A novel, nested,
multiplex, real-time PCR for detection of bacteria and fungi in blood", BMC
Microbiol., 14(1), pp. 144.
Hansen W. L., Bruggeman C. A., Wolffs P. F. (2009), "Evaluation of new
preanalysis sample treatment tools and DNA isolation protocols to improve
bacterial pathogen detection in whole blood", J Clin Microbiol, 47(8), pp. 262931.
Hartman L. J., Selby E. B., Whitehouse C. A. et al. (2009), "Rapid real-time PCR
assays for detection of Klebsiella pneumoniae with the rmpA or magA genes
associated with the hypermucoviscosity phenotype: screening of nonhuman
primates", J Mol Diagn, 11(5), pp. 464-71.
Heimer S. R., and H. L. T. Mobley., (2001), "Interaction of Proteus mirabilis
urease apoenzyme and accessory proteins identified with yeast two-hybrid
technology.", J. Bacteriol, 183, pp. 1423–1433.
Hein I., Flekna G., Krassnig M. et al. (2006), "Real-time PCR for the detection of
Salmonella spp. in food: An alternative approach to a conventional PCR system
suggested by the FOOD-PCR project", J Microbiol Methods, 66(3), pp. 538-47.
Hossein Fazzeli, Mohammad Reza Arabestani, Bahram Nasr Esfahani F. K. et al.
(2012), "Development of PCR-based method for detection of Enterobacteriaceae
in septicemia", J Res Med Sci, 17(7), pp. 671-675.
Houck P. M., Bratzler D. W., Nsa W. et al. (2004), "Timing of antibiotic
administration and outcomes for Medicare patients hospitalized with communityacquired pneumonia", Arch Intern Med, 164(6), pp. 637-44.
Island M. D., Mobley H. L. (1995), "Proteus mirabilis urease: operon fusion and
linker insertion analysis of ure gene organization, regulation, and function", J
Bacteriol, 177(19), pp. 5653-60.
J. Vandepitte and J. Verhaegen, K. Engbaek, P. Rohner et al. (2003), Basis
laboratory proceduce in clinical bacteriology 2nd edition edn.: World Health
Organization.
Jonathan D. Dattelbaum C. V. L., 2 David E. Johnson,2,3, Mobley1* a. H. L. T. (

38.
39.

40.

41.

MariaC.Rivera. J. L. (2014), "The ring of life provides evidence for a genome
fusion origin of eukaryotes", Clin Microbiol, 52(4), pp. 1168-76.
Martin GS M. D., Eaton S, Moss M, (2003), "The epidemiology of sepsis in the
United States from 1979 through 2000", N Engl J Med, 348, pp. 1546–1554.
McCann C. D., Jordan J. A. (2014), "Evaluation of MolYsis Complete5 DNA
extraction method for detecting Staphylococcus aureus DNA from whole blood
in a sepsis model using PCR/pyrosequencing", J Microbiol Methods, 99, pp. 1-7.
Park D. W., Chun B. C., Kim J. M. et al. (2012), "Epidemiological and clinical
characteristics of community-acquired severe sepsis and septic shock: a
prospective observational study in 12 university hospitals in Korea", J Korean
Med Sci, 27(11), pp. 1308-14.
Pletz M. W., N. Wellinghausen, et al. (2011), "Will polymerase chain reaction
(PCR)-based diagnostics improve outcome in septic patients? A clinical view",
Intensive Care Med 37(7), pp. 1069-76.
Poore C. A., Coker C., Dattelbaum J. D. et al. (2001), "Identification of the
domains of UreR, an AraC-like transcriptional regulator of the urease gene
cluster in Proteus mirabilis", J Bacteriol, 183(15), pp. 4526-35.
Poore C. A., Mobley H. L. (2003), "Differential regulation of the Proteus
mirabilis urease gene cluster by UreR and H-NS", Microbiology, 149(Pt 12), pp.
3383-94.
Sambrook J. F. E. F., Maniatis T., (1989), Molecular cloning I-III. A Laboratory
Mannual London, UK: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Samuel Baron ( 1996), Medical Microbiology. 4th edition edn. University of