VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES SP. SINH TỔNG HỢP AMINOETHYOXY
VINYLGLYCINE (AVG) CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP
ETYLEN TRONG QUẢ TƯƠI

Giáo viên hướng dẫn

: ThS.Nguyễn Văn Nguyện

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Trang

Lớp

: CNSH 12-01

HÀ NỘI - 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

hiện đề tài.
Tiếp theo em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo khoa
Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ em trong suốt 4 năm học vừa qua đồng thời cũng tạo điều kiện cho em
được thực tập và bảo vệ một cách tốt nhất.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người
đã động viên , giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có được kết quả
như ngày hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Trang


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

vi

1.2.2.

Cơ chế hình thành ethylen

5

1.2.3

Vai trò của ethylene đối với sự chín của quả

6

1.2.4

Cơ chế ức chế sinh tổng hợp etylen trong quả tươi của AVG.

6

1.3.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG AVG TRÊN THẾ

7

GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.3.1.

Các nghiên cứu ứng dụng AVG trên thế giới

1.3.2.

1.4.4.

Các phương pháp phân tích AVG sinh tổng hợp từ xạ khuẩn

14

Streptomyces
1.4.5

Các phương pháp bảo quản chủng giống

SV: Nguyễn Thị Trang

i

17

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

II.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20


2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.2.1.

Phân lập xạ khuẩn Streptomyces

22

2.2.2.

Đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh tổng hợp AVG của chủng

23

Streptomyces bằng phương pháp khuếch tán thạch.
2.2.3.

Phương pháp đánh giá khả năng sinh tổng hợp AVG của các

24

chủng Streptomyces sp
2.2.4.

Các phương pháp bảo quản chủng giống ở nhiệt độ thấp


Phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.

30

3.2.

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp AVG của các chủng xạ

36

khuẩn Streptomyces sp. phân lập.
3.3.

Đánh giá tính ổn định trong sinh tổng hợp AVG của các

37

chủng Streptomyces tuyển chọn được
3.3.1.

Đánh giá tính ổn định của các chủng Streptomyces sp. đã lựa

38

chọn trong sinh tổng hợp AVG qua cấy truyền và lên men.

SV: Nguyễn Thị Trang

ii



43

IV.

KẾT LUẬN

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

50

PHỤ LỤC

52

SV: Nguyễn Thị Trang

iii

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AVG


CA

Controlled Atmosphere

ISP

International Streptomyces Project

SV: Nguyễn Thị Trang

iv

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội
DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.

Các thông số so sánh về chất lượng của cam tiêu sau

9

24h
Bảng 3.1.



S1 với chủng Streptomyces canarius
Bảng 3.6.

Đặc điểm khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp. S6

44

Bảng 3.7.

Khả năng tạo sắc tố trên các môi trường khác nhau của

44

chủng Streptomyces sp. S6
Bảng 3.8.

Khả năng đồng hóa nguồn C của chủng xạ khuẩn

45

Streptomyces sp. S6
Bảng 3.9.

So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces sp.

46

S6 với chủng Streptomyces luteogriseus



Hình 1.4.

Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

10

Hình 1.5.

Hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử chủng xạ khuẩn

12

HLD 3.16
Hình 1.6.

Màu sắc khuẩn lạc một số loại xạ khuẩn

13

Hình 1.7.

Sơ đồ mô tả con đường sinh tổng hợp AVG trong xạ

14

khuẩn
Hình 1.8.

Bình sắc ký lớp mỏng

Hình 3.4.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

33

amylovora (b) của chủng Streptomyces S4
Hình 3.5.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

33

amylovora (b) của chủng Streptomyces S5
Hình 3.6.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

34

amylovora (b) của chủng Streptomyces S6
Hình 3.7.

Khuẩn lạc (a) và khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia

35

amylovora (b) của chủng Streptomyces S7

SV: Nguyễn Thị Trang


39

Hình 3.12. Chuỗi bào tử và bào tử chủng Streptomyces sp. S6

43

PHỤ LỤC

51

Hình 1

Tách khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn đã phân lập

51

Hình 2

Bộ chủng giống Streptomyces sp

51

Hình 3

Định tính sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces

52

sp. S6 bằng sắc kí bản mỏng (TLC)

hãm được sự chín, hỏng của rau quả.
Trước thực trạng trên, các nhà khoa học Việt Nam đã và đang rất tích
cực nghiên cứu để làm chậm tiến trình chín của trái cây giúp nhà trồng trọt có
thể chủ động trong tiêu thụ nông sản và đảm bảo cho người tiêu dùng sử dụng
những trái cây tươi có giá trị dinh dưỡng. Vì những mục tiêu đó, một số chế
phẩm làm chậm chín quả đã được nghiên cứu và ứng dụng.
Trong các chế phẩm để kéo dài thời gian thu hoạch, chế phẩm RetainAVG (Aminoethoxyvinylglycine) hiện được thế giới ứng dụng rộng rãi và rất
được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm. Retain - AVG là một chất điều
hoà sinh trưởng thực vật, có chứa 15% thành phần hoạt động đó là AVG có
nguồn gốc sinh tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces. Retain - AVG là một hợp
chất có tác dụng ức chế một cách hoàn toàn hoạt động của enzym ACCsynthetaza, là enzym giữ vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá trình hình
thành ethylene. Retain được biết đến là một chất có khả năng ức chế khả năng
sinh ethylene trong tế bào, làm trì hoãn quá trình chín của quả, duy trì được
hương thơm của quả trong quá trình bảo quản.
Retain giúp kéo dài mùa vụ thu hoạch, có tác dụng làm quả cứng, thịt
quả mọng nước, mùi vị tự nhiên, cải thiện màu sắc vỏ quả, chống nứt quả,
không gây hại cho côn trùng có ích. Hiệu quả của AVG trong kéo dài thời gian
thu hoạch quả tươi đã được chứng minh, tuy nhiên, các chế phẩm AVG đều
phải nhập khẩu từ Úc, Mỹ… mà chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu
để sản xuất chế phẩm AVG. Để chủ động trong kéo dài thời gian thu hoạch quả
SV: Nguyễn Thị Trang

1

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TỔNG QUAN VỀ AVG
AVG (Aminoethyoxyl vinylglycine) có tên khoa học là L-trans-2-amino4-(2 acetamidoethoxy)-3-butenoic acid, thuộc nhóm hợp chất tự nhiên
vinylglycine được sản xuất bởi một số vi khuẩn đất như Streptomyces sp,
Pseudomonas aeruginosa (Ruan X. cộng sự, 1993).
AVG (L-trans-2-amino-4-(2 acetamidoethoxy)-3-butenoic acid) là
amino acid thu được trong quá trình lên men chủng vi khuẩn Streptomyces được
phát hiện đầu tiên bởi nhà khoa học Hoffman LaRoche Inc., Nutley,NJ. và được
công bố chính thức trên US Patent 3,751,459 năm 1973 nhờ khả năng kháng
mạnh mẽ nhiều vi sinh vật gây hại như Escherichia coli (gây bệnh đường ruột
nghiêm trọng), Bacillus simplex, Staphylococcus aureus, Streptomyces
cellulosae, Bacillus cereus, với nồng độ rất thấp (mM) [1], Erwinia amylovora
[2]. Như vậy, ngay từ lúc được phát hiện, AVG đã chứng tỏ được khả năng ứng
dụng rất cần thiết cho bảo vệ sức khỏe con người và cây trồng.

Hình 1.1. Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh cháy lá
Erwinia amylovora [2]
Nhiều nghiên cứu trong suốt hơn 20 năm sau đó với AVG được thực hiện
ở nhiều trường đại học và các nhà nghiên cứu ngành công nghiệp ở mức độ
phân tử cho thấy tác động đặc biệt của AVG đối với sinh lý của các mô thực
vật (Boller, et al, 1979; .. Yu, et al, 1979). Ngoài khả năng kháng nhiều vi sinh
SV: Nguyễn Thị Trang


Ethylene là một hydrocacbon dạng khí có cấu tạo hóa học C2H4 và khối
lượng phân tử 28.5 đơn vị Cacbon. Ethylene được sinh ra từ rất nhiều nguồn
khác nhau trong tự nhiên như khí thải từ các động cơ đốt trong, bếp lò, khói
thuốc, khí ga rò rỉ và các cơ quan thực vật. Ethylene không chỉ được coi là
hormon của sự chín mà còn đóng vai trò quan trọng trong những hoạt động sinh
lý khác của thực vật như quá trình nở của hoa, sự rụng lá hoặc các bộ phận thực
vật khác, sự biến màu của sắc tố chlorophyll [3].Trong thực vật tồn tại hai hệ
thống sản sinh ethylene. Hệ thống thứ nhất hoạt động trong suốt quá trình sinh
SV: Nguyễn Thị Trang

4

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Hệ thống thứ hai mặc dù được
khởi động bởi hệ thống thứ nhất nhưng chỉ hoạt động trong quá trình chín của
quả và quá trình già hóa của các bộ phận thực vật. Hệ thống thứ nhất có cơ chế
tự ức chế, nghĩa là ethylene ngoại sinh có thể kìm hãm quá trình tổng hợp
ethylene. Ngược lại, hệ thống thứ hai lại bị kích thích bởi ethylene và vì vậy có
cơ chế tự xúc tác sự tổng hợp ethylene ở giai đoạn chín.

Hình 1.2. Con đường hình thành ethylene trong thực vật
(S.F.Yang và cộng sự , 1984)
Cơ chế hình thành ethylen
Đường hướng sinh tổng hợp ethylene trong thực vật đã được S.F.Yang

tế bào), dẫn đến giải phóng các enzym vốn tách rời với cơ chất do màng ngăn
cách. Các enzym này có điều kiện tiếp xúc với cơ chất và gây ra các phản ứng
có liên quan đến quá trình chín và các quá trình sinh lý, sinh hoá khác của quả.
Cơ chế ức chế sinh tổng hợp etylen trong quả tươi của AVG.
Aminoethoxyvinylglycine(AVG) là tương tự như Vinyl Glycine có công
thức hóa học [NH2–CH2–CH2–OC=CH–CH–(NH2)–COOH], AVG là một
trong nhóm chất ức chế hoạt động hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong
những năm gần đây. Mặc dù có tính chất tương tự như vinyl glycine nhưng nó
lại là một chất ức chế ngược của ACS. AVG được sử dụng với tên thương mại
là Retain.
Những kết quả này chỉ ra rằng AVG ức chế việc chuyển đổi của SAM
thành ACC. Việc chuyển đổi từ SAM để ACC được xúc tác bởi ACC synthase
(ACS), các enzyme thứ hai trong lộ trình sinh tổng hợp ethylene từ methionine
(Arshad và Frankenberger, năm 2002); Konze và Kwiatowski, 1981). ACS đòi
hỏi pyridoxal phosphate cho hoạt động và rất nhạy cảm với pyridoxal
phosphate chất ức chế như AVG (McKeon và Yang, 1987). Theo Adams và
Yang (1979) ACS xúc tác sự hình thành của ACC và MTA từ SAM của một α,
γ-loại bỏ cơ chế phản ứng. Khi SAM trải qua một β, γ-loại bỏ phản ứng nó tạo
SV: Nguyễn Thị Trang

6

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

một dẫn xuất vinylglycine và kết quả ankyl hóa không thể phục hồi bất hoạt

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Australia. Retain được phun vào thời điểm 7-14 ngày trước khi thu hoạch với
liều lượng 830 g trong 1.000-1.500 lít nước / ha (554-830 ppm AVG). Kết quả
cho thấy Retain làm chậm biến đổi màu 3-6 ngày đối với đào không xử lý,
ngoài ra kích thước và trọng lượng quả tăng 7.5% và độ cứng của thịt quả cao
hơn 7-58% so với mỗi đối chứng.
Robinson và cs đã sử dụng AVG xử lý trên 2 giống táo “McIntosh”
/M.26 tại 2 và 4 tuần trước khi thu hoạch. Kết quả cho thấy việc sử dụng AVG
trước khi thu hoạch 2 tuần làm giảm khả năng sinh ethylene, tăng độ cứng và
cải thiện màu sắc hơn với mẫu đối chứng [6].
AVG được sử dụng ở nồng độ 125ppm cho các loại cây táo (unbagged)
ở 3-4 tuần trước khi thu hoạch thương mại làm giảm khả năng sản xuất ethylene
kết quả là quả chín chậm và giảm rụng quả trước thu hoạch (giảm trung bình
từ 58.9% xuống 10.4%), tinh bột biến đổi chậm và giảm sản xuất ethylene [7].
Hai giống táo “Royal Gala” và “Imperial Gala” ở vườn cây ăn trái tại ở
miền Nam Brazil được xử lý AVG với hàm lượng 120g /ha ở thời điểm 4 tuần
trước khi thu hoạch. Quả được thu hoạch từ 5 đến 7 ngày, bắt đầu từ 2-3 tuần
trước khi thu hoạch, sau đó mẫu được xử lý 1μl/l (1-MCP) vào ngày thu hoạch,
và được lưu trữ cho 3.5 và 7 tháng trong không khí (0.5°C), hoặc trong khí
quyển kiểm soát (CA, 1.5 kPa O2 + 2.5 kPa CO2 ở mức 0.5°C).
Kết quả cho thấy việc xử lý bằng AVG làm chậm quá trình chín trên cây
như giảm hàm lượng ethylene, tăng độ cứng, màu sắc vỏ quả so với mẫu đối
chứng không xử lý AVG và AVG có tác dụng tốt khi xử lý kết hợp với 1- MCP
[8]

không sử dụng AVG.
Bảng 1.1. Các thông số so sánh về chất lượng của cam tiêu sau 24h [10].
Các thông số

Sử dụng AVG

Không sử dụng AVG

Cường độ hô hấp

5,02 mlCO2/kg.h

13,47 mlCO2/kg.h

Độ cứng

38,13 N/cm2

4,65 N/cm2

Hàm lượng đường tổng

2,98%

18,13%

Hàm lượng acid tổng

0,29%


Hình 1.4. Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa và phân loại của xạ khuẩn theo
ISP.
1.4.2.1. Đặc điểm hình thái.
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và
Henrici đặt tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các
đại diện này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh. Đường
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính
khoảng 1-5mm.
Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc
thường được phủ bởi khuẩn ty khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi
có tính kị nước.Khuẩn lạc tạo thành từng cụm, bề mặt khô ráp, xù xì, dạng
phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ.
- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
SV: Nguyễn Thị Trang

10

Lớp: CNSH 1201


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

- Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hòa tan
trong nước, có sắc tố chỉ hòa tan trong dung môi hữu cơ.
- Khuẩn ty cơ chất mọc trong môi trường nuôi cấy, không phân cách trong
suốt quá trình phát triển.
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài trong


Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường
kình khoảng 1,5µm. Màng bào tử có thể nhẵn gai, khối u, nếp nhăn... tùy thuộc
vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử biểu
hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác
nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi
cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn
(ISP) đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm
vi sinh vật này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25300C, pH tối ưu 6,5-8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc
thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh
ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật.
Cho đến nay, để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân
loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [11,
12. 13, 14].

Hình 1.5. Hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử chủng xạ khuẩn HLD 3.16

SV: Nguyễn Thị Trang

12

Lớp: CNSH 1201



Khoá luận tốt nghiệp

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Hình 1.7. Sơ đồ mô tả con đường sinh tổng hợp AVG trong xạ khuẩn
Streptomyces NRRL 5331 (Mosnica Fernández và cộng sự, 2002)
Các phương pháp phân tích AVG sinh tổng hợp từ xạ khuẩn
Streptomyces
1.4.4.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography),
dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn
hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ
như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều,
phủ lên nền phẳng nhưtấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu
được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp
mỏng.
 Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp
đậy.
 Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu
(silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm

SV: Nguyễn Thị Trang

14

Lớp: CNSH 1201