BỘ NÔNG NGHIỆP

VIỆN NGHIÊN CỨU

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC
THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ
CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP
HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Cơ quan chủ trì đề tài:

Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Chủ nhiệm đề tài/dự án: ThS. Cao Thành Trung

TP.HCM – 2014


BỘ NÔNG NGHIỆP

TP.HCM - 2014


MỞ ĐẦU
Ngành nuôi trồng thủy sản có vai trò hết sức quan trọng trong việc phát triển
nền kinh tế của đất nước. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có điều kiện tự
nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm thủy sản. Vài năm trở lại đây, các
tỉnh trong khu vực này phát triển khá nhanh nghề nuôi tôm thủy sản. Tuy nhiên,
ngoài những giá trị kinh tế mang lại ngành nuôi tôm còn phải đối mặt với nhiều
thách thức và rủi ro như dịch bệnh do vi sinh vật gây ra như vi nấm, vi khuẩn và
virus. Đặc biệt phải kể đến các bệnh trên tôm do virus gây ra đang là một trở ngại
lớn cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm trên thế giới cũng như Việt Nam
nói riêng.
Trong vài thập niên qua, bệnh do virus gây ra lúc đầu chỉ có 6 virus (năm
1989) được biết đến nhưng chỉ trong vài năm sau đó đã có hơn 20 virus (năm 1997)
được phát hiện (Hernández-Rodríguez và ctv., 2001), trong đó có thể kể đến bệnh
đốm trắng do WSSV gây thiệt hại nặng nề đối với nghề nuôi tôm sú Penaeus
monodon thì virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô
(IHHNV) lại gây thiệt hại to lớn cho nghề nuôi tôm Penaeus (Litopenaeus)
stylirostris với tỉ lệ tử vong lên tới 90% (Lightner, 1983). Kể từ khi IHHNV được
phát hiện ở Hawaii vào năm 1981, virus này đã lan truyền nhanh chóng và đã được
ghi nhận ở nhiều khu vực khác nhau. Với nhiều mức độ thiệt hại do IHHNV gây ra
đã được báo cáo từ nhiều trang trại nuôi tôm ở nhiều khu vực trên thế giới. Bằng
chứng cho thấy mức độ thiệt hại do virus gây ra ước tính khoảng 8,5 tỷ USD thì
riêng thiệt hại do IHHNV gây ra ước tính khoảng 0,5 – 1 tỷ USD (Lightner, 2005).
Trước những ảnh hưởng và thiệt hại do IHHNV gây ra trên các trang trại tôm,
nó đã được liệt vào danh mục vào những virus gây bệnh nguy hiểm trên tôm vào
năm 2000 của Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationnal des Epizooties - OIE)
(Lightner và ctv., 1997; OIE, 2009). Hơn nữa, Chương trình trang trại nuôi tôm
nước mặn của Hoa Kỳ (UMSFP) cũng công bố IHHNV là một trong những tác

nuôi, cũng như số lượng trứng được đẻ và tỷ lệ nở trứng từ tôm mẹ nhiễm hay
không nhiễm cũng như sản lượng nuôi (Withyachumnarnkul và ctv., 2006; Flegel,
1997).
Sự lan truyền của virus này còn được nhiều nghiên cứu cho rằng chúng có thể
lan truyền theo cả trục dọc lẫn trục ngang, do đó mức độ lây nhiễm của virus này

2


trở nên nhanh chóng. Sự lan truyền theo trục dọc là khả năng truyền bệnh từ bố mẹ
mang mầm bệnh và truyền cho thế hệ sau của chúng (Mottle và ctv., 2003), trong
khi đó lan truyền theo trục ngang do tập tính ăn thịt lẫn nhau hay do nguồn nước bị
nhiễm (Lightner và ctv., 1983a,b). Mặc dù, có nhiều nghiên cứu về sự lan truyền
theo trục dọc cũng như theo trục ngang của IHHNV ở các loài tôm he như P.
stylirostris, P. vannamei nhưng có rất ít nghiên cứu về sự lan truyền của IHHNV
trên tôm sú Penaeus monodon.
Ở Việt Nam tôm nhiễm virus xảy ra hàng năm và IHHNV đã xuất hiện trên
tôm nuôi Việt Nam, chủ yếu lây nhiễm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Khảo sát
trên 307 mẫu tôm sú thu từ miền Trung, tây Nam Bộ và Đông Nam Bộ cho thấy có
đến 52% mẫu nghiên cứu nhiễm các type IHHNV khác nhau (Hùng và ctv., 2009).
Trong khi đó những hiểu biết về virus này trên tôm sú ở Việt Nam không nhiều do
có ít nghiên cứu về IHHNV mặc dù những hậu quả tiêu cực do loại vius này gây ra
cho ngành công nghiệp nuôi tôm đã được cảnh báo trên toàn thế giới. Chỉ có một
vài tổ chức chỉ tập trung ứng dụng các qui trình chẩn đoán PCR đã được OIE công
bố để phát triển các kít thương mại để chẩn đoán virus. Một nghiên cứu mới đây của
Hùng và ctv. (2009) cho thấy trình tự chủng IHHNV này có quan hệ rất gần với các
chủng IHHNV ở Đài Loan (AY 355307) và Thái Lan. Chưa có một nghiên cứu nào
về sự lây nhiễm IHHNV trên tôm sú bằng cách cho ăn hay sống chung với tôm
bệnh, như lây nhiễm từ mẹ sang con, hay lây nhiễm giữa các cá thể tôm mang
IHHNV và cá thể trong một quần đàn. Cũng như đánh giá sự hiện diện của chúng

được 656.425 ha tôm nước lợ thì trong đó diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha.
Trong nhiều năm tôm sú được xem là giống chính giúp đưa Việt Nam vào danh
sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới. Năm 2011, tôm sú vẫn giữ
vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam với tổng giá trị xuất khẩu tôm
trong năm 2011 đạt 2,396 tỷ USD thì trong đó xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ
USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị.
Phần lớn diện tích nuôi tôm và sản lượng tôm tập trung từ Nam Bộ đặc biệt là
một số tỉnh ở ĐBSCL có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi
tôm he. Theo điều tra của Tổng cục Thủy sản Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông
4


thôn (2011), tổng diện tích thả nuôi tôm là 602.416 ha chiếm 91,8 % diện tích nuôi
tôm của cả nước, trong đó có diện tích nuôi tôm sú đã lên tới 588.419 ha. Các tỉnh
có diện tích nuôi tôm lớn như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng,
Kiên Giang…
2.1.2 Tình hình dịch bệnh
Mặc dù ngành nuôi tôm mang lại nhiều thuận lợi về kinh tế và xã hội nhưng
cũng gặp phải nhiều khó khăn và thách thức cho ngành. Đó là tình hình dịch bệnh
do vi sinh vật gây ra, đặc biệt là virus trên tôm diễn biến rất phức tạp và khó lường.
Tình hình gia tăng nhanh về diện tích nuôi trồng kéo theo những vấn đề xử lý ao
nuôi, nguồn nước đặc biệt là con giống đầu vào không được kiểm soát chặt chẽ dẫn
đến dịch bệnh trên tôm thường xảy ra thường xuyên. Những dẫn chứng cụ thể từ
năm 1999 đến năm 2003, dịch bệnh tràn lan và bùng phát mạnh làm nhiều diện tích
nuôi tôm mất trắng do tôm chết hàng loạt. Do đó, nó gây ra nhiều thiệt hại to lớn về
tài sản và kinh tế của người nuôi. Qua những nghiên cứu và tìm hiểu cho thấy các
tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi đều có nguồn gốc từ virus.
Các bệnh do virus gây ra và dẫn đến nhiều thiệt hại nặng nề về kinh tế cho
ngành nuôi tôm thâm canh phải kể đến như bệnh hoại tử gan tụy do
Hepatopancreatic Parvovirus (HPV), bệnh còi do Monodon Baculovirus (MBV),

đốt ngực và vùng bụng ở tôm thẻ chân trắng và được gọi là hội chứng dị dạng còi
cọc (Runt-deformity Syndrome, RDS). Tác động IHHNV lên tôm thẻ gây ảnh
hưởng về giá trị thương mại do tôm chậm lớn, có kích thước nhỏ, biến dạng vỏ kitin
mặc dù IHHNV không gây chết nghiêm trọng khi tôm nhiễm virus.
Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan thành lập biểu mô là một trong
những bệnh do virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm. Virus này khi xâm nhiễm
vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Tôm nuôi ở giai đoạn
postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm nhiễm virus này
có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi nước, xoay tròn và chết từ từ trong 2 – 3 tuần. Các loài
tôm khác nhau khi nhiễm bệnh thì có dấu hiệu khác nhau. Loài P. monodon, những
con nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ và hệ cơ vân ở phần bụng có thể bị
mờ đục, chậm lớn (Rai và ctv., 2009). Loài P. vannamei, khi bị bệnh ở dạng mãn
tính và thể hiện một số đặc điểm như còi cọc, dị dạng, như chùy đầu sẽ bị uốn cong
hoặc bị dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị sùi. Tôm kém ăn dẫn đến phân

6


đàn cao. Loài P. stylirostris, nếu bị nhiễm ở cấp tính có thể gây chết tôm ở giai đoạn
ấu niên, ấu trùng và hậu ấu trùng có thể đã nhiễm bệnh nhưng không phát bệnh, sau
35 ngày trở đi bệnh mới bộc phát. Ở mức độ nặng thì tôm sẻ kém ăn, có sự thay đổi
về trạng thái và diện mạo, tôm bơi lội chậm chạp và chết sau vài giờ, xuất hiện các
vùng trắng hay vàng sẫm ở lớp biểu bì kitin, đặc biệt là ở các khớp nối làm cơ thể
tôm xuất hiện các vùng vằn vện (Lightner và Bell, 1984).
2.3. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious
hypothermal and hemotopoietic necrosis virus – IHHNV)
2.3.1. Tên khoa học và phân loại
Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) là
virus có kích thước nhỏ nhất được phát hiện lần đầu tiên trên tôm Penaeus
(Litopenaeus) stylirostris. Do đó, IHHNV còn có tên khoa học là PstDNV (Penaeus

nucleotide 56 tính theo chiều ngược và có đoạn chồng lấp trình tự với ORF1, có
kích thước 1092 nt, có khả năng mã hóa cho vùng N – terminal của một chuỗi
peptide mang 343 a.a và được gọi là protein không cấu trúc 2 (NS2). Cuối cùng,
ORF bên phải (ORF3) cũng chồng lấp trình tự với ORF2 (56 nucleotide), có kích
thước 990 nt và có thể mã hóa cho một chuỗi peptide chứa 329 a.a (Dhar và ctv.,
2007; Nunan và ctv, 2000, Shike và ctv, 2000). Bằng phân tích SDS-PAGE có ít
nhất bốn protein cấu trúc khác nhau được phát hiện từ thể virus IHHNV tinh sạch
và chúng có trọng lượng phân tử 74, 47, 39 và 37,5 kD (Bonami và ctv., 1990; Mari
và ctv., 1993). Trong đó protein có kích thước 47 kD đã được xác định là có nguồn
gốc từ ORF3.
2.3.3. Sự đa dạng di truyền của IHHVN
2.3.3.1 Phân loại kiểu gen
Cho đến nay, có rất nhiều bộ gen hoàn chỉnh của chủng IHHNV khác nhau đã
được giải trình tự và mô tả chi tiết. Bao gồm một số chủng như Hawaii ở Mỹ (trên
Genbank có kí hiệu AF218266) có kích thước 3909 bp; Ấn Độ (GQ411199) có kích
thước 3908 bp (Rai và ctv., 2011); Hàn Quốc (JN377975) có kích thước 3914 bp
(Kim và ctv., 2011) và Trung Quốc (EF633688) có kích thước 3833 bp và cùng một

8


số chủng IHHNV có trên GenBank như từ Mexico (AF273215), Đài Loan
(AY355307, AY355306 và AY355308); Thái Lan (AY362547 và AY102034); Việt
Nam (JN616415); Ecuador (AY362548) và Úc (GQ475529). Qua những nghiên
cứu trên vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều nơi trên thế giới
cho thấy có ít nhất bốn kiểu gen (type) IHHNV bao gồm: kiểu gen 1 có nguồn gốc
từ Châu Mỹ, Đông Á (chủ yếu là Phillippines), kiểu gen 2 có nguồn gốc từ Đông
Nam Á và hai kiểu gene này là kiểu gen lây nhiễm. Những thí nghiệm lây nhiễm đã
chứng minh kiểu gen 1 và 2 có khả năng lây nhiễm từ vật chủ này sang vật chủ
khác, đại diện là tôm thẻ chân trắng P. vannamei và hoặc tôm sú P. monodon

IHHNV từ tôm nuôi ở Mỹ là có nguồn gốc từ Philippine thông qua việc nhập khẩu
tôm P. monodon như là loài thủy sản nuôi trong thập niên 1970 của các trang trại
nuôi tôm (Lightner, 1996; Tang và ctv., 2003). Một vài nghiên cứu trước kia cho
thấy, IHHNV trên P. stylirostris và P. vannamei từ Tây bán cầu đã chứng minh bộ
gen IHHNV rất ổn định và sự phát triển giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ đã ổn
định hơn (Tang và Lightner, 2002). Mặt khác, dựa trên phân tích sự đa dạng trình tự
bộ gen IHHNV mã hóa vùng protein không cấu trúc và vỏ capsid (trình tự
nucleotide có kích thước 2,9 kb của IHHNV chứa đựng 3 ORF), cho thấy sự khác
biệt trình tự thấp (ít hơn 0,5 % trình tự nucleotide khác biệt) được tìm thấy trong 14
chủng phân lập từ Hawaii và châu Mỹ từ năm 1982 đến 1997. Thậm chí không có
sự mất đi hay thêm vào trong vùng này của bộ gen virus. Sự thay đổi của 30
nucleotide được ghi nhận thì chỉ có 15 nucleotide thay đổi dẫn đến sự thay đổi của
các a.a (7 ở ORF1, 1 ở ORF2 và 7 ở ORF 3) nhưng không có sự liên hệ giữa sự thay
đổi và động lực virus (Tang và Lightner, 2002). Tuy nhiên, trái ngược với báo cáo
của Tang và Lighter (2002), một nghiên cứu gần đây cho thấy sự đa dạng di truyền
của IHHNV còn cao hơn nữa và ước tính tỉ lệ thay đổi nucleotide ở những chủng
IHHNV phân lập khoảng 1,39 ×10−4 thay đổi/vị trí/năm (Robles-Sikisaka và ctv.,
2010). Bên cạnh đó, khi phân tích trinh tự gen ORF 3 mã hóa cho vỏ capsid của
chủng IHHNV mới được phân lập ở Philippine cho thấy trình tự mới phân lập này
có thể là một chủng khác biệt với các chủng còn lại ở nước này (Caipang, và ctv.,
2011).
Bên cạnh đó, chủng IHHNV từ Hawaii (AF218266) cũng được dùng để so
sánh với các chủng khác được phân lập trên tôm sú từ các vùng khác nhau trên thế

10


giới. Trình tự 2,9 kb được so sánh (chứa đựng khoảng 70 % toàn bộ bộ gen virus
bao gồm cả chiều dài của ORF1 và ORF2) cho thấy chủng IHHNV phân lập từ
Philippine khá giống với chủng ở Hawaii với sự khác biệt khoảng 0,2 % trong trình

thẻ chân trắng L. vannamei và postlarvae tôm càng xanh Macrobrachium
rosenbergii (Hsieh và ctv., 2006). Kết quả là tôm tăng trưởng bất thường trong suốt
quá trình phát triển (Kalagayan và ctv, 1991.; Lightner và ctv, 1992). Trong sản
xuất tôm thẻ chân trắng, khi nhiễm virus này, tôm có sự chênh lệch về kích thước,
dị dạng còi cọc và thiệt hại về kinh tế khoảng 10-50% sản lượng so với tôm nuôi
không nhiễm virus (Lightner và Redman, 1998). Hiện tại rất ít thông tin liên quan
đến đáp ứng miễn dịch và sinh lý học của tôm khi nhiễm IHHNV, đặc biệt là liên
quan đến sinh sản và phát triển của phôi. Sự lây nhiễm IHHNV tùy thuộc chủng
virus, tùy vào ký chủ lây nhiễm trong tự nhiên và phân bố theo vùng địa lý khác (từ
châu Mỹ đến châu Á, Châu Úc và Châu Phi). Ký chủ của IHHNV hầu hết là các
loài họ tôm he, có thể bị nhiễm bởi IHHNV như tôm sú P. monodon, tôm thẻ chân
trắng P. Vannamei, tôm xanh P. Stylirostris, và một số loài tôm trong tự nhiên P.
occidentalis,

P.

semisulcatus,

Litopenaeus

Schmitti,

Farfantepenaeus

Californiensis, Marsupenaeus japonicus. IHHNV nhiễm tự nhiên trên postlarvae
và cận trưởng thành trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được ghi
nhận ở miền Nam Đài Loan, còn những loài tôm khác như Fenneropenaeus indicus,
Fenneropenaeus merguiensis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus duorarum
và Litopenaeus setiferus cũng được cho lây nhiễm trong phòng thí nghiệm (Rai và
ctv., 2012; Hsieh và ctv., 2006). Cho đến nay chưa có vật chủ trung gian truyền lây

tôm, phương pháp cho tôm ăn nguồn nhiễm bệnh hay cho tôm tiếp xúc với nguồn
nước nhiễm virus và phương pháp cho tôm sống chung với đối tượng nhiễm virus.
Phương pháp tiêm là phương pháp cho kết quả gây nhiễm nhanh và có độ tin cậy
cao tuy nhiên phương pháp này thường gây sốc với tôm và con đường xâm nhập
không giống với cách xâm nhiễm của virus trong tự nhiên. Nên phương pháp này
được chọn để chuẩn bị nguồn lây nhiễm (sống chung và làm nguồn thức ăn nhiễm
bệnh) cho thí nghiệm lan truyền theo trục ngang và tiêm vào cá thể tôm mẹ trong thí
nghiệm theo trục dọc. Có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để cảm
nhiễm nhiều loại virus cho tôm như WSSV (Vijayan và ctv., 2005), MrXV và XSV
(Sudhakaran và ctv., 2007), IHHNV (Brock và ctv., 2007). Tùy thuộc vào kích
thước mà liều lượng được tiêm cho tôm có thể được tính toán thông thường thể tích
từ 10 -100µl. Phương pháp cho ăn mô tôm bệnh là phương pháp khá giống với cách
thức xâm nhiễm của virus trong tự nhiên thông qua tập tính ăn thịt những cá thể yếu
mang mầm bệnh hay xác bã mà cá thể tôm thải ra. Phương pháp này được sử dụng
13


rất nhiều trong những nghiên cứu cảm nhiễm virus cho tôm như thí nghiệm lây
nhiễm WSSV cho tôm thông qua Polycharte Pereneis nuntia nhiễm virus (Vijayan
và ctv., 2005; Loarun và ctv., 2005), lây nhiễm MrNV và XSV cho tôm thông qua
Artemia (Sudhakaran và ctv., 2007) và lây nhiễm IHHNV cho tôm thẻ thông qua
nguồn thức ăn nhiễm virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz và ctv., 1997; Tang và
ctv., 2006; Coelho và ctv., 2009). Trong thí nghiệm lây nhiễm bằng cách thức cho
ăn, nguồn thức ăn được thu thập hay sàng lọc từ những cá thể cho kết quả dương
tính với virus. Sau đó chúng được xay nhuyễn và cân đo liều lượng cho ăn, thông
thường các bể thí nghiệm sẽ được cho ăn với tỉ lệ từ 5 – 10 % trọng lượng tôm thí
nghiệm. Đối với các bể đối chứng tôm sẽ được cho ăn mô tôm khỏe hoặc thức ăn
viên. Do đó, phương pháp này thường được lựa chọn để nghiên cứu sự lan truyền
của virus theo trục ngang. Phương pháp sống chung (cohabitant) là phương pháp
khắc phục được nhược điểm của phương pháp tiêm là làm cho tôm nhiễm bệnh

thì IHHNV đã được phát hiện trên các mẫu tôm tự nhiên ở các địa phương là từ 0
đến 100%. Một vài số liệu đã được báo cáo về sự hiện diện IHHNV trong các đàn
tôm hoang dã lần lượt là 26% và 46% trong P. stylirotris ở hạ lưu và thượng lưu của
Vịnh California, 100% và 57% ở tôm cái và tôm đực trưởng thành của P. stylirotris
ở vùng giữa của Vịnh California. Trên tôm P. vannamei thu thập được từ bờ biển
Thái Bình Dương của Panama là 28% khi kiểm tra bằng lai dot blot (Nunan và ctv.,
2001). Mặt khác, những báo cáo gần đây cho thấy sự lưu hành của IHHNV trên tôm
P. setiferus và P. aztecus hoang dã ở Mexico là rất thấp khoảng 4,4 % (GuzmanSaenz và ctv., 2009). Ở Nam Mỹ, những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được
tiến hành trên các mẫu xét nghiệm tôm hoang dã F. subtilis thu thập từ cửa sông
Pacoti ở vùng biển miền Đông Bắc Brazil cho thấy chúng cảm nhiễm với IHHNV
(Coelho và ctv., 2009). Sự lưu hành cao của IHHNV được báo cáo ở các trang trại
tôm từ vùng Đông Bắc Brazil ở phạm vi từ 9,4 – 81 % (Braz và ctv., 2009). Sự lưu
hành thấp (1,1 – 1,3 %) được tìm thấy ở tôm P. vanamei nuôi ở Venezuela và Peru
(0.31%) (Boada và ctv., 2008; Alfaro-Aguilera và ctv.,2010). Ngoài các loại họ tôm
he thì IHHNV hiện diện trên 3 loài giáp xác khác Artemesia longinaris,
Cyrtograpsus angulatus, và Palaemon macrodactylus ở Argentina với tỷ lệ nhiễm
56%, 67% và 40% (Martorelli và ctv., 2010).

15


Owen và ctv., (1992) đã báo cáo sự hiện của IHHNV trong tự nhiên ở
Australia (Úc) thuộc vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương. Năm 2008, dạng lây nhiễm
của IHHNV được tìm thấy trên tôm P. monodon nuôi ở Úc (Saksmerprome và ctv.,
2010). Ngoài ra, IHHNV được phát hiện ở P. stylirostris được nhập khẩu vào
Polynesia (thuộc địa Pháp) và Guam để nuôi trồng (Costa và ctv., 1998; Tang và
ctv., 2002).
Ở Châu Á, virus này đã được tìm thấy ở kiện hàng tôm P. vannamei nhập khẩu
từ tôm nuôi ở Đài Loan vào năm 1986 (Lightner và ctv., 1987). Sau đó, những báo
cáo về sự hiện diện của virus này trên tôm P. monodon hoang dã và nuôi ở các nước

thu nhận từ mẫu tôm ở Bạc Liêu, kết quả cho thấy bộ gen IHHNV từ mẫu nghiên
cứu này có kích thước 3815 bp, có độ tương đồng cao nhất 98% với chủng IHHNV
phân lập ở Đài Loan, 97% với chủng IHHNV Thái Lan (An và ctv., 2009). Tuy
nhiên, do sự du nhập tôm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nhau nên rất có thể có sự đa
dạng về di truyền của các chủng IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL. Sự
thiếu hụt các hiểu biết về IHHNV trong hệ thống nuôi tôm sú tại Việt Nam làm lúng
túng trong việc chọn lựa phương pháp xét nghiệm để kiểm soát chất lượng tôm
nuôi.
2.5. Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh IHHNV hiện nay
Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như mang,
biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh…(Lightner và ctv.,1983). Những bộ
phận này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh.
2.5.1. Dựa trên dấu hiệu lâm sàng
Tôm sú nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ (hình 2.2) và hệ cơ vân ở
phần bụng có thể bị mờ đục (Rai và ctv, 2009). Ngoài ra IHHNV hiện diện trên tôm
sú cũng gây ra hội chứng RDS làm biến dạng lớp vỏ kitin. Chùy đầu sẽ bị uốn cong
hoặc dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị xùi, tôm kém ăn (Bell và
Lightner., 1984; Kalagayan và ctv., 1991; Primavera và Quinitio., 2000). Tuy nhiên,
dấu hiệu lâm sàng không phải luôn luôn rõ ràng, dễ nhầm lẫn với dấu hiệu các cơ
quan gây ra bởi các bệnh khác như bệnh đốm trắng WSSV.

17


Hình 2.2. Tôm sú (P. monodon) 50 ngày tuổi bị nhiễm IHHNV với các kích thước
khác nhau (Rai và ctv., 2009). P. monodon bị nhiễm IHHNV khi gần chết có màu
xanh biếc, hệ cơ ở phần bụng có thể mờ đục.
2.5.2. Phương pháp mô học
Đây là phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán bệnh thủy sản
(Lightner và ctv., 1983; Bell và Lightner., 1984). Các tế bào bị bệnh xuất hiện ở

RNA) được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Do đó có
thể phát hiện và định lượng được nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên
cường độ phát huỳnh quang (Tang và ctv., 2000). Kỹ thuật Real−time PCR được
ứng dụng nghiên cứu IHHNV và biết được độ nhạy của phương pháp này dùng
chẩn đoán DNA IHHNV trong mẫu là 0.15 pg (Khawsak và ctv., 2008). Bên cạnh
đó phương pháp này còn được dùng trong phát hiện IHHNV trên các cơ quan khác

19


nhau của tôm sú bố mẹ hoang dã, thế hệ con của chúng (Chayaburakul và ctv.,
2005). Hiện đã có bộ kit Real-time PCR (IHHNV) (trung tâm công nghệ sinh học
Tp. Hồ Chí Minh., 2008). Tuy nhiên kỹ thuật Real-time PCR đòi hỏi phòng thí
nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao và người phân tích
phải có kiến thức cơ bản về chúng.
2.5.5. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)
Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nucleic acid cần tìm (trình
tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô lai tại chỗ cho phép nghiên cứu
nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Hiện
nay phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) cũng được phát triển để chẩn
đoán bệnh IHHNV (Mari và ctv., 1993; Jimenez và ctv., 1999), phát hiện IHHNV
ngay trên mẫu mô mà không cần li trích DNA. Kỹ thuật này được dùng để nghiên
cứu sự thay đổi tế bào và mẫn cảm giữa hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng khi
nhiễm IHHNV (Chayaburakul và ctv., 2005). Mẫu dò đặc hiệu với virus IHHNV
được đánh dấu và đem lai trực tiếp với DNA virus trên mô đích trong điều kiện
nghiêm ngặt. Phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng lại cần thời
gian dài để hoàn thành (2 – 3 ngày).
2.5.6. Phương pháp kháng thể đơn dòng
Phương pháp kháng thể đơn dòng cũng được xem như là 1 công cụ ứng dụng
cho những nghiên cứu khác về IHHNV. Kháng thể đơn dòng này có thể phát hiện

dù mới được giới thiệu nhưng số lượng công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp
LAMP như một công cụ chẩn đoán tăng lên đáng kể trong một vài năm gần đây đã
cho thấy tính hấp dẫn của phương pháp này. Nhưng nhìn chung thì LAMP vẫn còn
là một phương pháp mới và đang được nghiên cứu thêm.
2.5.8 Phương pháp PCR
Phương pháp PCR được ứng dụng phát hiện IHHNV từ các động vật biển (Shi
và ctv., 2003). Hiện có nhiều quy trình PCR được công bố từ các nhóm nghiên cứu
trên toàn thế giới như PCR phát hiện IHHNV (Nunan và ctv., 2000; Rai và ctv.,
2009). Một số quy trình PCR còn cho phép phát hiện phân biệt IHHNV lây nhiễm
và không lây nhiễm (Tang và ctv., 2007; Saksmerprome và ctv., 2010). Đến nay,
PCR vả realtime PCR được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh
21


chóng và cho kết quả chính xác nhất trong chẩn đoán IHHNV (Tang và Lightner.,
2001; Dhar và ctv., 2001). Multiplex reverse transcription polymerase (mRT-PCR)
cũng được phát triển để chẩn đoán đồng thời 6 loại virus khác nhau gây bệnh trên
tôm bao gồm IHHNV với độ nhạy phát hiện IHHNV là 0.15pg trong phản ứng
(Khawsak và ctv., 2008). Yang và ctv. (2006) đã phát triển PCR một bước phát hiện
đồng thời 2 virus WSSV và IHHNV nhiễm trên một mẫu tôm với độ đặc hiệu khá
cao. Gần đây, Chen và ctv. (2012) cũng đã phát triển multiplex PCR phát hiện
IHHNV và WSSV mới nhiễm trên tôm với độ nhạy cá 1x 103 copy DNA trong bản
mẫu. Khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp nêu trên, phương
pháp PCR cho kết quả nhanh (trong khoảng 4 giờ) và có độ tin cậy cao. Kết quả thu
được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt. Do những
ưu điểm trên chúng tôi đã chọn phương pháp PCR để thực hiện đề tài này.
2.5.9 Các nghiên cứu PCR về chẩn đoán IHHNV lây nhiễm trên tôm nuôi
ở Việt Nam
Nhờ tiến bộ về công nghệ sinh, các phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh
trên thủy sản ngày càng đa dạng và phong phú như: chẩn đoán dựa trên vật liệu di

type IHHNV lây nhiễm đang hiện diện tại khu vực ĐBSCL và mối quan hệ di
truyền của chúng đối với các chủng khác đã được phân lập và nghiên cứu từ các
nước trong khu vực và trên toàn cầu.
Trong quần đàn tôm sú tự nhiên, sự xuất hiện hai dạng trình tự “related
sequences IHHNV” (Type không lây nhiễm) gồm type 3A và type 3B chèn trong
bộ gen của tôm sú đã được công bố. Hai trình tự của type 3A và type 3B được cho
là có nguồn gốc từ IHHNV và có độ tương đồng về trình tự cao với virus này, đồng
thời, sự hiện diện của chúng trong bộ gen tôm cũng không gây ra triệu chứng bệnh
hoặc truyền bệnh. Do trình tự bộ gen IHHNV nhỏ và sự xuất hiện trình tự Type 3A
và Type 3B (khoảng 2,9 kb) trong bộ gen của tôm sú đã gây ra sự nhầm lẫn trong
chẩn đoán sự lây nhiễm IHHNV ở nhiều phương pháp PCR. Nghiên cứu một phần
trình tự type 3A và type 3B trên các mẫu tôm thu được từ 5 tỉnh sẽ cho phép chọn
lựa được phương pháp PCR thích hợp cho ứng dụng phát hiện sớm IHHNV tại Việt
Nam.
IHHNV được cho lây nhiễm ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm thẻ chân
trắng và sự truyền lan được xác định diễn ra theo cả chiều ngang và chiều dọc. Mặc
23