MỞ ĐẦU

1


1. Tính cấp thiết của luận văn
Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa
trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do các
nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình
thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm
kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17].

2


Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS),
sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không
đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit.
Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ
bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp
di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai. Hiện nay, các bộ
kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có
những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình
nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác
nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff
khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong
dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các
thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy,
độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù
hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%,
giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ

4. Bố cục của đề tài
Đề tài gồm 71 trang, trong đó có 65 hình vẽ, đồ thị, 26 bảng biểu, chưa kể
41 trang phụ lục và 57 tài liệu tham khảo. Ngoài phần mở đầu và kết luận, đề
tài được chia làm ba chương: chương 1 – Tổng quan tài liệu, gồm 25 trang;
chương 2 –Phương pháp nghiên cứu, gồm 9 trang; chương 3 – Kết quả và
bàn luận, gồm 33 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang.
Liên quan đến nội dung đề tài đã đăng 1 bài trên Tạp chí Y học thành phố
Hồ Chí Minh.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào
Trong ngành Huyết học thường sử dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa
học tế bào như sau: Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B,
Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế
4


bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axít. Các kỹ thuật này dựa trên ba
nguyên lý chính là phản ứng hóa học (PAS), khuếch tán vật lý (Sudan B) và
enzym (6 kỹ thuật còn lại). Hai kỹ thuật nhuộm PAS và Sudan B ít có cải
tiến, riêng các kỹ thuật nhuộm enzym đã phát triển mạnh kể từ khi tìm ra
phản ứng tạo chất màu với sự xúc tác của enzym theo nguyên lý hình thành
phẩm màu azo vào những năm 50 của thế kỷ XX.
1.2. Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào
Từ đầu những năm 1970, bộ môn Huyết học-Truyền máu đã triển khai các
kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào tại khoa Huyết học-Truyền máu Bệnh viện
Bạch Mai. Một số tác giả như: Lê Đức Ngọc, Nguyễn Đình Triệu, Lưu Văn
Bôi đã tiến hành một số nghiên cứu về cơ chế phản ứng, tổng hợp cơ chất,
đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính-cấu trúc và cải tiến các phương pháp
đánh giá các phương pháp nhuộm hóa học tế bào. Các kết quả đã giúp nâng
cao chất lượng của các kỹ thuật nhuộm ứng dụng trong chẩn đoán dòng tế


chưa cố

đã cố định

màu các

định
chất
Như vậy, nhuộm hóa học tế bào là dùng các phản ứng hóa màu hoặc phản
5


ứng dưới xúc tác của enzym để phát hiện các chất hóa học có trong tế bào. Sự
xuất hiện màu chứng tỏ có chất cần phát hiện và cường độ màu phụ thuộc vào
nồng độ của chúng có trong tế bào. Các kỹ thuật này cần đạt được độ nhạy và
độ đặc hiệu cần thiết để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm.
1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học
8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào là cơ sở để chẩn đoán phân biệt bệnh
bạch cầu kinh với nhiễm trùng bạch cầu đơn nhân và dòng tế bào trong bệnh
bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB.
1.5. Các công cụ toán học sử dụng trong nghiên cứu y học
Kế hoạch hóa thực nghiệm nhằm tìm điều kiện tối ưu để đạt được kết quả
nhuộm tốt nhất phải dựa trên các công cụ toán học. Các phương pháp tối ưu
hóa thực nghiệm đơn hình và khảo sát mặt mục tiêu thường hay được sử
dụng trong nghiên cứu. Hiện nay các phần mềm thống kê như: SPSS, Modde,
Excel... đã hỗ trợ tốt cho việc xử lý dữ liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyết

trường hợp được chẩn đoán ban đầu mắc bạch cầu cấp trong đó có 60 trường
hợp kết luận đúng thể bệnh, như vậy chỉ dựa vào lâm sàng mức độ chẩn đoán
đúng thể bệnh đạt tỷ lệ rất thấp (42,3%). Do đó cần kết hợp nhiều phương
pháp chẩn đoán khác nhau. Tiêu chuẩn FAB (1986) sử dụng kết quả hình thái
học-nhuộm hoá học tế bào, marker và di truyền làm cơ sở để phân loại thể
bệnh và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp nhằm chẩn đoán và lựa chọn
phác đồ điều trị cho bệnh nhân đạt hiệu quả cao nhất [33, 36, 37, 39, 40].
Bảng 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp

7


Kết luận
Bạch cầu cấp
Bệnh khác
Tổng

Số lượng
60
142
202

Tỷ lệ (%)
29,7
70,3
100

Trong tổng số 202 trường hợp chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học Truyền
máu Trung ương trong đó có 60 trường hợp có kết luận đúng thể bệnh chiếm
29,7%. Tỷ lệ này tương đương với công bố của Trần Thị Minh Hương và

Qua hình 3.1 cho thấy bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, tuy vậy đối với nam tần suất
mắc bệnh tỷ lệ nghịch với độ tuổi, dưới tuổi lao động chiếm tỷ lệ cao nhất
(21,5%). Ngược lại, ở nữ giới thì độ tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là ở ngoài độ
8


tuổi lao động (20,0%).
3.2. Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho
3.2.1. Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho
Bảng 3.3. Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính

Giới tính
Nam
Nữ
Tổng

Số lượng
14
11
25

Tỷ lệ (%)
56,0
44,0
100

Về giới tính: bệnh gặp ở cả 2 giới. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp
dòng lympho ở nam cao hơn nữ, nam chiếm 56,0%, nữ chiếm 44,0 %
(nam/nữ =1,3).


Kết quả bộ kít HICYTEC
Số lượng
Tỷ lệ (%)
2
8
23
92
0
0
25
100

Kết quả bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp thể L2 gặp
nhiều nhất (chiếm 92%), tiếp đến là thể L1 (chiếm 8%) và không gặp trường
hợp nào thể L3. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Thị
Minh An (1995) [1], Lâm Thị Mỹ và cộng sự (2004) đều thấy thể L2 chiếm
tỷ lệ cao trong bạch cầu cấp dòng lympho [10]. Tuy vậy, khác với nghiên cứu
của tác giả C. H. Pui (2001) tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hầu
hết có phân loại theo FAB thuộc thể L1 chiếm tới 70% [48].
b) Đánh giá mức độ phù hợp phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho bằng bộ kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết quả chẩn đoán
xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương
Bảng 3.5. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng bộ kít
HICYTEC và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu
trung ương trên từng bệnh nhân

10


Kết


15010165
15013692
15013057
15012072
14034835
15011022
15011378
15010693
15011337
15011154
15009721
14035107
15010527
14019748
15008709
15010257
856
14037484
14037438
14038058
14038278
14035789
14087493
14035765
14035113

Họ và tên

Nguyễn Thị L.

2013
2007
1954
1936
2010
1947
2012
2008
2008
1994
2013
2013
2015
2000
1992
2012
2012
1963
1997
1922
2013
1998
2009

Ngày XN

30/04/2015
28/05/2015
22/05/2015
14/05/2015

viện

sử dụng

HH-

kit

TM

HICYTEC

TW
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L2

L1
L2
L1
L2

Tổng hợp lại kết quả ở trên được bảng phân loại thể bệnh trên bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
Chẩn đoán xác định

Kết quả bộ kít
11

Sai khác


Thể
bệnh
L1
L2
L3
Tổng
cộng

Viện HH-TMTW
Số
Tỷ lệ (%)
lượng
2
8
23

0
0
0

0

0

Như vậy, mức độ phù hợp phân loại thể bệnh theo phương pháp hình
thái học-hóa học tế bào bằng kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết quả
chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương dựa trên 3
phương pháp: miễn dịch, di truyền và hình thái học-hóa học tế bào đạt 100%
theo tiêu chuẩn FAB ( bảng 3.6). Kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của
Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) khi sử dụng 5 phương pháp nhuộm: Giem
sa, peroxidaza, sudan B, PAS và esteraza không đặc hiệu tự pha thì độ nhạy
là 100%, độ đặc hiệu là 73,77%, giá trị dự báo phân loại dòng lympho là
88,88%. Sự phù hợp chẩn đoán giữa hình thái-hóa học tế bào và miễn dịch tế
bào là 89,10% [25].
3.2.3. Kết quả nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T
trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho
Bảng 3.7. Kết quả nhuộm photphataza axit phân loại dòng lympho T

Dòng tế bào
Lympho B
Lympho T
Tổng

Số lượng
24
6

Nữ
Tổng

Số trường hợp
10
20
30

Tỷ lệ
36,67%
63,33%
100%

Trong đó, bạch cầu cấp dòng tủy gặp ở nữ (63,33%) cao hơn so với nam
giới 2 lần, tỷ lệ này cao hơn nhiều so với công bố của Siegel M. P. H. R., và
cộng sự (nữ chỉ chiếm 46,4%) tại Mỹ năm 2012 [51].
Bảng 3.9. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo

Thể
bệnh
M0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
Tổng


16,7%
1
3,3%
8
26,7%
3
10,0%
0
0,0%
0
0,0%
20
66,67%

13

giới tính

Tổng cộng
Số lượng
Tỷ lệ
1
3,33%
3
10,00%
6
20,00%
3
10,00%
13

Không có trường hợp nào bệnh nhân mắc thể M7 (xem hình 3.14).
Hình 3.14.
Tỷ lệ bệnh
nhân bạch
cầu cấp
theo kết
quả chẩn
đoán của
Viện Huyết học-Truyền máu trung ương

14


Kết quả này khác với nghiên cứu của Phan Nguyễn Thanh Vân (tỷ lệ
mắc bệnh bạch cầu cấp dòng tủy chủ yếu gặp ở thể M2 chiếm 66,1% khi
thống kê trên cỡ mẫu là 162 mẫu) [21]. Sự sai khác này có thể do cỡ mẫu
trong nghiên cứu này nhỏ (30) nên chưa có tính đại diện cao vì thời gian
nghiên cứu ngắn.
3.3.3. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng kit nhuộm
HICYTEC
Bảng 3.10. Kết quả phân loại thể bệnh bằng bộ kit nhuộm HICYTEC

Thể bệnh

Kết quả sử dụng bộ kit HICYTEC
Số lượng

Tỷ lệ

M0


3

10,0%

M5b

1

3,3%

M6

1

3,3%

M7

0

0%

Tổng

30

100%

3.3.4. Mức độ phù hợp về chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng

19.
20.
21.

Mã BN

14036597
14038360
14037630
14037167
15012076
15012171
15011072
15009749
15011309
15010643
15009702
1501908
15010303
15008623
15009229
15009993
15008651
15008364
15008212
15007750
15007543

22. 14038805
23.

Bùi Thị C.
Nguyễn Thị D.
Nguyễn Thị Kim
A.
Đỗ Thị P.
Đặng Hồng M.
Hà Thị Thu H.
Nguyễn Văn T.

luận

Kết luận

Ngày

của

thể bệnh

xét

viện

sử dụng

nghiệm

HH-

kit

M3
M4
M2
M5a
M4
M5a
M1
M4
M6b
M5b
M2
M1
M2
M4
M2
M3
M4
M2
M2

M4
M4
M3
M4
M2
M5
M4
M5
M1
M4

M4
M3

Năm
sinh

1989
1962
1988
1988
2007
1956
1961
1960
1947
1987
1952
1982
1953
1936
2007
1956
1972
1962
1999
1942
1940

16



HICYTEC

1997 28/08/2014

TW
M0

M1

1998 29/08/2014

M4

M4

1996 29/08/2014
1994 24/04/2015

M4
M1

M4
M1

Năm

Họ và tên

sinh

15011531 Lý Trọng Đ.

Năm
sinh

Ngày XN

của viện thể bệnh sử
HH-TM

TW
2009 21/05/2015 Lai L-T
17

Kết luận
dụng kit
HICYTEC
Lai L-T


Kết luận
TT

2.
3.
4.
5.

Mã BN


Kết quả nhuộm hóa học tế bào bằng kít nhuộm HICYTEC cho thấy có
5 trường hợp bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy chiếm 8,3% (xem bảng 3.4).
Tỷ lệ này cao hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Triệu Vân và cs (2004)
bạch cầu cấp thể lai tủy-lympho chiếm 6,2% [22]. Đây là thể hỗn hợp giữa 2
dòng tế bào là dòng lympho và dòng tủy. Khó khăn lớn nhất trong việc phân
loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho - tủy khi sử dụng phương pháp hình
thái học - hóa học tế bào dùng để phân loại thể bệnh là tỷ lệ tế bào dòng
lympho và dòng tủy rất biến động trong các mẫu tủy. Một số tế bào do đột
biến có thể mất một số chất hóa học hoặc enzym trên nguyên sinh chất tế bào
nên dẫn đến không nhận định được kết quả.
3.5. Kết quả nhuộm photphataza kiềm bạch cầu
Bảng 3.13. Kết quả nhuộm photphataza kiềm trên bệnh nhân bạch cầu cấp

Điểm nhuộm

Số lượng

Tỷ lệ


Hình 3.56 thể hiện phản ứng nhuộm photphataza kiềm dương tính,
nguyên sinh chất tế bào bắt màu đỏ trên nền nhân và hồng cầu màu xanh.
Hình 3.56. Ảnh nhuộm
photphataza kiềm mẫu tủy
của bệnh nhân Trần Văn
C.

3.6. Kết quả nhuộm
sắt trên mẫu tủy của bệnh nhân bạch cầu cấp tại Viện HH-TM trung
ương
Bảng 3.14. Kết quả nhuộm Perls trên các mẫu tủy bị bệnh bạch cầu cấp

Giới
Có tế bào mạng lưới nội mô sắt
Không có tế bào mạng lưới nội mô sắt
Tổng

Số trường hợp
6
54
60

Tỷ lệ
10,0%
90,0%
100%

Nhuộm sắt (Perls) có thể phát hiện các nguyên hồng cầu sắt hoặc các tế
19


bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB đạt được sự phù hợp 100% đối với dòng
lympho và 93,3% đối với dòng tủy so với kết quả chẩn đoán của Viện Huyết
học - Truyền máu trung ương bằng các phương pháp hình thái học, miễn dịch
và di truyền. Có 5 trường hợp bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy, mức độ phù
hợp trong chẩn đoán cũng đạt 100%.
3. Đã đánh giá được giá trị của bộ kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ
HICYTEC khi nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm photphataza kiềm
và nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp: 20% mẫu tủy có photphataza
axit dương tính định hướng dòng lympho T; 1,7%

có điểm nhuộm

photphataza kiềm tăng định hướng có nguy cơ nhiễm trùng; 3,3% mẫu tủy
gặp các tế bào mạng lưới nội mô sắt có giá trị theo dõi tình trạng ứ sắt tốt hơn
so với nguyên hồng cầu sắt.
KIẾN NGHỊ

Sử dụng bộ kít nhuộm HICYTEC đồng bộ 10 kỹ thuật để nhuộm các
mẫu tủy chọc tủy lần đầu trong các phòng xét nghiệm Huyết học để xác định
thể bệnh.
21