Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền, làm nguyên
liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được
khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Khối lượng
dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa
vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu
khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con
số thống kê cụ thể [10].
Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) còn gọi là cà quạnh, cà gai dây,
cà quýnh, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b’rongoon (Ba Na), có tên khoa học khác là
Solanum procumben Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae) [18]. Trong thành phần hóa
học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, đ y là một steroid alkaloid được
t m thấy ở khoảng 250 loài c y khác nhau thuộc họ Cà, đ c biệt là chi Solanum,
ch ng thư ng tồn tại ở dạng glycoside. Các nghiên c u trước đ y cho thấy
solasodine có hoạt t nh kháng viêm và bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư (đ c
biệt là ngăn ngừa ung thư da). Solasodine còn là tiền chất để sản xuất các loại
corticosteroid, testosteroid và thuốc tránh thai. Ngoài ra, ch ng còn có tác dụng
chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan [14]. Gần đ y, nghiên c u cho thấy solasodine
còn có tác dụng bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở ngư i như Herpes simplex,
H. zoster và H. genitalis (Chating và cs), bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của
vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu… [64].
Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai leo được khai thác chủ yếu từ nguồn
hoang dại, ch ng thư ng phân tán manh múm và chất lượng không đồng đều, trữ
lượng có giới hạn và hiện đang cạn kiệt do bị thu hái bừa bãi. Vì thế, nguồn nguyên
liệu này không đủ để đáp ng cho việc nghiên c u và điều trị.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những lĩnh vực ng dụng đạt
nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Phương pháp này với
những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong th i
1


gian ngắn, hàm lượng hợp chất th cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy

lũy sol sod e ở t bào in vitro c a cây cà gai leo

(Solanum hainanense Hance).

p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù

tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự
2


nhiên cho các nghiên c u trong lĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở
cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế bào để ng dụng
trong lĩnh vực dược phẩm sau này.

Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế
bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).
g

o

Kết quả nghiên c u của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá
trị về khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung
các elicitor. Đồng th i luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên c u và
giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đư ng nuôi cấy tế
bào thực vật.
Đề tài là hướng nghiên c u có tiềm năng ng dụng trong lĩnh vực sản xuất
hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào
việc bảo vệ và chăm sóc s c khỏe cộng đồng.
g



C

C
Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là quá tr nh điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách r i trong điều kiện in vitro có định
hướng thành những cấu trúc biệt hóa hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính
toàn năng của tế bào thực vật [42].
Nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng lớn trong việc cải thiện khả năng tổng
hợp các HCTC có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không
thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật ho c tổng hợp bằng phương pháp hóa
học. Sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được
mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên c u này. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn
lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các HCTC
từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều HCTC được sản xuất trong suốt
quá trình phân hóa tế bào, vì thế ch ng được tìm thấy trong các mô có khả năng
ph n hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không
xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất th cấp có khuynh hướng ngưng tạo
thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi
cấy huyền phù thư ng tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có
sự tiếp xúc với môi trư ng khác các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện
ở một m c độ nào đó trong khối để tạo thành các HCTC [7].
Nuôi cấy tế bào thực vật sinh trưởng chậm hơn so với vi khuẩn, th i gian
nh n đôi trong khoảng 24-72 gi . Sự khác nhau này dẫn đến việc phải sử dụng các
điều kiện vô trùng tuyệt đối cho nuôi cấy tế bào thực vật. Thông thư ng, tế bào nuôi
cấy không quang hợp, vì vậy phải bổ sung đư ng làm nguồn carbon. Đ y là nguồn
năng lượng hiệu quả nhất để sản xuất HCTC. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào nhanh
4

đổi khí, sự lưu thông của môi trư ng dinh dưỡng trong b nh nuôi cũng như gia tăng
sự tiếp xúc giữa tế bào nuôi cấy với môi trư ng. Trong đó, nuôi cấy dịch huyền phù
ch a các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng ph n tán trong môi trư ng lỏng.
Thư ng khởi đầu bằng cách đ t các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trư ng lỏng
chuyển động (lắc ho c khuấy) [8].
Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những
chuyển động xoáy của môi trư ng. Sau một th i gian ngắn nuôi cấy, trong dịch
huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào với k ch thước khác nhau, các
mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền
phù hoàn hảo, ch a tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. M c độ
5


tách r i của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đ c tính của các khối tế bào xốp và
có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trư ng [63].
1.1.1.2. Nuôi cấy mẻ

đ ạn

Phương pháp nuôi cấy mẻ hai giai đoạn được áp dụng đối với nhiều loại tế
bào thực vật, và thành công đầu tiên là sản xuất hợp chất shikonin. Trong phương
pháp này, hai môi trư ng được sử dụng. Trong hệ lên men đầu tiên, điều kiện nuôi
cấy được tối ưu hóa cho sản xuất sinh khối tế bào. Sau đó, các tế bào được tập trung
và đưa vào hệ lên men th hai ch a môi trư ng kích thích sự tổng hợp các sản
phẩm th cấp [8].
1.1.1.3. Nuôi cấy mẻ có cung cấp d

dưỡng

Đ y là một hình th c khác của hệ thống nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào nuôi cấy

(1999) đã nghiên c u tăng hiệu suất paclitaxel bằng nuôi cấy liên tục tế bào Taxus
cuspidata và sử dụng nuôi cấy bán liên tục tế bào T. canadensis [94].
Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hạn chế trong nuôi cấy liên tục. Các tế bào luôn ở
trạng thái sinh lý không đổi, nhưng sự t ch lũy các HCTC thư ng diễn ra trong các
tế bào có tốc độ sinh trưởng thấp. Vì vậy, kỹ thuật này chỉ nên áp dụng cho những
sản phẩm trao đổi nào được sản xuất trong quá tr nh sinh trưởng. Nhược điểm th
hai của nuôi cấy liên tục là th i gian nuôi cấy dài làm tăng khả năng dễ bị nhiễm bởi
vi sinh vật (Ramawat và Merillon, 2004).
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện và sản xuất
các hoạt chất sinh học có giá trị. Khả năng ng dụng của phương pháp này thể hiện
qua việc có rất nhiều công trình nghiên c u mới được công bố. Những năm gần đ y,
sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi
nhất trong lĩnh vực nghiên c u này, đ c biệt là khả năng có thể thay đổi nguồn lợi
các hoạt chất sinh học từ thực vật bằng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào. Ưu thế về
m t nguyên lý của công nghệ này là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để
tách chiết một tỷ lệ lớn lượng dược chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].
1.1. . ả
1.

ứ
p

ấ

ấp

Hiện tượng trao đổi chất th cấp đã được công nhận từ giai đoạn sớm của thí
nghiệm thực vật hiện đại. Trong công trình xuất bản năm 1873, Julius Sachs, một
ngư i tiên phong trong sinh lý thực vật, đã mô tả như sau: "Ch ng ta có thể chỉ rõ
7

tố môi trư ng nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng.
- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên.
- Chọn giống cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn.
- Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển
hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên.
- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.
- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng
cao hơn c y hoàn chỉnh [64].

9


Bảng 1.1. Sản phẩm thứ c p từ nuôi c y t bào th c v t so sánh v i cây t nhiên [63]
Hiệu su t (% dw)
HCTC

Loài th c v t

Nuôi c y

Cây t nhiên

t bào
Shikonin

Lithospermum erythrorhizon

20,00 (s)

1,50


3,00

Ubiquinone-10

Nicotiana tabacum

0,036 (s)

0,0003

Diosgenin

Dioscorea deltoides

2,00 (s)

2,00

Berberine

Thalictrurn minor

10,00 (s)

0,01

Berberine

Coptis japonica


Stephania cepharantha

2,30 (s)

0,80

Tripdiolide

Tripterygium wilfordii

0,05 (s)

0,001

* Chú thích: (c): nuôi cấy callus; (s): nuôi cấy huyền phù.

1.1. . C

g

ứ sả

ứ

g

y

o

trong chai tam giác để thu solasodine và nhận thấy, solasodine t ch lũy trong tế bào
cao hơn trong callus [59].
Asiaticoside là hoạt chất chính của rau má (Centella asiatica), có hoạt tính
chống oxy hóa, chữa lành vết bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp
collagen [7]. M c dù có nhiều hoạt tính quan trọng nhưng hàm lượng asiaticoside
trong c y rau má không đáng kể. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên c u
tạo callus và khảo sát khả năng t ch lũy asiaticoside trong callus c y rau má [6].
Thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù cây rau má và khảo sát sự t ch lũy asiaticoside
trong tế bào nuôi cấy cũng đã được Loc và An (2010) nghiên c u [55].
Quinone là một nhóm ch c nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư,
chữa phong, chống hen suyễn... được xác nhận có trong thành phần của Drosera
burmanni, là một loài thực vật bắt mồi nhỏ, thân thảo, mang nhiều giá trị ng dụng.
Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền
phù tế bào cây D. burmanni cho mục tiêu thu nhận quinone. Kết quả ghi nhận hàm
lượng Plumbagin (một trong nhóm những hợp chất naphthoquinone) trong sinh khối
tế bào là 0,02% [11].
Dịch chiết các loài Drosera đã từng được ch ng minh về khả năng kháng
11


oxy hóa từ rất nhiều nghiên c u trên thế giới cũng như từ khả năng trị liệu trong
những bài thuốc dân gian. Quách Ngô Diễm Phương và cs (2011) đã sàng lọc và ly
trích thành công một hợp chất flavonoid từ ph n đoạn cao chiết có hoạt tính kháng
oxy hóa từ sinh khối cây D. indica nuôi cấy in vitro. Hợp chất được tinh sạch và xác
định cấu trúc là quercetin [13].
ư c

1.

Một số dược chất có nguồn gốc thực vật như mao địa hoàng từ Digitalis

5,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên
môi trư ng có 10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (dẫn theo Misawa, 1994) [63].
Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và th n trên môi trư ng B5 bổ
sung 2 mg/L 2,4-D ho c NAA. Dòng tế bào được tạo ra từ callus có nguồn gốc từ
th n và lá. Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và nuôi
trong 6 tuần th c một l t dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg taxol
[64].
Chất tanshinone I và cryptotanshinone của c y Salvia miltiorrhiza có tác dụng
ngăn ngừa biến ch ng thiếu máu cục bộ ở cơ tim; tanshinone II A đã thử nghiệm thành
công trong điều trị l m sàng ch ng đau thắt ngực ở Trung Quốc. Vincristine và
vinblastine được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào ở c y dừa cạn (Catharanthus roseus)
là các indole alkaloid đã trở thành thuốc có giá trị trong hóa trị liệu ung thư (theo
Vijaya, 2010) [103].
1. .

ELICITOR

C

C

C

C

C

C

1.2.1. Elicitor

một số enzyme ho c các kênh ion.
Bảng 1.2. Phân lo i elicitor trong sản xu t các h p ch t thứ c p [65]
A. Theo bản ch t elicitor
Các elicitor sinh h c

Các elicitor phi sinh h c

- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh vật và - Tác dụng tự nhiên của các tác nhân vật lý ho c
được chấp nhận bởi tế bào thực vật (các hóa học theo đư ng nội sinh tạo thành các
enzyme, các mảnh thành tế bào)

elicitor sinh học

- Được tạo thành bởi hoạt động của vi sinh - Tia UV, Windfall
vật trên tế bào thực vật (các đoạn pectin) ...

- Các protein biến tính (Rnase)

- Được tạo thành bởi hoạt động của enzyme - Đông và rã đông
thực vật trên các thành tế bào vi khuẩn - Các thành phần không thiết yếu của môi trư ng
(chitosan, glucan)

(agarose, thiếc ...)

- Các hợp chất: nội sinh và tạo thành trong tự - Các kim loại n ng
nhiên; được hình thành ho c tiết ra bởi tế bào - Dùng các hóa chất:
thực vật khi đáp ng kích thích khác nhau.

+ Có ái lực cao với DNA
+ Có hoạt tính phá vỡ màng tế bào như thuốc


Peptide

và

monilicolin,

chuỗi

các

poly-L-lysine,

ion

dương: - Alginate oligomer

polyamine,

glycoprotein
-

Enzyme:

polygalacturonase,

endo-

polygalacturonase acid lyase, cellulase
-

các đáp ng về m t h nh thái, sinh lý và t ch lũy phytoalexin (chất được sinh ra ở
thực vật khi chịu tác động của các tác nh n g y bệnh). Ch ng có thể là các elicitor
phi sinh học như các ion kim loại, hợp chất vô cơ ho c elicitor sinh học có nguồn
gốc từ nấm, vi khuẩn ho c động vật ăn cỏ, mảnh vỡ thành tế bào thực vật cũng như
các hợp chất được giải phóng ra tại vị tr tổn thương của thực vật do mầm bệnh
ho c động vật tấn công. Việc thực vật bị xử lý bằng chất k ch kháng ho c bị tấn
công bằng mầm bệnh g y ra một loạt các phản ng phòng vệ, bao gồm sự t ch lũy
các HCTC bảo vệ ở cả trong c y tự nhiên cũng như trong nuôi cấy. M c dù đã có
những nghiên c u s u về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong
các thực vật, tuy nhiên cơ chế của sự elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có nhiều
giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca 2+, các yếu tố ảnh hưởng đến
sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đư ng c chế hay hoạt hóa nội bào ho c sự
thay đổi áp suất thẩm thấu [65].
15


Elicitor không chỉ cảm ng sự hình thành phytoalexin de novo mà còn hoạt
hóa sự sinh tổng hợp nhiều hợp chất chủ yếu trong tế bào nuôi cấy. Sự tổng hợp
sesquiterpene gossypol ở Gossypium arboretum tăng lên hơn 100 lần khi dùng
elicitor có nguồn gốc từ Verticillum dablia, hay sự tăng sinh tổng hợp của
benzopheanthridine alkaloid sanguinarine lên 26 lần khi sử dụng elicitor trong nuôi
cấy huyền phù tế bào Papaver somniferum. Sự cảm ng sinh tổng hợp isoflavonoid
ở huyền phù tế bào Pueraria lobata bằng elicitor sinh học (dịch chiết nấm men) hay
elicitor phi sinh học (CuCl2) đã được nghiên c u, đ c biệt ở m c độ phân tử.
Elicitor tạo điều kiện để nghiên c u ở m c phân tử của con đư ng truyền tín hiệu
thông qua những tín hiệu ngoại bào dẫn đến sự sinh tổng hợp HCTC, liên quan tới
chất truyền tín hiệu th hai như nhóm oxygen hoạt hóa, Ca2+ và phosphoinositide
[65].
Những nghiên c u chuyên s u đã góp phần h nh thành cơ chế cho quá trình
cảm ng bằng elicitor ở thực vật. Các nghiên c u chủ yếu tập trung về các elicitor

- Hoạt hóa NADPH oxydase đáp ng AOS (active oxide specie), acid hóa
cytosol.
- Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào.
- Tạo các oxy hoạt động.
- T ch lũy các protein có liên quan đến mầm bệnh như chitinase và
glucanase, endopolygalacturonase… các nh n tố ngăn cản protease.
- Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm.
- Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mô sẹo).
- Hoạt hóa phiên mã các gen đáp ng kháng.
- Các phân tử đề kháng của thực vật như tanin, phytoalexin được phát hiện 24 gi sau khi xử lý với elicitor.
- Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin th cấp.
- Đáp ng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance).
Không phải tất cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những
nghiên c u về trật tự th i gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa
chúng còn nhiều ph c tạp và vẫn đang được nghiên c u [25].
1.2.1.3. Các y u tố ả

ưở

đ n quá trình cảm ng

Tăng cư ng sản xuất HCTC từ nuôi cấy tế bào thực vật thông qua sự cảm
ng đã mở ra một hướng nghiên c u mới trong công nghiệp dược phẩm. Các thông
17


số như thành phần và nồng độ elicitor, th i gian cảm ng, tuổi nuôi cấy, dòng tế
bào, chất điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng và đ c điểm thành tế bào
phù hợp có thể tăng khả năng t ch lũy các sản phẩm th cấp [65].
Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình

1.2.2.1. Nghiên c u ở

g elicitor

o g

ư
18

y

o


Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor trong các nghiên c u cải thiện khả năng
t ch lũy các HCTC khi nuôi cấy tế bào mới được quan tâm trong th i gian gần đ y.
Quách Ngô Diễm Phương và cs (2010) đã thử nghiệm tăng sinh hàm lượng
quinone trong cây D. burmanni in vitro bằng phương pháp sử dụng elicitor. Kết quả
cho thấy khả năng làm thay đổi hàm lượng hoạt chất trong cây in vitro của các tác
nhân cảm ng bao gồm: chất dẫn truyền tín hiệu (SA), tác nhân cảm ng cây phản
ng phòng vệ (vi khuẩn và nấm men) hay kỹ thuật g y stress điều kiện nuôi cấy
(stress dinh dưỡng). Trong đó, khi bổ sung dịch chiết nấm men, hàm lượng quinone
tăng từ 1,12-2,66 lần so với đối ch ng, salicylic acid làm tăng 1,2-2,0 lần, sinh khối
vi khuẩn làm tăng 1,22-2,46 lần và g y stress dinh dưỡng làm tăng 1,15-1,5 lần hàm
lượng quinone trong cây so với đối ch ng [12].
Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2012) nghiên c u ảnh hưởng của 2-hydroxybenzoic acid và dịch chiết nấm men đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp
asiaticoside trong nuôi cấy tế bào cây rau má (Centella asiatica). Kết quả nhận thấy
khi bổ sung ở ngày th 10 của nuôi cấy lần lượt 100 µM 2-hydroxybenzoic acid và
4 g/L dịch chiết nấm men, hàm lượng asiaticoside t ch lũy trong tế bào rau má tăng
gấp 5 và 3,5 lần so với đối ch ng không cảm ng [57].

đư ng cong sinh trưởng đã tăng sự t ch lũy decursin và decursinol lên 6,86 mg/l,
cao gấp 3,22 lần so với đối ch ng [86].
Cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) được nuôi cấy in vitro trong hệ lên men
2,5 L sau 17 đến 22 tuần. Cousins và cs (2010) đã sử dụng nhiều elicitor khác nhau
để tăng khả năng tổng hợp các HCTC ở cây này. Ở thí nghiệm th

nhất,

phenylalanine ho c MeJA được bổ sung vào môi trư ng nuôi cấy từ tuần th 12 đến
17. Thí nghiệm th 2, c y con được bổ sung các chất như proline, dịch chiết cá giàu
proline, MeJA ho c chitosan vào tuần th 20 (th i gian kéo dài 1,5 tuần). Sau 5
tuần xử lý ở thí nghiệm th nhất, sinh khối của cây giảm và sự t ch lũy các hợp chất
chống oxy hóa cũng giảm, sự suy giảm khả năng chống oxy hóa tương tự nhau khi
xử lý riêng lẽ phenylalanine, MeJA ho c xử lý kết hợp. Ở thí nghiệm th 2, khi xử
lý stress nitrogen ở nồng độ thấp, hàm lượng các hợp chất phenol tăng lên, chiếm
4,7% khối lượng khô, cao hơn đối ch ng chiếm 4,1% khối lượng khô [40].
Hiệu quả của các oligosaccharide (DP4, DP7 và DP10) tách chiết từ Fusarium
oxysporum Dzf17 lên khả năng sản xuất diosgenin ở c y Dioscorea zingiberensis đã
20


được Li và cs (2011) nghiên c u. Tế bào huyền phù được xử lý elicitor sau 26 ngày
nuôi (hỗn hợp oligosaccharide ở nồng độ 20 mg/L) và thu vào ngày th 32. Hàm
lượng diosgenin thu được cao nhất là (2,187 mg/L), gấp 5,65 lần so với đối ch ng
(0,387 mg/L). Xử lý elicitor riêng lẻ ở các nồng độ 2-10 mg/L, công th c xử lý DP7
6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng diosgenin đạt 3,202 mg/L, gấp 8,27 lần
đối ch ng. Khi xử lý DP7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào ngày 30, hàm lượng
diosgenin tăng lên đáng kể (4,843 mg/L, gấp 12,38 lần so với đối ch ng) [53].
Veerashree và cs (2012) đã nghiên c u ảnh hưởng của elicitor lên sự tạo thành
gymnemic acid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Gymnema sylvestre. Nuôi cấy dịch

sinh học (MeJA và SA) đã được Vaddadi và cs (2015) sử dụng để tăng cư ng khả
năng tổng hợp các hoạt chất sinh học ở cây cà phê vối (Coffea canephora). Kết quả
nghiên c u cho thấy các elicitor đã làm tăng đáng kể các HCTC được tổng hợp,
caffeine tăng 42%, theobromine tăng 39%, trigonelline tăng 46%, cafestol và
kahweol tăng 32% [100].

1.3. CÂY C
1. .1.

s

1.

ố

p

ố

Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), còn
có tên khoa học khác là Solanum procumbens. Ngoài ra, cà gai leo còn có nhiều tên
gọi địa phương khác như: cà quánh, cà quạnh, cà quýnh, cà bò, cà cạnh, cà hải nam,
cà gai dây [2].
Cà gai leo mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đư ng, ở độ cao
dưới 300 m. Phân bố ở Bắc Giang (Yên Thế), Phú Thọ (Việt Trì), Hà Nội (Bưởi),
Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh
Hoà, Gia Lai (An Khê, Kon Hà Nừng). Ngoài ra, còn có ở Trung Quốc (Hải Nam,
Quảng Đông, Quảng Tây) [9].
1.


đau. Đoàn Thị Nhu và cs (1998) đã ch ng minh cà gai leo có tác dụng chống viêm
cấp trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng cao hư, chống viêm mãn trên mô hình
gây u hạt thực nghiệm bằng amian trên chuột cống trắng, đồng th i gây teo tuyến c
trên chuột cống non. Ngoài ra, còn có những công trình nghiên c u khác ch ng
minh cà gai leo có tác dụng kháng viêm, giảm đau, giảm sự phát triển của quá trình
xơ trong xơ gan thực nghiệm trên chuột [3].
Phạm Kim Mãn và cs (1999) đã nghiên c u tác dụng chống ung thư của cà
gai leo và kết luận rằng, chế phẩm dịch chiết từ cây cà gai leo nồng độ 5 mg/100
mL có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư 180 Sarcoma với tỷ lệ tế bào chết là 52,8%
[9].
Việc nghiên c u thăm dò khả năng ngăn ch n tiến triển xơ của cà gai leo trên
mô h nh g y xơ gan thực nghiệm của Maros (1966) cho thấy sau 3 tháng g y xơ gan
trên chuột cống trắng, xơ gan hình thành rõ rệt, thể hiện trên các chỉ tiêu hóa sinh và
tổ ch c học. Ở th i điểm 5 tuần, quá trình bệnh lý mới tiến triển tới giai đoạn thoái
hóa mô gan, chưa có sự gia tăng rõ rệt của collagen. Nhưng khi xơ đã ở giai đoạn
hoàn chỉnh, song song với các biến đổi về tổ ch c học, hàm lượng collagen ở gan
xơ cũng tăng cao gấp 2,5 lần so với b nh thư ng. Dịch chiết cà gai leo với liều cho
uống hàng ngày 6 g/kg thể trọng chuột, tuy không ngăn ch n hoàn toàn được quá
23


tr nh xơ hóa, nhưng có tác dụng làm chậm quá trình tiến triển của xơ. Hàm lượng
collagen trong gan ở lô chuột dùng dịch chiết cà gai leo chỉ bằng 71% so với lô
chuột đối ch ng g y xơ không dùng thuốc. Về m t tổ ch c học, thí nghiệm cho thấy
toàn bộ chuột ở lô đối ch ng g y xơ đều bị xơ n ng ho c vừa, còn ở lô dùng cà gai
leo hầu hết chỉ xơ nhẹ ho c không xơ [18].
Gần đ y, nhiều tác dụng khác của cà gai leo được phát hiện như: kháng
viêm, c chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u. Viện Dược liệu (2001) đã
bào chế thành công thuốc "Haina" từ cà gai leo, đạt tiêu chuẩn cơ sở có hàm lượng
glycoalkaloid toàn phần trong mỗi viên từ 2,125 mg đến 2,875 mg tính theo

solasodine
s l s d

1.
1.3.2.1.1. ấ

o

con đường ch ển h

- Công th c tổng quát: C27H43NO2

Hình 1.1. C u trúc hóa h c c a solasodine

- Con đư ng chuyển hóa:
Sinh tổng hợp solasodine nói riêng hay spirosolane alkaloids nói chung có
liên quan mật thiết với sinh tổng hợp spirostane steroids có cùng cấu trúc vòng [61].
Nhóm spirosolane chỉ khác nhóm spirostane ở nguyên tử oxygen của vòng F
được thay bằng -NH. Một điểm cần chú ý là ở đ y có isomer ở C-22 (khác với
nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc S. laciniatum có cấu trúc (25R)
22 còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22.
Việc thêm nitrogen vào alkaloid xảy ra muộn trong con đư ng phát sinh sinh vật.
Điều này phổ biến khi tìm thấy trong cả solasodine và diosgenine hay chlorogenine
cùng nhau trong các loài thực vật. Tỷ lệ giữa diosgenine và solasodine trong lá của
S. laciniatum giới hạn trong khoảng 1:7 và 1:16 [61].
Con đư ng thông thư ng được chấp nhận của sinh tổng hợp steroid trong
thực vật được trình bày trong hình 1.2. Khởi đầu từ acetyl-CoA biến đổi thành
cholesterol thông qua con đư ng mevalonic acid. Những phản ng giả thiết trong
hình 1.6 cho thấy xuyên suốt quá trình nghiên c u những hợp chất này là một chất
trung gian teinemine. Teinemine có thể là một phần trong con đư ng sản xuất hai