THÔNG TIN TÓM TẮT VỀ NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN TIẾN SĨ
(Thông tin đưa lên trang Web)
Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria
monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong
một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201
Nghiên cứu sinh: Phùng Thị Thủy
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Lê Quang Hòa
2. PGS.TS. Tô Kim Anh
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
TÓM TẮT KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ
lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là
xúc xich và thịt hun khói cắt lát.
2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48
chủng L. monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và
lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn
lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV
và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16
ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch
lớn trên thế giới.
3. Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L. monocytogenes, bao gồm:
thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP là
nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M.
4. Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L. monocytogenes từ thực phẩm dựa trên
phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ lắc
150 vòng/phút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và
mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh
mẫu thực phẩm. Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU/25 g với tổng thời gian phân
tích 12-14 giờ.

average infection rate of L. monocytogenes in foods was 10.87% with the highest found in
sausage and slide meat products.
2. Forty eight strains out of 59 isolated of L. monocytogenes were divided into two lineages, of
which 40 isolates belonging to lineage I and 8 isolates belonging to lineage II. The lineage I
strains was considered high risky than those of the lineage II. On the other hand, the
isolates could be divided into 9 clonal clusters, among them 19 ECIV strains and one ECI
strain were seen as outbreak causing strains. The 48 isolates also can be divided into 16 ST,
of which ST1 strains were highly dangerous, causing many sever outbreaks worldwide.
3. A molecular method for rapid detection of L. monocytogenes based on LAMP reaction was
established: a set of LAMP primers was designed to amplify inlJ gene, optimal condition
for the reaction was 65 °C for 40-60 min. with betaine concentration of 0.9 M.
4. The direct detection procedure of L. monocytogenes based on the LAM reaction was
optimized, including enrichment for the bacteria in BLEB media at 37 °C, 150 rpm for 10
and 12 hours respectively for meat and dairy products; modified method for rapid DNA
extraction. The sensitivity of detection procedure attained 1 CFU L. monocytogenes /25 g
food with total analysis time of 12-14 hours.
7. A LAMP-L'MONO kit for L. monocytogenes rapid detection based on LAMP technique
was designed and validated and found to be conformed with ISO 11290-1: 1996 and
TCVN 7700 -1: 2007 methods.

Hanoi, 28th, March, 2016
Advisor:

Le Quang Hoa

PhD. Student

To Kim Anh

Phung Thi Thuy

-

Thiết kế, chế tạo thử nghiệm và kiểm định bộ sinh phẩm LAMP phát hiện nhanh L.
monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền.

 Đối tượng nghiên cứu:
-

Mẫu thực phẩm: Tổng số 543 được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội

-

Chủng vi khuẩn phân lập: Tổng số 48 chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực
phẩm đang lưu hành tại Việt Nam,

-

Chủng vi khuẩn chuẩn: 17 chủng vi sinh vật khác ngoài L. monocytogenes
Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng

5.


Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm




Điện di DNA trên gel agarose
Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các housekeeping gen cho

Xây dựng cây phân loại bằng phần mềm ClustalW
Các kết quả chính và kết luận

6.

 Các kết quả chính đã đạt được trong đề tài nghiên cứu:
- Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ
nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (lần lượt
là 30,34 % và 14,48 %).
Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48
chủng L. monocytogeneses phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và
lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn
lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV
và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST
trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn
trên thế giới.
- Đã Thiết kế được bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ với độ nhậy trên mẫu vi khuẩn
thuần là 16 CFU/ phản ứng, trên canh trường tăng mẫu xúc xích là 336 CFU/ml. Bộ mồi
cho độ đặc hiệu, độ bao trùm cao (100 % số chủng nghiên cứu)
- Đã tối ưu được điều kiện cho phản ứng LAMP đó là thực hiện phản ứng tại nhiệt độ
65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain là 0,9 M.
- Đã tối ưu được điều kiện tăng sinh cho phát hiện L. monocytogenes là: sử dụng môi
trường BLEB (17 g/l casein enzymeic hydrolysate; 3 g/l papaic digest of soyabean meal;
5 g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4, 2,5 g/l dextrose; 6 g/l cao nấm men;1,35 g/l KH2PO4; 9,6 g/l
Na2HPO4; pyruvate 1,2 g/l, nalidixic và acriflavin đều là 5 mg/l), tăng sinh ở 37oC tốc độ
lắc 150 vòng/ phút, thời gian 10 giờ (với sản phẩm thịt); 12 giờ (với sản phẩm sữa và
mayonair).
- Đã tìm được điều kiện tách chiết nhanh thu DNA cho phản ứng LAMP từ canh trường
tăng sinh mẫu thực phẩm đó là sử dụng đệm glycine –tris 100 mM pH 8,3, gia nhiệt 5
phút tại 95oC, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g trong 3 phút thu dịch DNA cho phản ứng

TS. Lê Quang Hòa

PGS.TS. Tô Kim Anh

Phùng Thị Thủy


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là
listeriosis. Đối tượng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thường là những người có hệ thống
miễn dịch bị suy yếu như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi. Nếu không được
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,
sẩy thai và tử vong.
Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi
như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật.
Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm
lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở
nhiệt độ lạnh (0-10oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes
trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài.
Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm
nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản
hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. Vì vậy, các sản
phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ
ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên kh p thế giới đã
được thông báo.
Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các
vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây



Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân
lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại
thực phẩm ăn liền dựa trên k thuật LAMP.

3. Những đóng góp mới của luận án



Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam
Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật
LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân
tích

4. Bố cục của luận án
Luận án bao gồm 123 trang trong đó có 2 trang mở đầu, 38 trang tổng quan, 9 trang
vật liệu và phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết quả.
NỘI DUNG CHÍNH
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

Tổng quan về L. monocytogenes.

Luận án đề cập đến các vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của loài L.
monocytogenes, từ đó cho thấy đây là một loài có khả năng phân bố rộng trong thực phẩm
môi trường. Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh
listeriosis do L. monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau

Mẫu thực phẩm

Mẫu được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội
Chủng vi sinh vật
Một số chủng vi khuẩn được lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học - Công
nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
Hóa chất
- Hóa chất cho phản ứng PCR, LAMP, Real time PCR, điện di DNA, tách chiết DNA, nuôi
cấy vi khuẩn
Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L. monocytogenes
Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP
2.2.

Các thiết bị sử dụng chủ yếu

Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và
lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm
 Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho
giải trình tự
 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch
GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
 Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại
dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst)
 Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen
được giải trình tự 2 chiều.
 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4
 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP
 Phản ứng Real-time PCR

A: T ng sinh trong môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu
đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu .
: Hình thái khuẩn lạc L. monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono các khuẩn lạc màu anh đen
không c halo màu vàng tương ứng v i các khuẩn lạc nghi ngờ là L. monocytogenes.

702 bp

Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định phân lập được
tr n môi trường RAPID’L.mono
: Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một
mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L. monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi
ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh
: thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TMcủa Fermentas

4


Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã
phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 3-1 sau.
Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam
trong khoảng thời gian từ 0

Loại thực phẩm

đến 0

Số lƣợng
mẫu thực
phẩm


Cá, tôm, cua, ốc

49

1

2,04

Bơ, sữa thanh trùng

45

1

2,22

Rau ăn sống

37

0

0

Sushi

52

1


Kết quả phân lập được 59 chủng L. monocytogenes, tuy nhiên trong quá trình giữ giống,
một số chủng phân lập được đã bị chết, những chủng còn lại được tăng sinh, tách chiết
DNA và tiến hành phản ứng PCR với các bộ mồi nhân 7 đoạn gen giữ nhà (housekeeping
gene). Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Dựa vào trình tự thu được, tra cứu các kiểu trình tự tương ứng với các đoạn gen. Tổ hợp
các kiểu trình tự của 7 đoạn gen tra cứu được kiểu trình tự (ST), các dòng phức hợp (clone
complex - CC) và các dòng giống (ligneage) tương ứng của chủng phân lập.
Tra cứu kiểu trình tự từng đoạn gen giữ nhà của 48 chủng L. monocytogenes phân lập được
trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen. Tổ hợp kiểu trình tự
7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và
thuộc một dòng giống. Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16
nhóm có kiểu ST khác nhau. Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình
tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã
từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới. Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô
5


hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000. Xây dựng được cây phân loại
như Hình 3-3.

Hình 3-3 Cây phân loại các nh m chủng L. monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm
Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L. monocytogenes phân
lập được từ thực phẩm Việt Nam
Chữ đen: Các chủng L. monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b
trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST

Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L. monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ
thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây
các vụ dịch lớn trên thế giới. Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt
với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại

1-FIP
1-BIP
2-F3
2-B3
2-FIP
2-BIP
3-F3
3-B3
3-FIP
3-BIP
4-F3
4-B3
4-FIP
4-BIP
5-F3
5-B3
5-FIP
5-BIP
6-F3
6-B3
6-FIP
6-BIP
7-F3
7-B3
7-FIP
7-BIP
8-F3
8-B3
8-FIP
8-BIP

GTCTTCTCCTTTGATGGGTTGAGG - ACGGAGCTATAGTAGGAACCGTA
TGGCGGATGATGAAGTTCTAAGC - CGCTAGAAGTATAAGGATCGTCCA
CATTACCACCCTTGATCTTAGC
AGGTTGTTAATTGAGTTTGTGG
TGTGAGTTTGTTCGTGTCG – CAAACCTTGACGTAACCCCGC
GCGCAACACCTTAACCGAAA – TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG

Lựa ch n bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t

Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số
tinh khiết của L. monocytogenes EGD-e với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng. Sau đó,
điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-4.

7


Hình 3-4. Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L.
monocytogenes
Trong đ
, , ,
, 7, ,
0, ,
, ,
, 0,
, ,
7, ,
, ,

: , , , : DNA chuẩn GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific)
: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0,

Tên
mồi
F3

CATTACCACCCTTGATCTTAGC

Vị trí thay đổi
CATTACTACTCTTGATCTTAGC

Số lƣợng
allele

Trình tự mồi sau thay
thế nucleotide suy biến

2

CATTACYACYCTTGATCTTAGC

1

CCACAAACTCAATTAACAACCT

2

CAAACCTTGAYGTAACCCCGC

CATTACCACCCTTGATCTTAGC
B3C



CGACACGAACAAACTCACA

B1

GCGCAACACCTTAACCGAAA

GCGCAACACCTTAACCGAAA
GCGCAACACCCTAACCGAAA

3.2.1.3.

2

GCGCAACACCYTAACCGAAA

T i ưu phản ứng LAMP

8


Ảnh hƣ ng của nhiệt độ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng
LAMP
Khảo sát đồng thời ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betaine đến hiệu quả khuếch đại
của phản ứng LAMP. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-5.
Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9
M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3-5 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP.
Trong đ :

Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 và 0,2
pg phản ứng; thời gian ủ là 45, 60, 75 phút. Sau đó, điện di 3 l lượng sản phẩm LAMP
trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 3-6 dưới đây:

Hình 3-6 nh hư ng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP
Trong đ :
: DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);
: Sản phẩm LAMP sau 7 ph t lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 pg phản ứng
, , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t

9


Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số
4). Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối
ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M.
3.2.1.4. Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP
Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L. monocytogenes. Kết quả
điện di sản phẩm LAMP (Hình 3-7) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA
của các chủng thuộc loài L. monocytogenes là 100%.

Hình 3-7 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L. monocytogenes
Trong đ :
: Thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific);
: Mẫu kiểm chứng âm t nh
, , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC
19117, L. monocytogenes EGD-e, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes
DSM20750;
đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm


của chủng L. monocytogenes EGD-e
8: Mẫu âm t nh
: Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific .

0 fg

fg

fg 1, fg DNA

Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN
Trong đ :
7,6,5,4,3 Ống phản ứng LAMP v i l n lượt 0 fg

fg

fg

fg

fg

u

hu g L. monocytogenes

EGD-e

Kết quả trên cho thấy độ nhạy của hai phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP nghiên cứu
tương đương nhau.

Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói trong các môi trường cơ bản khác nhau. Sau 16 giờ
nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR. Đánh giá khả năng tăng
sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng real-time PCR, kết quả được thể
hiện trên Bảng 3-4 sau:
Bảng 3-4

nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L. monocytogenes trong
canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm

Loại
môi
trƣ ng
cơ bản

TSBYE TSBYE
có
không
Kháng
có
sinh
kháng
sinh

BLEB
có
kháng
sinh

BLEB
không

± 1,20

15,71
± 1,52

23,94
± 0,97

14,26
± 1,16

21,47
± 2,01

18,29
± 1,45

25,77
± 1,78

24,57
± 1,13

12


Kết quả cũng cho thấy môi trường HF và BLEB cho giá trị Ct thấp nhất và gần ngang
nhau. Trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích trên môi
trường BLEB với nồng độ kháng sinh như ở môi trường Half Fraser (acriflavin và nalidixic
acid lần lượt là 12,5 mg l và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 3-5.


Tăng sinh với lượng giống ban đầu 3 x 104 CFU ml. Sau 4 giờ nuôi, đo độ đục canh
trường ở bước sóng 600 nm.
Từ kết quả Hình 3-13, nồng độ cao nấm men 6 g l được chọn cho các thí nghiệm tiếp
theo.
Ảnh hưởng của nồng độ pyruvate đến sinh trưởng phát triển của L. monocytogenes

Nhiễm chủ động L. monocytogenes vào môi trường BLEB có bổ sung pyruvate với
nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm là 2,7 x 102 CFU ml, sau 3 giờ nuôi, lấy canh
trường đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 600 nm. Kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn đạt
cao nhất là tại giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 và 1,4 g l. Qua thí nghiệm này chúng tôi lựa
chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB là 1,2 g l.
3.2.2.3.

nh hư ng của nalidi ic acid và acriflavin đến sự sinh trư ng của L.
monocytogenes

Vi khuẩn được nuôi trong những môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau 4
giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu được kết quả như Hình 3-14 sau:
13


Hình 3-13 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidi ic đến sự sinh trư ng của L.
monocytogenes trong môi trường LE

canh trường thu n

Khi nồng độ hai loại kháng sinh trên giảm xuống 5 mg l, thì sự sinh trưởng của L.
monocytogenes là tương đương với mẫu không có kháng sinh (sự sai khác không có ý
nghĩa). Do vậy, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành xem xét khả năng ức chế

Không kháng sinh

0,116

0,373

0,653

0,655

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,116

0,105

0,096

0,231

Acriflavin (5 mg/l)

0,124

0,144

0,138

0,138


Nadilixic (10 mg/l)

0,121

0,134

0,071

0,109

Không kháng sinh

0,031

0,596

2,357

4,5

Acriflavin (2,5 mg/l)

0,03

0,039

0,034

0,045


0,038

Nadilixic (5 mg/l)

0,025

0,042

0,036

0,037

Nadilixic (10 mg/l)

0,025

0,036

0,036

0,047

Không kháng sinh

0,144

ND

2,254



0,137

ND

0,162

0,131

Nadilixic (2,5 mg/l)

0,118

ND

0,541

0,943

Nadilixic (5 mg/l)

0,117

ND

0,142

0,055

Nadilixic (10 mg/l)

(5 mg/l)

(10 mg/l)

22,7 ± 1,04

26,17 ± 1,17

Ct

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Kết quả trên thêm một lần nữa kh ng định ở nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng
tăng sinh L. monocytogenes tốt hơn so với nồng độ kháng sinh 10 mg l.
3.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA
Tro g ội du g ày á phươ g pháp tá h hiết
đượ đá h giá thô g qu giá trị
Ct ủ phả ứ g re l-time PCR, giá trị Ct à g hỏ hiệu suất tá h hiết
à g lớ .
3.2.3.1. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng triton X 00 kết
o
hợp si u âm và gia nhiệt
C
Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần
lượt thay đổi từng yếu tố: Nồng độ triton X100 trong đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian
gia nhiệt ở 95 °C (2-15 phút); thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa
DNA cho phản ứng Real-time PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau.
Bảng 3-8 nh hư ng của nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes.



2

5

10

15

15,92± 0,51

15,56 ± 1,04

15,61 ± 1,12

15,73 ± 0,75

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

Bảng 3-10 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00.

Th i gian siêu âm
(phút)

Không
siêu âm

0,5


o
si u âm và gia nhiệt
C

Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần
lượt thay đổi từng yếu tố: thời gian gia nhiệt ở 95 °C (5-20 phút); nồng độ NaOH (10mM 200mM), thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng
Real-time PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau.
Bảng 3-11 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.

Th i gian (phút)

5

10

15

20

Ct

21,53 ± 1,12

21,86 ± 0,45

21,13 ± 1,21

21,89 ± 1,04


0,52

20,79 ±
0,91

20,37 ±
0,85

Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn

16


Bảng 3-13 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.

Th i gian siêu âm (phút) 0
Ct

20,72
± 1,12

0,5

1

2

3



Thí nghiệm được thực hiện với mẫu xúc xích được nhiễm chủ động, tách chiết theo 4
phương pháp tách chiết DNA(3 phương pháp tách chiết ở trên và phương pháp tách chiết
thông thường có sử dụng dung môi hữu cơ) thực hiện phản ứng Real-time PCR. Kết quả
trình bày tại Hình 3-16 sau.

17


33

Ct
30
27
24
21
18
15
NaOH

Tri ton

Ki t

Thông thường

Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh
mẫu

c ch khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET

sinh mẫu

c ch khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH 8,3 và Triton
X 100

Từ kết quả trên phương pháp tách chiết được lựa chọn trong nghiên cứu này là sử dụng
đệm glycine 100 mM, pH 8,3 gia nhiệt 95 oC trong 5 phút, siêu âm 2 phút.
3.2.3.5.

nh hư ng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP

Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn 6 CFU/25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho
phản ứng real-time PCR và LAMP. Kết quả thể hiện ở Bảng 3-14 sau:
Bảng Error! No text of specified style in document.-14 nh hư ng của thể t ch mẫu canh
trường t ng sinh được sử dụng đến khả n ng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và
real-time PCR

Thể tích mẫu (ml)
Real time PCR

1

10
ức chế

+

20

30

+

+

+

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thể tích mẫu lấy đi phân tích là 10 ml
3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP tr n các nền mẫu khác nhau
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14
giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP. Kết quả thể hiện trên Hình 319

19


Hình 3-17 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L.
monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ
Trong đ :
(- Mẫu âm t nh phản ứng LAMP
, , : L n lượt là mẫu c ch, mẫu mayonair và mẫu sữa không nhi m L. monocytogenes.
, , : L n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh 0, , giờ. 7, , : l n lượt là mẫu
c ch nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh 0, , giờ.
0, : L n lượt là mẫu mayonair nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh , giờ.
, : L n lượt là mẫu sữa nhi m chủ động CFU
g, t ng sinh , giờ

Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt là ≥ 10 giờ, cho mẫu
sữa và mayonair là ≥ 12 giờ.