MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................. 3
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………………………………………14
1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................... 16

1.1
1.1.1

Listeria monocytogenes .................................................................................................... ……16
Đặc điểm L. monocytogenes .......................................................................... 16

1.1.2. Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes……20
1.1.3

Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L. monocytogenes .. 23

1.1.4

Quy định kiểm soát L. monocytogenes .......................................................... 24

1.2

Dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes ....................................................................... 25

1.2.1

Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes ..................... 25

1.2.2


1.3.1.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình tăng sinh........................35
1.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tăng sinh..............................................37
3


1.3.1.3. Ảnh hưởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh...................................37
1.3.1.4. Ảnh hưởng của thành phần vi sinh vật đồng nhiễm trong mẫu .........................38
1.3.2

Phƣơng pháp miễn dịch ................................................................................. 40

1.3.3

Phƣơng pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR).................................. 41

1.4. Kỹ thuật nhân gen đẳng điện tạo cấu trúc vòm (LAMP)……………………… .43
1.4.1

Nguyên tắc của kỹ thuật LAMP .................................................................... 43

1.4.2

Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP ................................................................ 45

1.4.3.

Phát hiện sản phẩm LAMP.............................................................................46

1.4.4.

2.3.3 Phản ứng PCR ……………………………………………………………………....57
2.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen…………………………………….58
2.3.5 Phân loại các kiểu trình tự ST……………………………………………………….59
2.3.6 So sánh trình tự 7 đoạn gen của các chủng phân lập đƣợc với một số chủng trên ngân
hàng dữ liệu………………………………………………………………………………..59
2.3.7. Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP………………………………….……………..59
2.3.8. Lựa chọn mồi LAMP………………………………………………………………59
2.3.9. Tối ƣu hóa phản ứng LAMP …………………………………………………..…..59
2.3.10. Điện di DNA………………………………………………………………………60
4


2.3.11. Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP……………………….60
2.3.12. Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP………………………………………….60
2.3.13. Xây dựng quy trình tăng sinh L. monocytogenes nhanh…………………………60
2.3.14. Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA của L. monocytogenes……………….62
2.3.15. Xây dựng quy trình phân tích L. monocytogenes trên mẫu thực phẩm………….63
2.3.16 Kiểm định bộ sinh phẩm…………………………………………………………..64
2.3.17 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm………………………………………………64
3

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 66

3.1
. Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập
từ một số thực phẩm Việt Nam ............................................................................................................. 66
3.1.1

Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm ....................................... 66


3.2.2.4 Thử nghiệm tăng sinh trên mẫu thực phẩm.......................................................98
3.2.3
Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA ........................................................... 100

5


3.2.3.1. Khả năng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng Triton X100 kết
hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95 oC................................................................................99
3.2.3.2. Khả năng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp
siêu âm và gia nhiệt ở 95 oC.......................................................................................101
3.2.3.3. So sánh các phương pháp tách chiết nghiên cứu đối với canh trường L.
monocytogenes thuần.................................................................................................103
3.2.3.4. Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đối với mẫu thực phẩm
tăng sinh.........................................................................................................104
3.2.3.5. Ảnh hưởng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP..............106
3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP trên các nền mẫu khác nhau..............................107
3.2.4

Đề xuất quy trình phân tích ......................................................................... 110

3.2.5

Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình ...................................................... 111

3.2.6. Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L.
monocytogenes……………………………………………………………………………...112
3.2.6.1. Thiết kế bộ sinh phẩm.....................................................................................112
3.2.6.2. Sản xu t thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO.......................................114
3.2.7. Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………………………116

Đa hình chiều dài các đoạn DNA

University
of
Enrichment Broths

Vermont

Môi trƣờng chọn lọc Listeria có
chỉ thị màu đƣợc phát triển bởi
Ottaviani và Agosti
Môi trƣờng tăng sinh UVM
Môi trƣờng tăng sinh BLEB

BLEB
Buffered
Broth

Listeria

Enrichment

HF

Half Fraser Broth

Môi trƣờng Half Fraser

aw



Axit Deoxyribonucleic

dNTP

Deoxynucleotide

Deoxynucleotide

EDTA

Ethylen Diamine Tetraacetic Acid

Axit Ethylen Diamine Tetraacetic

EtBr

Ethidium Bromide

Ethidium Bromide

ISO

Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn
hóa
Bộ Nông nghiệp và dịch vụ kiểm
soát an toàn thực phẩm Mỹ

kDa


Hiệp hội các nhà hoá phân tích
chính thống
Kilo Dalton

7


Amplification

trúc vòm

MLST

Multi-virulence-locus sequence
typing
Multi-locus sequence typing

PBS

Phosphate Buffered Saline

Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus gen gây độc
Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus
Đệm muối phosphate

PCPLC
PCR



TE

Tris - EDTA

Tris - EDTA

PA

Positive agreement

Tƣơng đồng về mẫu dƣơng tính

NA

Negative agreement

Tƣơng đồng về mẫu âm tính

ND

Negative deviation

Sai khác về mẫu âm tính

PD

Positive deviation

Sai khác về mẫu dƣơng tính

giới hạn
Khuếch đại các trình tự lặp

MOX

Modified Oxford Agar

Môi trƣờng Oxford Agar cải biến

MLVA

Multiple-locus variable number of
tandem repeat analysis
Pulsed-field gel electrophoresis

Phân tích vùng lặp đối xứng của
nhiều locus
Điện di xung trƣờng

MVLST

PFGE
MLEE

Multilocus
electrophoresis typing

CC

Clones complex


TSBYE

Tryptic Soy Broth Yeast Extract

Môi trƣờng dịch chiết nấm men
và trypton từ đậu tƣơng

numbers

of

tandem Đa hình các đoạn DNA chứa
vùng lặp đối xứng

9


DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes ..................................................................... 16
Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người ........................... 19
Hình 1-3. C u tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe ............................ 21
Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ . ........................................................................................ 23
Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L. monocytogenes 1340 và chủng L.
innocua11288 trong canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, môi trường
được sử dụng là TSBYE ........................................................................................................... 39
Hình 1-6 Mô hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L. monocytogenes
............................................................................................................................................................... 40
Hình 1-7 Nguyên tắc kỹ thuật LAMP .......................................................................................... 44
Hình 1-8 Các phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP ....................................................... 46

Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường
tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X100, sinh
phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết
thông thường ..............................................................................................................................105
Hình 3-17 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường
tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH
8,3 và Triton X 100 ..................................................................................................................107
Hình 3-18 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến
khả năng khuếch đại đoạn gen inlJ của phản ứng LAMP...........................................108
Hình 3-19 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L.
monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ .................................110
Hình 3-20 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes được phát triển trong
nghiên cứu này ..........................................................................................................................111
Hình 3-21 Kết quả thử nghiệm quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes dựa trên
kỹ thuật LAMP ...........................................................................................................................113
Hình 3-22 Hình ảnh bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO .........................................................114
Hình 3-23 Sơ đồ qui trình sản xu t bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh L.
monocytogenes trong thực phẩm .........................................................................................116
11


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1 Đặc tính sinh hóa của các loài thuộc chi Listeria ............................................... 17
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của
Listeria .......................................................................................................................................... 18
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011
đến 2015 ....................................................................................................................................... 23
Bảng 1-4 Ảnh hưởng của một số ch t nhiễm tạp đến phản ứng LAMP và PCR .......... 52
Bảng 1-5 Các ch t ức chế phản ứng PCR thường gặp trong một số loại thực phẩm và
biện pháp loại bỏ ....................................................................................................................... 53

monocytogenes trong môi trường BLEB có bổ sung cao n m men, pyruvate và với
sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong mẫu xúc xích ........................................................100
Bảng 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ Triton X100 đến khả năng tách chiết DNA thể gen
L. monocytogenes. ....................................................................................................................101
Bảng 3-15 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA thể gen
L. monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 ..............................................101
Bảng 3-16 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến khả năng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 . .................................................102
Bảng 3-17 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA thể gen
L. monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. ........................................................102
Bảng 3-18 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khả năng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes. .........................................................................................................................103
Bảng 3-19 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến khả năng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. .............................................................104
Bảng 3-20 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến khả
năng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và real-time PCR ............107
Bảng 3-21 Độ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP ........112
Bảng 3-22 Kết quả kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L.
monocytogenes ..........................................................................................................................117
Bảng 3-23 Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L.
monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội ..119
13


MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra đƣợc gọi chung là
listeriosis. Đối tƣợng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thƣờng là những ngƣời có hệ thống
miễn dịch bị suy yếu nhƣ trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, ngƣời lớn tuổi. Nếu không đƣợc
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,



đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích. Kỹ thuật này đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng
để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới.
Ở Việt Nam, phƣơng pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện L. monocytogenes là
phƣơng pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc khẳng định bằng các phản ứng
sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phƣơng pháp PCR và que thử sắc ký miễn dịch
nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về
trang thiết bị hóa chất nên chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản
xuất.
Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế
tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ
học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị
trường Việt Nam”.
Luận án này tập trung vào hai mục tiêu chính sau:



Phân tích đƣợc đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân
lập đƣợc từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
Xây dựng đƣợc một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại
thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP.

Trong nghiên cứu này đối tƣợng nghiên cứu là L. monocytogenes. Phạm vi nghiên cứu tập
trung phát triển phƣơng pháp phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm
dựa trên kỹ thuật LAMP. Qui trình phân tích cần tối ƣu sao cho đơn giản, chính xác, tiện
lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm soát chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm. Bên cạnh đó
việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm cũng
giúp chúng ta thấy đƣợc hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dòng L. monocytogenes
hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam. Từ đó có thể giúp các nhà

ngƣời và động vật trong khi đó L. ivanovii chủ yếu gây bệnh cho động vật và hiếm khi thấy
chúng gây bệnh cho ngƣời [157].
1.1.1. Đặc điểm L. monocytogenes
Đặc điểm hình thái
Listeria monocytogenes là trực khuẩn Gram dƣơng, tế bào có dạng hình que, trong một số
điều kiện nhất định chúng có thể ở dạng hình cầu. Bề mặt tế bào có các lông roi nên giúp
L. monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trƣờng [157].

Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes [85]
Đặc tính sinh trưởng
Listeria monocytogenes là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, chúng có khả năng sinh trƣởng
trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và thậm chí trong điều kiện chân không.
L. monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện nhiệt độ từ - 4 tới 50°C, nhiệt độ tối
ƣu cho sự sinh trƣởng của chúng là 30-37°C. Nhiệt độ dƣới 0°C sẽ gây ức chế sự phát triển
của L. monocytogenes [157]. Listeria monocytogenes có thể phát triển trong khoảng pH từ
16


4,5 tới 7, sinh trƣởng tốt nhất ở giá trị pH 7. Trong dạ dày, chúng có thể tồn tại một khoảng
thời gian ở điều kiện pH 2,0 - 2,5. Hoạt độ nƣớc (aw) thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát
triển của L. monocytogenes từ 0,97 trở lên. Tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trƣởng
trong điều kiện aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại trong một thời gian
dài ở aw rất thấp [157]. Listeria monocytogenes sinh trƣởng mạnh trong môi trƣờng có
nồng độ muối vừa phải (6,5%), tuy nhiên nó vẫn có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng
có nồng độ muối khá cao 10-12%, nhờ có các gen đáp ứng stress nhƣ betL, gbuABC, opuC,
opuB, lmo1421 và bsh [109].
Đặc tính sinh hoá
Listeria monocytogenes có khả năng lên men nhiều loại đƣờng và không sinh khí H2S.
Trong 6 loài thuộc chi Listeria chỉ có L. monocytogenes và L. seeligeri có phản ứng CAMP
dƣơng tính với Staphylococcus aureus và âm tính với Rhodococcus equi trong khi đó, L.


+

+

Phản ứng oxidase

-

-

-

-

-

-

Khả năng đồng hóa urea

-

-

-

-

-


Phản ứng CAMP (S. aureus)

+

-

-

-

+

-

Phản ứng CAMP (R. equi)

-

+

-

-

-

-

L-rhamnose



β-methyl-D-mannoside

+

-

+

+

-

+

Mannitol

-

-

-

-

-

+


+: 90% số chủng cho phản ứng dương tính
d: 11-89% số chủng cho phản ứng dương tính

Đặc tính kháng nguyên
Chi Listeria có hai loại kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, đó là kháng nguyên tế bào
(somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H. Kháng nguyên O có 15 loại (I đến
XV) còn kháng nguyên H có 4 loại (A đến D). Đây là cơ sở để phân loại các kiểu huyết
thanh của chi Listeria (Bảng 1-2)
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của Listeria
[176]

Kiểu
thanh
1/2a

huyết Kháng nguyên O

Kháng nguyên H

I, II

A, B

1/2b

I, II

A, B, C

1/2c


V, VI

A, B, C

4c

V, VII

A, B, C

4d

(V), VI, VIII

A, B, C

4e

V, VI, (VIII), (IX)

A, B, C

7

XII, XIII

A, B, C

5

giúp đỡ của một nhóm các protein bề mặt đƣợc gọi là các internalin [70]. Đến nay, các nhà
khoa học đã phát hiện đƣợc 8 loại internalin ở L. monocytogenes (A, B, C, E, F, H, I, J),
chúng khác nhau ở cấu tạo và chức năng. Trong đó internalin J (inlJ) là một trong những
protein bề mặt đƣợc xác định liên quan trực tiếp tới tính độc của L. monocytogenes.

Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người [109]
Trong đó:
1: L. monocytogenes xâm nhập vào cơ thể thông qua thức ăn vào dạ dày
2: L. monocytogenes xâm nhập vào tế bào chủ ở thành ruột
3-8: L. monocytogenes sinh trƣởng trong tế bào chủ và di chuyển đến các tế bào lân cận

Ngƣời bị mắc bệnh listeriosis, ban đầu sẽ có các triệu chứng giống nhƣ bị cúm nhƣ sốt và
đau mỏi cơ đôi khi có hiện tƣợng tiêu chảy. Sau đó, vi khuẩn có thể xâm nhập đến các cơ
quan khác nhƣ vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu, vào não bộ gây viêm màng não,
đến tử cung gây nhiễm trùng cổ tử cung có thể gây sẩy thai hoặc chết lƣu. Những tổn
thƣơng này có thể dẫn đến chết ngƣời. Tỷ lệ chết do bệnh listeriosis trên ngƣời là khoảng
20-40% [109]. Khả năng mắc bệnh tùy thuộc nhiều yếu tố nhƣ bản thân hệ miễn dịch của
ngƣời bệnh, liều nhiễm, chủng vi khuẩn bị nhiễm. Thƣờng những ngƣời có hệ miễn dịch
kém nhƣ trẻ nhỏ, ngƣời già, ngƣời mắc các bệnh suy giảm miễn dịch (lao, HIV, ung thƣ,
cấy ghép nội tạng, ...) và phụ nữ có thai có khả năng mắc bệnh cao hơn các đối tƣợng khác
19


[109]. Liều nhiễm có khả năng gây bệnh phụ thuộc rất nhiều vào chủng vi khuẩn, có những
chủng độc có khả năng gây bệnh ở liều gây chết trung bình thấp (LD 50 thấp), ngƣợc lại có
chủng ít độc hơn với LD 50 cao hơn [78]. Thử nghiệm liều gây nhiễm qua thực phẩm trên
khỉ cho thấy khi nhiễm 109 tế bào L. monocytogenes, khỉ có dấu hiệu bệnh rõ ràng với triệu
chứng ở gan, dễ bị kích thích, ăn mất ngon và tiêu chảy [78]. Với ngƣời bình thƣờng, khi
sử dụng 50-100 g thực phẩm với mật độ nhiễm ≥ 10 3-10 4 CFU/g là có nguy cơ rõ rệt về
bệnh listeriosis [62].

dẫn đƣờng này sẽ đƣợc phân cắt bởi transpeptidase có tên sortase A (SrtA) tại vị trí giữa
axít amin threonin (T) và axít amin glycin (G) của đoạn trình tự peptid LPXTG. Sau đó
nhóm –COOH của threonin sẽ gắn với các tiền chất của lớp thành tế bào [25].
Các internalin nhóm II bao gồm 2 thành viên (Hình 1-3) là inlB và Lmo0549 có chung đặc
điểm là đầu cuối C có khả năng tƣơng tác với vách tế bào của L. monocytogenes nhờ các
20


liên kết phi cộng hóa trị. Đối với inlB, vùng tƣơng tác với vách tế bào là các đoạn lặp GW
(bao gồm 3 vùng lặp đƣợc bắt đầu bởi một dipeptid có trình tự Glycin (G) – Tryptophan
(W)). Trong khi đó đối với Lmo0549 thì vùng tƣơng tác với vách tế bào đƣợc cho là do
vùng WxL quy định [25].
Nhóm internalin cuối cùng bao gồm các protein có kích thƣớc nhỏ đƣợc tiết ra bên ngoài
môi trƣờng mà điển hình nhất là inlC [25].

Hình 1-3. C u tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe [25]
(I): internalin với motif LPXTG;
(II): internalin GW hoặc WxL;
(III): internalin được tiết ra môi trường;
Các vùng trình tự tương đồng được đánh d u cùng màu với chú thích các vùng ở bên phải; các chữ số trong
các hộp màu chỉ số lượng các trình tự lặp.

Chức năng của các internalin trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes ở ngƣời đƣợc
phát hiện lần đầu tiên là ở inlA. Loại internalin này nhận biết và xâm nhiễm vào tế bào
biểu mô ở ruột thông qua tƣơng tác đặc hiệu với E-cadherin (Ecad) vốn là một protein
xuyên màng tế bào cần thiết cho quá trình kiến tạo vùng tiếp giáp bám dính ở lớp tế bào
biểu mô. Ở tế bào động vật, tùy thuộc vào nồng độ Ca2+, các phân tử Ecad có khả năng
tƣơng tác với nhau thông qua đầu N ngoại bào, trong khi đó vùng nội bào của Ecad sẽ
tham dự vào quá trình hình thành bộ khung tế bào (cytoskeleton) nhờ liên kết với các
catenin để tạo vùng tiếp giáp bám dính giữa các tế bào. Khi inlA tƣơng tác với Ecad sẽ

các loài Listeria khác nhƣ L. ivanovii và L. seeligeri [148]. Do vậy, các phƣơng pháp phát
hiện dựa trên gen mục tiêu hly có nguy cơ mắc phải hiện tƣợng dƣơng tính giả đặc biệt là
khi mật độ vi khuẩn L. ivanovii và L. seeligeri trong mẫu thực phẩm lớn. Từ đây, có thể
nhận thấy rằng việc lựa chọn gen inlJ nhƣ là gen mục tiêu trong các phƣơng pháp sinh học
phân tử sẽ cho phép loại bỏ đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính giả cũng nhƣ nâng cao đƣợc độ
nhạy của phƣơng pháp do không bị bó buộc trong việc lựa chọn các trình tự mồi đặc hiệu
cho L. monocytogenes.

22


Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ [165].
Đoạn peptid tín hiệu đầu N đƣợc in đậm ở đầu trình tự; tiếp theo là trình tự của 15 đoạn lặp LRR, các axit
amin leucin, isoleucin, và valin đƣợc bôi nền đỏ và cystein đƣợc bôi nền màu xanh dƣơng, các vùng bảo thủ
khác in bằng chữ màu; vùng có cấu trúc tƣơng tự Ig (Ig-like)đƣợc bôi nền màu xám; 4 vùng lặp MucBP với
các trình tự bảo thủ đƣợc in đậm; đoạn trình tự peptid LPXTG ở đầu C đƣợc gạch chân, trình tự kỵ nƣớc
đƣợc in chữ nghiêng.

1.1.3. Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L. monocytogenes
Theo các số liệu thống kê trong giai đoạn từ 1996 đến 2000, hơn 60% các vụ triệu hồi thực
phẩm ở Mỹ có nguyên nhân là do nhiễm L. monocytogenes [109]. Một loạt các thực phẩm
nhiễm L. monocytogenes đã gây ra các vụ bùng phát dịch listeriosis ở Bắc Mỹ và Châu Âu
nhƣ coleslaw, sữa, phomat mềm, pate, xúc xích, tôm, cá, … [109]. Theo số liệu thống kê
của CDC, hàng năm ở Mỹ có khoảng 1.600 ngƣời bị bệnh và 260 ngƣời chết do listeriosis
[170]. Tính theo tỷ lệ thì hàng năm cứ 100.000 ngƣời thì có 0,26 ngƣời mắc listeriosis
hàng năm [52]. Nếu so với giai đoạn 1996-1998 thì tỷ lệ ngƣời mắc bệnh listeriosis năm
2012 đã giảm 42 %. Tuy nhiên nếu so với giai đoạn năm 2006-2008 thì con số này năm
2012 không hề giảm [40]. Một số các vụ bùng phát dịch bệnh listeriosis gần đây tại Mỹ
đƣợc thống kê trong Bảng 1-3 dƣới đây.
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015

Phomat Ricotta

22

20

4

14 bang

2013

Phomat

6

6

1

5 bang

2011

23


2014

Pho mat


2 bang

2014

Táo Caramel

35

34

7

12 bang

2015

Kem

10

10

3

4 bang

Ở châu Âu, một loạt các nƣớc đã có thông báo về dịch bệnh do L. monocytogenes. Năm
2006 có 23 quốc gia thuộc cộng đồng chung châu Âu có thông báo về các trận dịch
listeriosisvới tổng số 1583 ngƣời mắc bệnh. Trong đó Đức, Pháp, Anh là những quốc gia



Quy chuẩn về giới hạn nhiễm L. monocytogenes trong thực phẩm cho các nƣớc Châu Âu,
Mỹ hiện nay là 0 CFU/25 g, ml [86].
Ở Việt Nam, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, tiêu chuẩn về L. monocytogenes nằm
trong chỉ tiêu “không có vi sinh vật gây bệnh” tức là 0 CFU/25 g. L. monocytogenes đƣợc
kiểm soát trong tiêu chuẩn ngành thủy sản đối với thủy hải xuất khẩu sang châu Âu và Mỹ.
Theo Quyết định số 2670 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn cấp ngày
29/8/2008 về việc “Công bố danh mục các chỉ tiêu chỉ định kiểm tra đối với l6 hàng thủy
sản”, chỉ tiêu L. monocytogenes quy định giới hạn phát hiện là 0 CFU/25 g đối với hầu hết
các loại sản phẩm thủy sản. Với qui định kiểm soát này, các phƣơng pháp phân tích phát
hiện cần đáp ứng đƣợc độ nhạy tối thiểu là 1 CFU/25 ml, g (khi lƣợng mẫu lấy là 25 g,
ml).

1.2. Dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes
Dịch tễ học phân tử là lĩnh vực nghiên cứu có sự kết hợp giữa sinh học phân tử, thống kê
và dịch tễ. Dịch tễ học phân tử xác định đặc điểm của các gen ở mức độ phân tử và xác
định phân bố của các kiểu gen trong quần thể. Từ đó mô tả mối tƣơng quan giữa các kiểu
gen và khả năng gây bệnh, gây dịch của các chủng nghiên cứu. Dịch tễ học phân tử L.
monocytogenes đã đƣợc nghiên cứu nhiều trên thế giới. Tuy vậy ở Việt Nam, cho đến nay,
chƣa có công bố nào sử dụng các kỹ thuật phân tử trong phân loại, xác định đặc điểm phân
tử các chủng L. monocytogenes để đánh giá khả năng gây bệnh, gây dịch của loài vi khuẩn
nguy hiểm này trên thực phẩm cũng nhƣ trên bệnh phẩm.
1.2.1. Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes
Các phƣơng pháp phân loại dựa trên kiểu gen chia L. monocytogenes thành 4 dòng giống
chính, gồm dòng giống I, II, III và IV. Các dòng này khác nhau về hệ sinh thái chúng
thƣờng tồn tại, tỷ lệ tái tổ hợp và hệ gen [45] . Dòng giống I có các kiểu huyết thanh 1/2b,
3b, 3c và 4b là dòng thƣờng gây ra các vụ dịch bệnh listeriosis ở nhiều nƣớc trên thế giới.
Dòng giống II có các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2c và 3a, là dòng chủ yếu đƣợc phân lập từ
thực phẩm, nhà máy thực phẩm, môi trƣờng và nông trại. Trong khi đó dòng giống III và

khả năng gây độc lớn hơn so với các CC không gây ra các vụ dịch bệnh khác, cụ thể là các
EC này có chứa các trình tự gen gây độc mà các CC khác không có. Mặc dù giả thuyết này
đã đƣợc thử nghiệm bởi nhiều nghiên cứu khác nhau, tuy nhiên không thu đƣợc kết quả
cuối cùng [45]. Giả thuyết thứ hai có thể giải thích một số EC có khả năng gây dịch bệnh
qua thực phẩm thƣờng xuyên hơn là do nó có khả năng tồn tại trong môi trƣờng chế biến
thực phẩm trong khoảng thời gian dài. Giả thuyết này đã đƣợc chứng minh bằng thực tế
khi phân lập thấy chủng thuộc ECIII tồn tại trong cùng một nhà máy chế biến thực phẩm
trong khoảng 11 năm [95]; [198]. Một giả thuyết nữa cho rằng có thể các EC gây dịch cao
là những EC có liều gây bệnh thấp hơn các CC khác, nên chỉ cần nhiễm ở mật độ thấp thì
ngƣời mang mầm bệnh đã phát bệnh và khi đó EC này có khả năng gây bệnh dịch cao [45].
1.2.3. Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L. monocytogenes
Những số liệu thống kê cho thấy những trận dịch do L. monocytogenes gây ra có liên quan
đến một số kiểu huyết thanh nhất định. Hầu hết các ca gây bệnh trên ngƣời do vi khuẩn
này đều thuộc ba kiểu huyết thanh 4b, 1/2a, 1/2b [66]; [125]; [174]; [175]. Kiểu huyết
thanh 4b thƣờng đƣợc phân lập từ các vụ bùng phát dịch listeriosis [38]. Kiểu huyết thanh
4b gây ra phần lớn các vụ dịch listeriosis trên ngƣời tại Anh [125]. Trong giai đoạn từ
1976- 1985, 70% số ca listeriosis ở ngƣời tại Thụy Điển gây ra bởi các chủng thuộc kiểu
huyết thanh 4b [65]. Trong khi đó, các chủng phân lập từ thực phẩm, chủ yếu thuộc kiểu
huyết thanh 1/2 [66]; [113]. Các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b trƣớc đây thƣờng đƣợc phát
hiện trong các trƣờng hợp nhiễm bệnh rải rác [183]; [200]. Đây cũng là kiểu huyết thanh
thƣờng phân lập đƣợc từ những ngƣời bị nhiễm trùng huyết hoặc sẩy thai [115]. Các công
26


bố gần đây cho thấy sự phân bố của các kiểu huyết thanh đã thay đổi. Rất nhiều các chủng
thuộc kiểu huyết thanh 1/2 đã đƣợc phân lập trên ngƣời [76]; [126]; [114]. Cụ thể là trong
giai đoạn từ 1986-1999, tại Thụy Điển 45% các chủng phân lập từ ngƣời thuộc kiểu huyết
thanh 4b, 44% thuộc kiểu huyết thanh 1/2a và 10% số chủng thuộc kiểu huyết thanh 1/2b
và 1/2c. Vụ dịch xảy ra tại Bỉ năm 2011 do sản phẩm pho mát, làm 12 ngƣời mắc bệnh
listeriosis là do kiểu huyết thanh 1/2a [205]. Cùng năm đó vụ dịch tại Mỹ do dƣa đỏ làm

thuật PFGE, dƣới tác dụng của dòng điện xoay chiều, các đoạn DNA di chuyển qua lại,
27