LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu, kết quả,
hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất
cứ công trình của tác giả nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn
Nghiên cứu sinh
Phùng Thị Thủy
1
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS. Tô Kim
Anh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà
Nội đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để
tôi hoàn thiện Luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, đồng nghiệp của tôi trong Viện Công
nghệ Sinh học Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình
nghiên cứu luận án và trong cuộc sống hàng ngày. Xin chân thành cảm ơn
Ths. Nguyễn Thành Trung, Viện Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm đã giúp đỡ
tôi khi tôi thực hiện một phần luận án tại Viện. Xin chân thành cảm ơn Ths.
Nguyễn Thành Đông, Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội đã giúp đỡ tôi khi tôi
thực hiện một phần luận án tại Trung tâm.
Xin cảm ơn Sở KHCN HN đã cấp một phần kinh phí cho tôi thực hiện đề tài
này thông qua đề tài cấp sở mã số 01C-06/04-2013-2
Xin cảm ơn KS. Hà Thị Xuyên, KS. Nguyễn Thu Hiền Phòng Thí nghiệm
Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện nghiên cứu Luận án tại Viện.
1.1.4
Quy định kiểm soát L. monocytogenes .......................................................... 24
1.2
Dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes ....................................................................... 25
1.2.1
Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes ..................... 25
1.2.2
Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (clones complex) L. monocytogenes .. 25
1.2.3
Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L. monocytogenes ............................ 26
1.2.4
Các phƣơng pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử . 27
1.2.4.1. Phương pháp điện di xung trường (PFGE).......................................................27
1.2.4.2. Phương pháp ribotyping.................................................................................28
1.2.4.3. Phương pháp đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD).......28
1.2.4.4. Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc
(AFLP)…………………………………………………………………………………………………….29
1.4. Kỹ thuật nhân gen đẳng điện tạo cấu trúc vòm (LAMP)……………………… .43
1.4.1
Nguyên tắc của kỹ thuật LAMP .................................................................... 43
1.4.2
Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP ................................................................ 45
1.4.3.
Phát hiện sản phẩm LAMP.............................................................................46
1.4.4.
Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả phản ứng LAMP…………………..47
1.4.5.
Các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp LAMP để phát hiện L. monocytogenes
trên thế giới………………………………………………………………………………..48
1.5. Một số kỹ thuật tách chiết thu nhận nhanh DNA cho các phản ứng khuếch đại
DNA………………………………………………………………………………………50
1.5.1. Các yêu cầu đối với DNA sử dụng cho các kỹ thuật nhân gen………………….50
1.5.2. Tách chiết và tinh sạch DNA…………………………………………………….51
1.5.3. Kiểm tra hiệu suất thu hồi và chất lƣợng DNA...............................................54
2
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
56
2.3.15. Xây dựng quy trình phân tích L. monocytogenes trên mẫu thực phẩm………….63
2.3.16 Kiểm định bộ sinh phẩm…………………………………………………………..64
2.3.17 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm………………………………………………64
3
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 66
3.1
. Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập
từ một số thực phẩm Việt Nam ............................................................................................................. 66
3.1.1
Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm ....................................... 66
3.1.2
Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập ..... 709
3.1.2.1 Giải trình tự các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA của các chủng L.
monocytogenes phân lập………………………………………………………………….70
3.1.2.2 Phân tích tính đa hình về trình tự nucleotid của các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat,
ldh và lhkA từ các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc………………………….70
3.1.2.3. Phân loại các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc.................................72
3.1.2.4. So sánh các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc với các chủng gây bệnh
dịch trên thế giới……………………………………….…………………………………77
3.2
Xây dựng quy trình phân tích nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm dựa trên
kỹ thuật LAMP .......................................................................................................................................... 80
3.2.1
3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP trên các nền mẫu khác nhau..............................107
3.2.4
Đề xuất quy trình phân tích ......................................................................... 110
3.2.5
Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình ...................................................... 111
3.2.6. Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L.
monocytogenes……………………………………………………………………………...112
3.2.6.1. Thiết kế bộ sinh phẩm.....................................................................................112
3.2.6.2. Sản xu t thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO.......................................114
3.2.7. Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………………………116
3.2.8. Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………….118
4 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN ............................................................................................ 123
KIẾN NGHỊ....................................................................................................................... 124
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN…………...124
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………….………………………..………..125
PHỤ LỤC ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
6
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
AFLP
ALOA
Broth
Listeria
Enrichment
HF
Half Fraser Broth
Môi trƣờng Half Fraser
aw
Water activity
Hoạt độ nƣớc
bp
Base pair
Cặp bazơ
CAMP
Christie, Atkins, Munch-Petersen
Phản ứng CAMP
Ethidium Bromide
Ethidium Bromide
ISO
Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn
hóa
Bộ Nông nghiệp và dịch vụ kiểm
soát an toàn thực phẩm Mỹ
kDa
International Organization for
Standardization
United States Department of
Agriculture-Food
Safety
Inspection Service
U.S.
Food
and
Drug
Administration
Association of Official Analytical
Chemists
Kilo Dalton
LAMP
PBS
Phosphate Buffered Saline
Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus gen gây độc
Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus
Đệm muối phosphate
PCPLC
PCR
Phosphatidylcholine
phospholipase C
Polymerase Chain Reaction
Phosphatidylcholine
phospholipase C
Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN
PEG
Polyethylene glycol
Polyethylene glycol
PFGE
Tƣơng đồng về mẫu âm tính
ND
Negative deviation
Sai khác về mẫu âm tính
PD
Positive deviation
Sai khác về mẫu dƣơng tính
AC
Relative accuracy
Độ chính xác tƣơng đối
SP
Relative specificity
Độ đặc hiệu tƣơng đối
SE
Relative sensitivity
nhiều locus
Điện di xung trƣờng
MVLST
PFGE
MLEE
Multilocus
electrophoresis typing
CC
Clones complex
enzyme Phân loại theo phổ điện di nhiều
enzyme
Dòng phức hợp
8
EC
Epidemic clones
Dòng gây bệnh
DI
DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes ..................................................................... 16
Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người ........................... 19
Hình 1-3. C u tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe ............................ 21
Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ . ........................................................................................ 23
Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L. monocytogenes 1340 và chủng L.
innocua11288 trong canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, môi trường
được sử dụng là TSBYE ........................................................................................................... 39
Hình 1-6 Mô hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L. monocytogenes
............................................................................................................................................................... 40
Hình 1-7 Nguyên tắc kỹ thuật LAMP .......................................................................................... 44
Hình 1-8 Các phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP ....................................................... 46
Hình 1-9 Ảnh hưởng của nồng độ ion Mg2+đến phổ h p thụ của HNB trong dung dịch
phản ứng LAMP ......................................................................................................................... 47
Hình 3-1 Kết quả phân lập L. monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono. .. 66
Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định
phân lập được trên môi trường RAPID’L.mono................................................................ 67
Hình 3-3 Mối liên hệ về mặt di truyền của L. monocytogenes đã phân lập được từ thực
phẩm ............................................................................................................................................... 79
Hình 3-4 Kết quả sàng lọc các bộ mồi LAMP dựa trên khả năng khuếch đại DNA của
L. monocytogenes ....................................................................................................................... 84
Hình 3-5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của
phản ứng LAMP. ......................................................................................................................... 87
Hình 3-6 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP .. 89
Hình 3-7 Độ bao trùm của phản ứng LAMP với các chủng L. monocytogenes ............. 89
Hình 3-8 Độ chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các vi khuẩn
thường nhiễm tạp trong thực phẩm ....................................................................................... 90
10
Hình 3-23 Sơ đồ qui trình sản xu t bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh L.
monocytogenes trong thực phẩm .........................................................................................116
11
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1 Đặc tính sinh hóa của các loài thuộc chi Listeria ............................................... 17
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của
Listeria .......................................................................................................................................... 18
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011
đến 2015 ....................................................................................................................................... 23
Bảng 1-4 Ảnh hưởng của một số ch t nhiễm tạp đến phản ứng LAMP và PCR .......... 52
Bảng 1-5 Các ch t ức chế phản ứng PCR thường gặp trong một số loại thực phẩm và
biện pháp loại bỏ ....................................................................................................................... 53
Bảng 2-1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khẳng định L.
monocytogenes ............................................................................................................................ 58
Bảng 2-2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen
giữ nhà ........................................................................................................................................... 59
Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại
Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 ........................................................ 67
Bảng 3-2 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes theo loại thực phẩm tại Việt
Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 ................................................................. 68
Bảng 3-3. Tính đa hình về trình tự nucleotide của các gen các gen abcZ, bglA, cat,
dapE, dat, ldh và lhkA từ các chủng L. monocytogenes đã phân lập được ............... 72
Bảng 3-4 Tổng hợp các kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (CC) và dòng giống
(lineage) của 48 chủng L. monocytogenes phân lập được từ thực phẩm ................... 73
Bảng 3-5 Phân loại các chủng L. monocytogenes đã phân lập được theo kiểu trình tự
.......................................................................................................................................................... 76
Bảng 3-6 Kết quả so sánh trình tự gen inlJ của chủng L. monocytogenes EGD-e với các
trình tự gen của L. monocytogenes........................................................................................ 82
Bảng 3-21 Độ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP ........112
Bảng 3-22 Kết quả kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L.
monocytogenes ..........................................................................................................................117
Bảng 3-23 Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L.
monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội ..119
13
MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra đƣợc gọi chung là
listeriosis. Đối tƣợng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thƣờng là những ngƣời có hệ thống
miễn dịch bị suy yếu nhƣ trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, ngƣời lớn tuổi. Nếu không đƣợc
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,
sẩy thai và tử vong.
Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi
nhƣ đất, nƣớc, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân ngƣời hoặc phân động vật.
Chúng có thể sống và tăng trƣởng chậm ở các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, hàm
lƣợng khí oxy, pH và hoạt độ nƣớc. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trƣởng ở
nhiệt độ lạnh (0-10oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes
trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm đƣợc bảo quản lạnh trong thời gian dài.
Nhiều loại thực phẩm đƣợc bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm
nữa càng ngày ngƣời ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản
hoặc không bị gia nhiệt để giữ đƣợc nguyên vẹn hƣơng vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
Những sản phẩm nhƣ vậy thƣờng đƣợc bảo quản lạnh trƣớc khi sử dụng. Vì vậy, các sản
phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ
ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên khắp thế giới đã
đƣợc thông báo.
Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ các
vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây
Phân tích đƣợc đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân
lập đƣợc từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
Xây dựng đƣợc một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại
thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP.
Trong nghiên cứu này đối tƣợng nghiên cứu là L. monocytogenes. Phạm vi nghiên cứu tập
trung phát triển phƣơng pháp phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm
dựa trên kỹ thuật LAMP. Qui trình phân tích cần tối ƣu sao cho đơn giản, chính xác, tiện
lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm soát chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm. Bên cạnh đó
việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm cũng
giúp chúng ta thấy đƣợc hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dòng L. monocytogenes
hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam. Từ đó có thể giúp các nhà
quản lý, sản xuất, phân phối và tiêu dùng có các biện pháp thích hợp nhằm nâng cao chất
lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đối tƣợng vi khuẩn nguy hiểm này.
Tính mới của luận án
Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam
Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển kỹ thuật
LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân
tích
15
1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
4,5 tới 7, sinh trƣởng tốt nhất ở giá trị pH 7. Trong dạ dày, chúng có thể tồn tại một khoảng
thời gian ở điều kiện pH 2,0 - 2,5. Hoạt độ nƣớc (aw) thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát
triển của L. monocytogenes từ 0,97 trở lên. Tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trƣởng
trong điều kiện aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại trong một thời gian
dài ở aw rất thấp [157]. Listeria monocytogenes sinh trƣởng mạnh trong môi trƣờng có
nồng độ muối vừa phải (6,5%), tuy nhiên nó vẫn có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng
có nồng độ muối khá cao 10-12%, nhờ có các gen đáp ứng stress nhƣ betL, gbuABC, opuC,
opuB, lmo1421 và bsh [109].
Đặc tính sinh hoá
Listeria monocytogenes có khả năng lên men nhiều loại đƣờng và không sinh khí H2S.
Trong 6 loài thuộc chi Listeria chỉ có L. monocytogenes và L. seeligeri có phản ứng CAMP
dƣơng tính với Staphylococcus aureus và âm tính với Rhodococcus equi trong khi đó, L.
ivanovii lại cho phản ứng CAMP ngƣợc lại [157]. Listeria monocytogene có thể phân biệt
với L. seeligeri và L. ivanovii trong các thử nghiệm khả năng tạo axit từ các loại đƣờng Lrhamnose, D-xylose, β-methyl-D-mannoside (Bảng 1-1) [157]. Đây là cơ sở cho các thử
nghiệm sinh hóa để khẳng định L. monocytogenes trong các phƣơng pháp phân tích dựa
trên kỹ thuật nuôi cấy nhƣ ISO11296-1:1996 và TCVN 7700-1:2007.
Đặc điểm
L. monocytogene
L.ivanovii
L.innocua
L.welshimeri
L.seeligeri
-
Khả năng đồng hóa urea
-
-
-
-
-
-
Khả năng đồng hóa NO2
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
L-rhamnose
+
-
d
d
-
-
D-xylose
-
Mannitol
-
-
-
-
-
+
Thủy phân Hippurate
+
+
+
+
+
-
Thủy phân Esculin
Kháng nguyên H
I, II
A, B
1/2b
I, II
A, B, C
1/2c
I, II
B, D
3a
II, IV
A, B
3b
II, IV
A, B, C
4e
V, VI, (VIII), (IX)
A, B, C
7
XII, XIII
A, B, C
5
(V), VI, (VIII), X
A, B, C
6a
V, (VI), (VII), (IX), XV
A, B, C
6b
(V), (VI), (VII), IX, X, XI
A, B, C
20-40% [109]. Khả năng mắc bệnh tùy thuộc nhiều yếu tố nhƣ bản thân hệ miễn dịch của
ngƣời bệnh, liều nhiễm, chủng vi khuẩn bị nhiễm. Thƣờng những ngƣời có hệ miễn dịch
kém nhƣ trẻ nhỏ, ngƣời già, ngƣời mắc các bệnh suy giảm miễn dịch (lao, HIV, ung thƣ,
cấy ghép nội tạng, ...) và phụ nữ có thai có khả năng mắc bệnh cao hơn các đối tƣợng khác
19
[109]. Liều nhiễm có khả năng gây bệnh phụ thuộc rất nhiều vào chủng vi khuẩn, có những
chủng độc có khả năng gây bệnh ở liều gây chết trung bình thấp (LD 50 thấp), ngƣợc lại có
chủng ít độc hơn với LD 50 cao hơn [78]. Thử nghiệm liều gây nhiễm qua thực phẩm trên
khỉ cho thấy khi nhiễm 109 tế bào L. monocytogenes, khỉ có dấu hiệu bệnh rõ ràng với triệu
chứng ở gan, dễ bị kích thích, ăn mất ngon và tiêu chảy [78]. Với ngƣời bình thƣờng, khi
sử dụng 50-100 g thực phẩm với mật độ nhiễm ≥ 10 3-10 4 CFU/g là có nguy cơ rõ rệt về
bệnh listeriosis [62].
1.1.2. Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes
Nhƣ đã trình bày ở trên, quá trình gây bệnh của L. monocytogenes là kết quả của sự xâm
nhập và sinh trƣởng của loại vi khuẩn này trong một số loại tế bào động vật có vú bao gồm
các tế bào không phải là thực bào (non-phagocytic cells) và các tế bào bạch huyết. Trong
quá trình lây nhiễm truyền qua thực phẩm, L. monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào biểu
mô ở ruột sau đó sẽ lây truyền đến gan và lá lách thông qua đƣờng máu và hệ bạch huyết,
rồi từ đây sẽ lan đến não và nhau thai.
Khi nghiên cứu chức năng của các gen, protein trong quá trình gây bệnh của L.
monocytogenes, ngƣời ta nhận thấy rằng khả năng bám và xâm nhiễm vào tế bào vật chủ
không phải là thực bào của L. monocytogenes gắn liền với một nhóm protein có tên là
internalin (Inl) [25]. Trong hệ gen của chủng L. monocytogenes EGDe có các khung đọc
mở mã hóa cho 25 loại internalin khác nhau (Hình 1-3). Toàn bộ các thành viên trong gia
đình Inl này đều có cấu trúc chung là:
-
Có một đoạn peptid dẫn đƣờng ở đầu N,
(I): internalin với motif LPXTG;
(II): internalin GW hoặc WxL;
(III): internalin được tiết ra môi trường;
Các vùng trình tự tương đồng được đánh d u cùng màu với chú thích các vùng ở bên phải; các chữ số trong
các hộp màu chỉ số lượng các trình tự lặp.
Chức năng của các internalin trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes ở ngƣời đƣợc
phát hiện lần đầu tiên là ở inlA. Loại internalin này nhận biết và xâm nhiễm vào tế bào
biểu mô ở ruột thông qua tƣơng tác đặc hiệu với E-cadherin (Ecad) vốn là một protein
xuyên màng tế bào cần thiết cho quá trình kiến tạo vùng tiếp giáp bám dính ở lớp tế bào
biểu mô. Ở tế bào động vật, tùy thuộc vào nồng độ Ca2+, các phân tử Ecad có khả năng
tƣơng tác với nhau thông qua đầu N ngoại bào, trong khi đó vùng nội bào của Ecad sẽ
tham dự vào quá trình hình thành bộ khung tế bào (cytoskeleton) nhờ liên kết với các
catenin để tạo vùng tiếp giáp bám dính giữa các tế bào. Khi inlA tƣơng tác với Ecad sẽ
21
kích hoạt bộ máy của tế bào nhằm sắp xếp lại bộ khung tế bào. Chính điều này sẽ tạo điều
kiện cho L. monocytogenes có thể xâm nhập vào tế bào biểu mô ở ruột ngƣời [25].
Một trong những internalin khác cũng đã đƣợc chứng minh là liên quan đến quá trình gây
bệnh của L. monocytogenes là inlJ. Về mặt cấu trúc, inlJ là một protein bao gồm 851 axit
amin với điểm đặc thù là vùng LRR có chứa cystein (C) thay vì leucin (L) tại vị trí axit
amin thứ bảy trong hầu hết 15 đơn vị lặp (Hình 1-4). Ngoài ra, khác với inlA, inlJ có bốn
vùng lặp MucBP (Mucin-Binding Protein) vốn là các vùng protein có khả năng tƣơng tác
với một số glycoprotein ở niêm mạc ruột (Hình 1-4).Trong nghiên cứu đầu tiên về chức
năng của inlJ, Sabet và các đồng tác giả [165] đã chỉ ra rằng việc bất hoạt gen inlJ (hay gen
lmo2821) làm giảm đáng kể độc lực của L. monocytogenes khi tiêm vào tĩnh mạch chuột
hay khi cho lây nhiễm bằng đƣờng miệng. Nghiên cứu tiếp theo của Sabet và các đồng tác
giả vào năm 2007 [166] đã cho thấy protein inlJ không đƣợc tổng hợp khi nuôi cấy L.
monocytogenes trong canh trƣờng BHI (Brain Heart Infusion) cũng nhƣ khi cho loại vi
đƣợc in chữ nghiêng.
1.1.3. Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L. monocytogenes
Theo các số liệu thống kê trong giai đoạn từ 1996 đến 2000, hơn 60% các vụ triệu hồi thực
phẩm ở Mỹ có nguyên nhân là do nhiễm L. monocytogenes [109]. Một loạt các thực phẩm
nhiễm L. monocytogenes đã gây ra các vụ bùng phát dịch listeriosis ở Bắc Mỹ và Châu Âu
nhƣ coleslaw, sữa, phomat mềm, pate, xúc xích, tôm, cá, … [109]. Theo số liệu thống kê
của CDC, hàng năm ở Mỹ có khoảng 1.600 ngƣời bị bệnh và 260 ngƣời chết do listeriosis
[170]. Tính theo tỷ lệ thì hàng năm cứ 100.000 ngƣời thì có 0,26 ngƣời mắc listeriosis
hàng năm [52]. Nếu so với giai đoạn 1996-1998 thì tỷ lệ ngƣời mắc bệnh listeriosis năm
2012 đã giảm 42 %. Tuy nhiên nếu so với giai đoạn năm 2006-2008 thì con số này năm
2012 không hề giảm [40]. Một số các vụ bùng phát dịch bệnh listeriosis gần đây tại Mỹ
đƣợc thống kê trong Bảng 1-3 dƣới đây.
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015
[41]
Thời gian
Loại thực
phẩm
Số ngƣời
mắc
Số ngƣời
nhập viện
Số nguời
chết
6
1
5 bang
2011
23
2014
Pho mat
8
7
1
2 bang
2014
Pho mat
5
5
Kem
10
10
3
4 bang
Ở châu Âu, một loạt các nƣớc đã có thông báo về dịch bệnh do L. monocytogenes. Năm
2006 có 23 quốc gia thuộc cộng đồng chung châu Âu có thông báo về các trận dịch
listeriosisvới tổng số 1583 ngƣời mắc bệnh. Trong đó Đức, Pháp, Anh là những quốc gia
chiếm 64 % số ngƣời mắc trên toàn châu Âu [56].
Ở Việt Nam, việc thống kê các vụ dịch nói chung và dịch bệnh do thực phẩm nói riêng
cònchƣa đầy đủ. Hiện nay chủ yếu chỉ các vụ dịch lớn ở các bếp ăn tập thể mới đƣợc thống
kê . Nguyên nhân gây nhiễm độc cũng chƣa đƣợc phân tích cụ thể.
Về nghiên cứu tình trạng nhiễm L. monocytogenes trong thực phẩm Việt nam cho đến nay
đã có một số các công bố. Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm sữa chua,
hải sản đông lạnh, thịt tƣơi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến ăn liền, Viện Pasteur TP.
HCM đã phân lập đƣợc 2 chủng L. monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0,93 %. Đến năm 1999,
Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng phân lập đƣợc 2 chủng L. monocytogenes từ 20 mẫu
thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10 % [11]. Theo tổng kết của Viện Pasteur TP. HCM, các mẫu hải
sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes 23,9% (23/138 mẫu) [11].
Nghiên cứu phát hiện L. monocytogenes dựa trên kỹ thuật PCR với 141 mẫu thực phẩm,
các tác giả phát hiện thấy 11 mẫu cho kết quả dƣơng tính, chủ yếu là mẫu thịt hun khói
[12]. Sử dụng phƣơng pháp que thử nhanh, phát hiện đƣợc 11/160 mẫu (xúc xích, pate,
sữa, pho mat) nhiễm L. monocytogenes [8]. Nghiên cứu của Cục Quản lý Chất lƣợng Nông
Lâm sản và Thủy sản cho thấy có 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu đƣợc
và dịch tễ. Dịch tễ học phân tử xác định đặc điểm của các gen ở mức độ phân tử và xác
định phân bố của các kiểu gen trong quần thể. Từ đó mô tả mối tƣơng quan giữa các kiểu
gen và khả năng gây bệnh, gây dịch của các chủng nghiên cứu. Dịch tễ học phân tử L.
monocytogenes đã đƣợc nghiên cứu nhiều trên thế giới. Tuy vậy ở Việt Nam, cho đến nay,
chƣa có công bố nào sử dụng các kỹ thuật phân tử trong phân loại, xác định đặc điểm phân
tử các chủng L. monocytogenes để đánh giá khả năng gây bệnh, gây dịch của loài vi khuẩn
nguy hiểm này trên thực phẩm cũng nhƣ trên bệnh phẩm.
1.2.1. Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes
Các phƣơng pháp phân loại dựa trên kiểu gen chia L. monocytogenes thành 4 dòng giống
chính, gồm dòng giống I, II, III và IV. Các dòng này khác nhau về hệ sinh thái chúng
thƣờng tồn tại, tỷ lệ tái tổ hợp và hệ gen [45] . Dòng giống I có các kiểu huyết thanh 1/2b,
3b, 3c và 4b là dòng thƣờng gây ra các vụ dịch bệnh listeriosis ở nhiều nƣớc trên thế giới.
Dòng giống II có các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2c và 3a, là dòng chủ yếu đƣợc phân lập từ
thực phẩm, nhà máy thực phẩm, môi trƣờng và nông trại. Trong khi đó dòng giống III và
dòng giống IV thƣờng bao gồm kiểu huyết thanh 4a và 4c [80]; [30]. Đây là những dòng
rất ít khi gặp trên ngƣời hoặc thực phẩm mà chủ yếu phân lập đƣợc từ động vật và ít đƣợc
nghiên cứu [198]; [17].
1.2.2. Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (CC) L. monocytogenes
Để nghiên cứu dịch tễ học, L. monocytogenes đƣợc phân loại chi tiết hơn các dòng giống
đó là phân loại thành các dòng phức hợp (CC). Một số CC chuyên gây ra các vụ dịch bệnh
L. monocytogenes đƣợc gọi là các dòng phức hợp gây bệnh (EC). Các nghiên cứu cho thấy,
có 4 EC là nguyên nhân gây ra phần lớn các vụ dịch listeriosis, đó là ECI, ECIa, ECII, và
ECIII [198]. Trong đó ECI, ECIa, và ECII là các nhóm riêng biệt trong kiểu huyết thanh
4b. Đây là những dòng gây dịch bệnh listeriosis bùng phát lặp đi lặp lại ở Mỹ và châu Âu.
25
Copyright: Tài liệu đại học ©