ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------------------

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHỤ GIA THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62440118

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2016


Công trình được hoàn thành tại
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai
TS. Nguyễn Thị Ánh Hường

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:


sắc ký (như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC MS), sắc ký ion (IC),..). Tuy nhiên, các thiết bị phân tích này có chi phí đầu
tư lớn và thường chỉ được trang bị tại Viện kiểm nghiệm tuyến Trung ương
(Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia) và một số trung
tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh. Trong khi đó, nhu cầu phân tích, kiểm nghiệm
các chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm là rất lớn và nhiều khi cần thực
hiện ngay tại các địa phương để đáp ứng nhiệm vụ kiểm tra ngăn ngừa và xử
lý kịp thời các vụ việc. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ
dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE - C4D) gần đây được biết đến là
một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các ưu điểm nổi trội như
thiết bị nhỏ gọn, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và các dung môi hóa chất ít,
chi phí đầu tư và vận hành thấp, có thể chế tạo và linh kiện thay thế sẵn có tại
Việt Nam, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các phương pháp
phân tích hiện đại khác như HPLC, GC - MS. Phương pháp CE - C4D cho
thấy triển vọng trở thành một công cụ đắc lực trong sàng lọc, kiểm nghiệm an
toàn thực phẩm, nhất là tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ ở tuyến địa
phương, các chợ và siêu thị, các địa điểm kinh doanh, bếp ăn tập thể hay
nhóm hộ tiêu dùng.
1


Với đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng
detector độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm”, bản
luận án tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển ứng dụng của
phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo
kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích
thích sinh học trong thực phẩm bao gồm phân tích đồng thời bốn chất điều
chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm (acid formic, acid acetic, acid propionic,
acid butyric), phân tách đồng thời bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali,
aspartam, cyclamat natri, saccharin) và xác định đồng thời ba chất thuộc
nhóm β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol), trong đó có abutamol

quan nghiên cứu cho thấy, trên thế giới mới chỉ có ba nghiên cứu sử dụng
2


phương pháp CE- C4D phân tích các nhóm chất này (trong đó có hai nghiên
cứu xác định nhóm chất tạo ngọt và một nghiên cứu xác định salbutamol
trong dược phẩm). Vì vậy có thể nói luận án đã tiên phong trong việc sử dụng
phương pháp CE- C4D trong lĩnh vực phân tích thực phẩm, đóng góp thê một
phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, từ đó hi vọng sẽ góp phần vào việc
quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam.
 Về mặt thực tiễn
Phương pháp CE - C4D với các ưu điểm về hệ thiết bị mở ra khả năng
áp dụng phân tích nhiều đối tượng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là
với lĩnh vực an toàn thực phẩm, có ý nghĩa thực tế lớn, thích ứng với hoàn
cảnh, điều kiện kinh tế, xã hội ở nước ta.
Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án đơn giản, dễ thực hiện,
chi phí thấp, có độ chính xác cao, rất phù hợp để áp dụng phân tích các chất
điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt trong các mẫu thực
phẩm, giúp kiểm soát sử dụng đúng hàm lượng và quy cách các phụ gia này
trong thực phẩm.
Đặc biệt là với salbutamol, một chất tạo nạc được sử dụng trái phép
nhiều trong chăn nuôi ở nước ta, quy trình phân tích trong luận án đã được áp
dụng để phân tích salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu nước tiểu lợn
và mẫu thịt lợn, có thể giúp các nhà quản lý kiểm tra, giám sát và kịp thời
ngăn chặn xử lý việc sử dụng chất cấm này trong chăn nuôi.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm năm phần chính là: mở đầu, chương 1: tổng quan, chương
2: nội dung và phương pháp nghiên cứu, chương 3: kết quả và thảo luận, kết
luận. Trong mỗi phần có các hình ảnh và bảng biểu minh họa tương ứng, phù
hợp. Ngoài ra luận án còn gồm đầy đủ các phần: mục lục, danh mục các ký

Hiện nay các phương pháp được sử dụng để xác định các chất phụ gia và
kích thích sinh học trong thực phẩm bao gồm phương pháp sắc ký (HPLC, GC,
IC), phương pháp điện hóa, phương pháp UV- Vis, phương pháp sinh học và
phương pháp điện di mao quản. Trong đó các phương pháp sắc ký được dùng
phổ biến nhất, đối với chất phụ gia có hàm lượng tương đối cao trong thực
phẩm hay sử dụng cùng các detector có độ nhạy trung bình như UV, PDA,
ELSD… (LOD cỡ ppm), còn đối với cácchất kích thích sinh học có hàm lượng
thấp thì sử dụng các detector có độ nhạy cao như MS, ESI/MS, MS/MS…
(LOD cỡ ppb). Trong khoảng 10 năm trở lại đây, phương pháp điện di (CE,
CZE, ITP, MECC) với các detector UV, DAD, điện hóa và đặc biệt gần đây là
detector độ dẫn C4D đang nhanh chóng phát triển thành một phương pháp có
độ nhạy (cỡ ppm) phù hợp để xác định các phụ gia thực phẩm.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm (chất điều chỉnh độ acid,
bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) khá cao vì vậy các Quy chuẩn kỹ thuật
quốc gia về phụ gia thực phẩm (QCVN 4.2010 - BYT) và TCVN quy định
phương pháp chuẩn độ để định lượng các chất này trong thực phẩm. Đến nay
4


mới chỉ có TCVN 8471:2010 dùng phương pháp HPLC để xác định đồng thời
aspartam, saccharin, acesulfam - kali trong thực phẩm. Đặc biệt với các chất
tạo nạc, hiện nay vẫn chưa có tiêu chuẩn và quy chuẩn để xác định. Vì vậy
mục tiêu đặt ra của luận án là nghiên cứu xây dựng phương pháp CE-C4D có
độ nhạy phù hợp với giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm và có thể
áp dụng được để phân tích các chất tạo nạc trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn
một cách đơn giản, tiện lợi, áp dụng được ở các phòng thí nghiệm nhỏ tuyến
địa phương.
1.3. Phƣơng pháp điện di mao quản
1.3.1. Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản

nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích
lớn sẽ di chuyển nhanh hơn
1.3.4. Dòng điện di thẩm thấu và phương pháp thay đổi dòng điện di thẩm
thấu phân cực ngược anion chất phân tích
Dòng chảy của khối chất lỏng trong mao quản được gọi là dòng điện di
thẩm thấu (EOF). Trong mao quản Silica và khoảng pH điện di 4 ÷ 9, dòng
EOF thường hướng theo phương từ Anot (cực dương) về Catot (cực âm). Ở
điều kiện đó, các anion có tốc độ điện di riêng nhỏ hơn tốc độ của dòng EOF
sẽ được dòng EOF mang theo về phía cực âm. Nếu tăng tốc độ dòng EOF sẽ
làm các anion đó bị cuốn theo, di chuyển cùng dòng EOF về phía cực âm nên
cần phân cực ngược (áp thế ở đầu bơm mẫu) để phân tách các anion này.
1.3.5. Các detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản
Tùy thuộc vào mục đích phát hiện hay định lượng, cũng như tùy thuộc
vào tính chất hóa học, hóa lý, vật lý của các chất phân tích có thể sử dụng các
detector tương ứng như: Detector quang học, detector khối phổ, detector điện
hóa, detector độ dẫn… Trong đó detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D) có ưu
điểm là đáp ứng với tất cả các hợp phần mang điện, có thể chế tạo thu nhỏ và
đặc biệt có thể tự chế tạo ở Việt Nam. C4D đã được ứng dụng trong khoảng
10 năm trở lại đây, trở thành detector phổ biến trong điện di mao quản.
1.3.6. Ứng dụng của phương pháp điện di mao quản CE -C4D
Trong những năm gần đây, phương pháp điện di mao quản CE -C4D đã
được phát triển rất nhanh và ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực, đặc biệt là
trong môi trường, sinh học, dược phẩm, thực phẩm… để định lượng các
anion, cation cơ bản, phụ gia thực phẩm, kháng sinh, thuốc kích dục, thuốc
gây mê, ma túy tổng hợp…
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương
pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết
nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích thích sinh

Các mẫu ở dạng rắn được đồng nhất mẫu, thêm nước cất đề ion, rung siêu âm
trong khoảng thời gian hợp lý sau đó lọc qua màng lọc.
2.2.4. Phương pháp lấy mẫu và xử lý, làm giàu mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn
Mẫu nước tiểu lợn, mẫu thịt lợn được lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm,
được xử lý sơ bộ rồi cho qua cột chiết pha rắn (SPE). Các cột chiết pha rắn
khảo sát gồm cột C18, cột SCX 3 ml, cột SCX 6 ml và cột MCX 6 ml. Các
bước chiết pha rắn gồm: Hoạt hóa cột chiết, nạp mẫu vào cột chiết, rửa loại
tạp chất và rửa giải chọn lọc chất phân tích.
2.2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Độ tin cậy của phương pháp CE - C4D trong phân tích một số phụ gia
thực phẩm được đánh giá qua các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định
lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi.
2.3. Thiết bị và hóa chất
Thiết bị CE là hệ thiết bị tự chế, bán tự động được thiết kế và chế tạo tại
Việt Nam bởi Công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) trên cơ sở hợp
tác với Bộ môn Hóa Phân tích (Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, ĐHQGHN) và nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa,
trường đại học Basel, Thụy Sỹ). Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25 kV, sử
dụng cảm biến độ dẫn không tiếp xúc (C4D).
7


Hình 2.2. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam
(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp
xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển,
7: Bình khí nén)
Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được
pha chế bằng nước deion.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định đồng thời acidformic, acid acetic, acid propionic, acid butyric

thường dùng và có thể thay đổi trong khoảng từ 2 - 10, tùy thuộc vào mỗi loại
mẫu phân tích. Thành phần của dung dịch đệm gồm các ion có độ điện di nhỏ,
tức là phải có điện tích nhỏ nhưng kích thước tương đối lớn, ngoài ra các chất
đệm phải tan tốt trong nước, bền vững trong mao quản và trong quá trình điện
di. Sau thành phần, pH của hệ đệm điện di, nồng độ đệm được lựa chọn thích
hợp để có dung lượng đệm đủ lớn và khống chế hệ đệm không đổi trong suốt
quá trình điện di.
Các hệ đệm điện di phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid
propionic, acid butyric cần có pH xung quanh khoảng 5 đến 6 để đảm bảo các
chất phân tích ở dạng anion và dòng EOF không quá lớn. Tỉ lệ nồng độ đệm
tương ứng với pH được khảo sát là: His 30 mM/Mes 50 mM (pH = 5,6), His
30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8), và His 50 mM/Mes 40 mM (pH = 6,3). Kết
quả cho thấy, hệ đệm His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8) cho diện tích pic
của các chất phân tích lớn nhất và đường nền tốt nhất. Do đó, dung dịch đệm
điện di His 30 mM/Mes 40 mM (pH =5,8) được lựa chọn cho các khảo sát
tiếp theo.
b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có một nguồn thế tách
cao V, tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, là một yếu tố
quan trọng quyết định kết quả điện di các chất phân tích. Việc khảo sát thế
được thực hiện ở các giá trị thế -15 kV, -18 kV và -20 kV cho thấy khi tăng
thế thời gian di chuyển của các chất phân tích giảm. Để đảm bảo độ phân giải
khi phân tích mẫu thực và thời gian phân tích phù hợp, thế -18 kV là thế phù
hợp cho phép phân tích.
c) Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao và thời gian bơm mẫu
Trong phương pháp bơm mẫu thủy động lực học kiểu xi phông, lượng
mẫu bơm vào tỷ lệ thuận với chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu.
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu bơm vào phải đủ lớn để
đảm bảo độ nhạy và khả năng tách tốt. Chiều cao bơm mẫu càng lớn thì sự
chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản càng lớn dẫn tới lượng

15cm

10cm

10s

0

100

200
300
Thêi gian di chuyÓn (s)

400

0

Hình 3.3. Ảnh hưởng của chiều cao
bơm mẫu đến sự phân tách acid
formic, acid acetic, acid propionic,
acid butyric

100

200
300
Thêi gian di chuyÓn (s)

400

Thời gian bơm mẫu

20 s

Dung dịch đệm điện di

His-Mes (30 mM/40 mM), pH = 5,8

Thế tách

- 18 kV

3.1.2. Xây dựng đường chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phương pháp
Các phương trình đường chuẩn xác định acid formic, acid acetic, acid
propionic, acid butyric được nêu trong bảng 3.6.

10


Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của acid Formic, acid Acetic,
acid Propionic và acid Butyric
Phƣơng trình đƣờng chuẩn
y = (10,16538±6,5321)+(61,7982±1,16188)x
y = (-0,52484±2,98169)+(31,4926±0,67235)x
y = (-5,07988±6,11372)+(61,63352±1,09553)x
y = (6,70525±5,2828)+(57,9034±0,99063)x

Tên chất
Acid formic
Acid acetic

Mẫu
Cam ép
(mg/l)
Nước C2
(mg/l)
Rượu nho
Pháp (mg/l)
Rượu
Soliera
Tempranillo
(mg/l)
Cà phê Viet
(mg/kg)
Cà phê G7
(mg/kg)
Rượu vang
Thăng Long
(mg/l)

acid Acetic

acid Propionic

CE-C D

HPLC

ER %

CE-C D

ND

ND

-

1990±17

2390±17

-16,7

448±11

473±12

-5,3

ND

ND

-

83,9±3,9

90.8±4.5

-7,6


1260±10

1320±10

-4,5

4050±36

4120±31

-1,7

7440±65

8590 ± 61

-13,4

2320±20

2110±15

+10,0

9490±84

9920±74

-4,3


butyric bằng phương pháp CE-C4D là đáng tin cậy.
11


3.2. Xác định đồng thời chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat
natri, saccharin trong thực phẩm bằng phƣơng pháp CE-C4D
Các chất tạo ngọt:acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin
(Ace - K, Asp, Cyc, Sac) có pKa lần lượt là 2,0; 3,2; 1,7; 1,6. Trong dung dịch
có pH = 8 ÷ 10 các chất này tồn tại chủ yếu dưới dạng anion, có kích thước
cồng kềnh, điện tích nhỏ, có độ linh động điện di thấp dẫn đến tốc độ điện di
riêng nhỏ. Ở khoảng pH cao, dòng EOF lại có tốc độ lớn, có khả năng cuốn
theo các anion chất tạo ngọt trong khối liên kết tương tác bền vững với các
phần tử mang điện dương về phía cực âm. Để lợi dụng ảnh hưởng này của
dòng EOF, các chất tạo ngọt thường được phân tích theo kiểu phân cực ngược.
3.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu
a) Khảo sát dung dịch đệm điện di
Bốn hệ đệm điện di khảo sát bao gồm: Arg/Mes, Arg/CAPS, Tris/His
và Tris/Ches. Các giá trị pH được thay đổi từ 8,5 đến 9,7 bằng cách thay đổi
tỷ lệ giữa các thành phần đệm.
Trên điện di đồ, pic của các chất xuất hiện theo thứ tự: pic của dòng
EOF, Asp, Cyc, Sac, Ace - K. Khi pH tăng, thời gian phân tích và độ phân
giải của bốn chất tạo ngọt cũng đồng thời giảm. Cả bốn hệ đệm khảo sát đều
cho tín hiệu chất phân tích đẹp, hiệu quả tách tốt, đường nền ổn định và thời
gian phân tích hợp lý nhất tại pH = 9,2. Để có thể lựa chọn được hệ đệm tốt
nhất, các điện di đồ ở pH = 9,2 của bốn hệ đệm được so sánh trong hình 3.12.

Hình 3.12. So sánh khả năng phân tách Ace - K, Asp, Cyc, Sac của các
đệm điện di Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes, Arg/CAPS ở pH = 9,2
Hình 3.12 cho thấy, tại pH = 9,2, hai hệ đệm điện di Tris/His và
Tris/Ches đều cho độ phân giải tốt, đường nền ổn định và thời gian phân tích

CE-C4D

Mao quản

Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng
50 cm, đường kính trong 75 µm

Phương pháp bơm mẫu

Thủy động lực học kiểu xiphông (chiều cao 10 cm)

Thời gian bơm mẫu

15 s

Dung dịch đệm điện di

Tris/His (100 mM/10 mM), pH = 9,2

Thế tách

+15 kV

3.2.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp nghiên cứu
Đường chuẩn của bốn chất tạo ngọt Asp, Cyc, Sac, Ace - K được thiết
lập trong khoảng nồng độ 2,5-180 ppm. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Phương trình đường chuẩn của Ace-K, Asp, Cyc, Sac
Tên chất

Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y = a + bx)

< 0,0001
< 0,0001

13


LOD của Ace-K, Asp, Cyc, Sac lần lượt là: 0,7 ppm; 5,0 ppm; 1,0 ppm;
1,0 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của Asp, Cyc, Sac và Ace-K nhỏ,
dao động từ 0,9 % đến 2,0 %, hiệu suất thu hồi của Asp, Cyc, Sac và Ace-K
khá cao, từ 95,7 ÷ 99,3 %. Như vậy phương pháp là phù hợp để phân tích các
chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm.
3.2.3. Phân tích chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri,
saccharin trong thực phẩm
Áp dụng quy trình tối ưu đã khảo sát ở trên để phân tích bốn chất tạo
ngọt: Ace - K, Asp, Cyc, Sac trong 16 mẫu gồm mẫu nước giải khát và 2 mẫu
thạch. Kết quả ở hình 3.19 cho thấy đã phát hiện một hoặc đồng thời 2 chất
tạo ngọt (Asp và Ace - K) trong số bốn chất tạo ngọt phân tích. Riêng mẫu
chè đỗ đen phát hiện Sac với hàm lượng là 111 ppm.

Hình 3.19: Kết quả phân tích chất tạo ngọt trong mẫu nước giải khát bằng
phương pháp CE - C4D
Kết quả phân tích bằng phương pháp CE-C4D được so sánh đối chứng
với phương pháp tiêu chuẩn (HPLC) hình 3.19 cho thấy kết quả giữa hai
phương pháp khá phù hợp (sai số dưới 15%) chứng tỏ phương pháp phân tích
là chính xác và đáng tin cậy.
3.3. Khảo sát các điều kiện tối ƣu phân tích β-agonist salbutamol,
metoprolol và ractopamintrong mẫu thức ăn chăn nuôi, nƣớc tiểu lợn và
mẫu thịt lợn bằng phƣơng pháp CE-C4D
Salbutamol, metoprolol và ractopamin là ba chất thuộc nhóm β agonist, có cấu trúc tương tự với các dẫn xuất amin, đều có pKa> 9. Tại pH
nhỏ hơn pKa, các β - agonist này tồn tại dưới dạng cation, di chuyển cùng

Sal
0

100

200

300

400

500

Met Rac
600

Hình 3.24. Ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Sal,
Met, Rac
Các nồng độ 10 mM, 15 mM, 20 mM của hệ đệm Arg/Ace được khảo
sát để tìm ra nồng độ đệm tối ưu. Kết quả khảo sát ở nồng độ đệm 10 mM cho
thấy tại giá trị nồng độ này hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các chất
được tách tương đối tốt và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, đệm Arg/Ace có
nồng độ 10 mM được lựa chọn là dung dịch đệm tối ưu.
b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
Tại pH = 4,9, Sal, Met và Rac đều mang điện dương. Các điện thế được
lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV, 18 kV và 20 kV.

15



Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met và Rac bằng phương
pháp CE-C4D được tổng hợp trong bảng 3.21.
Bảng 3.21. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met, Rac
bằng phương pháp CE-C4D
Các yếu tố
Detector
Mao quản
Phương pháp bơm mẫu
Thời gian bơm mẫu
Dung dịch đệm điện di
Thế tách

Điều kiện
CE-C4D
Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng
53 cm, đường kính trong 50 µm
Thủy động lực học kiểu xiphông: 10cm
20 s
Arg/Ace (10 mM) pH=4,9
18 kV

3.3.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp phân tích
3.3.2.1. Đƣờng chuẩn phân tích
Các dung dịch để dựng đường chuẩn có nồng độ biến thiên trong
khoảng 2,5- 250,0 ppm. Kết quả khảo sát và tính toán được trình bày trong
bảng 3.22
16


Bảng 3.22. Phương trình đường chuẩn của Sal, Met và Rac


TACN 3 - có Sal

ND
36,21 ± 0,15 (ppm)
297,13 ±0,92 (ppm)

Hàm lƣợng chất
phân tích (bằng
HPLC-MS)
31,53 (ppm)
281,03 (ppm)

Sai số giữa
phƣơng pháp
(%)
12,92
5,42

ND: Không định lượng được với LOQ của Rac là 2,3 ppm
-: Không phân tích
Đối tượng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là các mẫu nước tiểu và
mẫu thịt lợn của lợn đã được nuôi bằng thức ăn chăn nuôi có chứa chất tạo nạc,
cụ thể là salbutamol. Tuy nhiên các đối tượng mẫu này có đặc điểm là thành
phần nền phức tạp và có hàm lượng Sal thấp hơn LOD, LOQ của phương pháp
CE-C4D, do vậy trước khi phân tích bằng phương pháp điện di cần tiến hành
tách và làm giàu Sal từ nền mẫu bằng phương pháp chiết tách phù hợp.
3.3.4. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) salbutamol trong mẫu
nước tiểu lợn
Kĩ thuật chiết pha rắn (SPE) được chọn làm kĩ thuật làm sạch, làm giàu
salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn. Các yếu tố ảnh hưởng quyết

pH = 6,0, nồng độ 100 mM được lựa chọn là đệm tối ưu cho quá trình chiết.
c) Khảo sát quá trình rửa tạp
Dung dịch rửa tạp được lựa chọn phải tương tác đủ mạnh với các tạp
chất để loại bỏ chúng nhưng lại tương tác đủ yếu với chất phân tích để không
làm mất chất trong quá trình rửa. Bốn dung dịch rửa tạp chất đã được lựa
chọn để khảo sát gồm:
Dung dịch 1: 3ml H2O →1,5ml CH3OH.
Dung dịch 2: 3ml hỗn hợp aceton /H2O (1/1 v/v).
Dung dịch 3: 3ml H2O.
Dung dịch 4: 3ml CH3OONH4.

Hình 3.38. Hiệu suất thu hồi của các dung dịch rửa tạp
Kết quả thu được từ hình 3.38 cho thấy hiệu suất thu hồi ứng với bốn
dung dịch 1, 2, 3, 4 đều tương đối cao, trong đó hiệu suất thu hồi của dung
dịch 2 và 4 gần bằng nhau và cao hơn hai dung dịch còn lại. Với hai dung
dịch 2 và 4, dung dịch 2 cho đường nền đẹp, pic cation nhỏ, tín hiệu phân tích
tốt. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch 2, tức là tiến hành rửa tạp bằng 3 ml
hỗn hợp aceton /H2O (1/1 v/v) cho các nghiên cứu tiếp theo.
19


c) Khảo sát dung môi rửa giải
Để rửa Sal chọn lọc ra khỏi cột chiết, ngược lại với dung dịch rửa tạp,
cần chọn dung môi rửa giải có thể hòa tan tốt Sal nhưng lại hòa tan ít các
dạng cation tạp. Tiến hành khảo sát ba hệ dung môi rửa giải sau:
Hỗn hợp 1: 6ml CH2Cl2/2 propanol/NH3 (78/20/2 v/v/v)
Hỗn hợp 2: 6ml CH3OH/NH3 (95/5 v/v)
Hỗn hợp 3: 6ml CH3OH/CH3COOH (9/1/v/v)
10mV
(3)

tổng hợp dưới sơ đồ sau:
SCX 6 ml
Hoạt hoá 10 ml CH3OH+ 10 ml H2O +10 ml đệm phosphat pH 6
Nạp mẫu 10 ml nuớc tiểu + 10 µl Sal 100 ppm
Rửa tạp 3 ml hỗn hợp axeton/H2O (1/1 v/v)
Thổi khô cột, rửa giải 6 ml hh CH3OH/NH3(95/5)
Thổi khô bằng dòng khí nitơ ở 450
Hòa tan cặn bằng 100 µl CH3OH
20


c) Đánh giá phương pháp phân tích Sal trong mẫu nước tiểu lợn bằng
phương pháp CE - C4D kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu phân tích
Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng của
phương pháp (MQL) xác định được là 30 ppb và 100 ppb. Độ lệch chuẩn RSD
% nhỏ hơn 5 %, hiệu suất thu hồi 96,9 % chứng tỏ độ lặp của phương pháp là
tương đối tốt và độ chính xác cao theo AOAC phù hợp để phân tích mẫu thực
tế. Đặc biệt đây là lần đầu tiên có sự kết hợp giữa kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)
với phương pháp CE-C4D nhằm xác định Sal, giúp làm tăng độ nhạy của
phương pháp CE-C4D, phù hợp để áp dụng phân tích các mẫu thực tế.
d) Phân tích mẫu nước tiểu thực tế
Qui trình phân tích CE-C4D kết hợp với chiết pha rắn được áp dụng để
phân tích một số mẫu nước tiểu lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm cho ăn Sal. Kết
quả phân tích được cho trong bảng 3.29.
Bảng 3.29. Kết quả phân tích hàm lượng Sal trong 08 mẫu nước tiểu được lấy
theo ngày nuôi với thức ăn bổ sung Sal.
Ngày lấy mẫu
Nồng độ (ppm)

18/8/14 19/8/14 20/8/14 22/8/14 24/8/14 26/8/14 1/9/14 6/9/14

Sal từ mẫu thịt lợn là đặc biệt quan trọng. Từ kết quả khảo sát dung dịch rửa
tạp chất trong quá trình chiết Sal từ mẫu nước tiểu, tiến hành khảo sát 6 dung
dịch rửa tạp chất bao gồm:
Dung dịch 1: 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH+ 1 ml H3PO4 10 mM
Dung dịch 2: 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH
Dung dịch 3: 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH+ 1 ml H3PO4 5 mM
Dung dịch 4: 3 ml H2O+ 3 ml CH3OH+1 ml H3PO4 10 mM
Dung dịch 5: 3 ml hỗn hợp axeton /H2O +1 ml H3PO4 10 mM
Dung dịch 6: 3 ml HCOOH 2 %+ 3 ml H2O
Hiệu suất thu hồi tính được của các dung dịch rửa tạp được trình bày
trong hình 3.45.

Hình 3.45. Kết quả hiệu suất thu hồi của từng dung dịch rửa tạp
(1, 2, 3, 4, 5, 6 ứng với các dung dịch rửa tạp 1, 2, 3, 4, 5, 6)
Kết quả cho thấy dung dịch rửa tạp 2 (sử dụng 6 ml H2O+ 3 ml CH3OH)
có hiệu suất thu hồi Sal lớn nhất là 98,5% nên được lựa chọn là dung dịch rửa
tạp tối ưu.
Kết quả chiết mẫu nước tiểu cộng với kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy
dung dịch rửa giải trong chiết Sal trong mẫu nước tiểu lợn cũng là dung dịch
rửa giải tối ưu để chiết Sal trong mẫu thịt lợn. Các điều kiện tối ưu cho quá
trình chiết pha rắn Sal trong mẫu thịt lợn sử dụng cột SCX 6 ml được tổng
hợp dưới sơ đồ sau:
22


SCX 6 ml
Hoạt hoá 10 ml CH3OH+ 10 ml H2O +10 ml đệm phosphat pH 6
Nạp mẫu 2 g thịt lợn đã được xử lý
Rửa tạp 6 ml H2O + 3 ml CH3OH
Thổi khô cột, rửa giải 6 ml hh CH3OH/NH3(95/5)

Độ lệch (%)

Nƣớc tiểu 22/8
340,00
403,10
15,60

Nƣớc tiểu 6/9
2230,0
2212,1
0,80

Thịt 8/9/14 Thịt 10/12/15
116,00
KPH
104,20
0.28
11,30

Bảng 3.32 cho thấy độ lệch khi phân tích mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn
bằng phương pháp CE-C4D so với phương pháp tiêu chuẩn LC/MS/MS dao động
từ 0,8 ÷ 15,6 %. Từ đó có thể kết luận phương pháp CE-C4D có độ đúng cao, có
thể áp dụng để phân tích Sal trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn cho độ tin cậy
cao, góp phần giúp các nhà quản lý kiểm soát việc sử dụng Sal trong chăn nuôi.
23