BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
===============

VŨ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN
CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM
TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
===============

VŨ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN
CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM
TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60.42.01.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN THỊ THÚY


Học viên

Vũ Phương Liên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Axit phytic và phytate .............................................................................. 3
1.1.1. Axit phytic............................................................................................ 3
1.1.2. Phytate................................................................................................. 4
1.2. Phytase....................................................................................................... 5
1.2.1. Phân loại phytase ................................................................................ 6
1.2.2. Đặc tính lí hóa của phytase................................................................. 8
1.3. Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp....................... 10
1.3.1. Vài nét về chi Bacillus ....................................................................... 10
1.3.2. Phytase từ Bacillus ............................................................................ 10
1.4. Ứng dụng của phytase............................................................................ 12
1.5. Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase .......... 14
1.6. Pepsin....................................................................................................... 15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19
2.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................ 19
2.1.1. Hóa chất ............................................................................................ 19
2.1.2. Thiết bị .............................................................................................. 19
2.1.3. Chủng giống vi sinh vật .................................................................... 20
2.1.4. Plasmid .............................................................................................. 20
2.1.5. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm ............................................ 20


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên đầy đủ

aa

Axit amin

Bp

Base pairs

cs

Cộng sự

EDTA

Ethylendiamin tetra acetic acid

IU

International Unit

Kb

Kilo bases


Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR tuyển chọn .................................. 27
Bảng 3.1. Các vị trí có khả năng bị thủy phân cao bởi enzyme pepsin
trên phytase kiềm từ Bacillus subtilis ........................................... 34
Bảng 3.2. Các axit amin cần đột biến và bộ ba mã hóa thay thế ................... 36
Bảng 3.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR gây đột biến................. 36
Bảng 3 4. Phản ứng PCR sinh tổng hợp các plasmid mang đột biến trên
gen phyC........................................................................................ 38
Bảng 3.5. Kết quả cô đặc enzyme ................................................................. 49
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm điều kiện tiếp xúc của phytase kiềm chưa
đột biến với pepsin ........................................................................ 49
Bảng 3.7. Khả năng kháng pepsin của các cấu trúc phytase kiềm trước
và sau đột biến ............................................................................... 50


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.

Cấu tạo phân tử phytate liên kết với các ion kim loại và protein .......... 5

Hình 1.2.

Phản ứng thủy phân phytate bởi phytase ...................................... 6

Hình 1.3.

Cấu trúc của BPP phytase ........................................................... 11

Hình 1.4.



Hình 3.5.

Kết quả điện di tách các mẫu plasmid mang cấu trúc đột biến ....... 41

Hình 3.6.

Kết quả đọc trình tự các cấu trúc đột biến .................................. 42

Hình 3.7.

Đồ thị sinh trưởng của các dòng tế bào E. coli mang và
không mang đột biến .................................................................. 43

Hình 3.8.

Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang cấu trúc phyC không đột biến ........................................... 44

Hình 3.9.

Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang đột biến Y143P trên gen phyC.......................................... 44

Hình 3.10. Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang đột biến E189P trên gen phyC .......................................... 45
Hình 3.11. Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang đột biến E297P trên gen phyC .......................................... 46
Hình 3.12. Sự biểu hiện gen phyC ra ngoài môi trường nuôi cấy được
đánh giá trên bản điện di SDS- PAGE ....................................... 47



công nghiệp và môi trường axit trong dạ dày), tuy nhiên, chúng hoạt động
kém ở pH dạ dày và thường nhạy cảm với pepsin, loại enzyme tiêu hóa có
trong dạ dày [46]. Do vậy, cần có các nghiên cứu nhằm tăng cường các đặc
tính của phytase kiềm cho phù hợp với ứng dụng của ngành chăn nuôi (bền
nhiệt, hoạt động ở dải pH rộng, kháng lại các enzyme trong đường tiêu hóa
của động vật nuôi).
Pepsin là enzyme tiêu hóa quan trọng và chủ đạo trong dạ dày người và
động vật dạ dày đơn, chúng thủy phân đặc hiệu đối với các cấu trúc dạng
vòng xoắn trên bề mặt phân tử protein có chứa các axit amin kị nước [30].
Loại bỏ được các điểm nhạy cảm này trên bề mặt phytase kiềm sẽ giúp nâng
cao khả năng kháng lại pepsin cho phytase kiềm khi đưa chúng vào thức ăn
và vào đường tiêu hóa của động vật nuôi.
Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng
kháng pepsin của một số đột biến điểm trên bề mặt phytase từ Bacillus subtilis”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Sinh tổng hợp được một số cấu trúc mang đột biến điểm trên bề mặt
phytase từ Bacillus subtilis và đánh giá được khả năng kháng pepsin của các
phytase đột biến này.
3. Nội dung nghiên cứu
1/ Tổng hợp 3 cấu trúc ADN tái tổ hợp mã hóa phytase kiềm từ
Bacillus subtilis mang một điểm đột biến.
2/ Tách và kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa cho
phytase kiềm đột biến.
3/ Biến nạp các plasmid tái tổ hợp mang đột biến điểm vào E. coli, tiến
hành biểu hiện các phytase đột biến.
4/ Đánh giá hoạt tính và tính kháng pepsin của các phytase đột biến.

2



động vật dạ dày đơn thường phải bổ sung thêm Pvc. Lượng phốt phát không
được động vật tiêu hóa hết bị thải ra ngoài theo phân gây ô nhiễm phốt phát
trong môi trường, là nguyên nhân gây bùng phát hiện tượng tảo nở hoa, ảnh
hưởng đến sự phát triển của các loài thủy sinh [39].
1.1.2. Phytate
Phytate (myo - inositol (1,2,3,4,5,6) hexakis phosphate), là dạng
muối của axit phytic. Phytate thường chiếm từ 1 đến vài phần trăm trọng
lượng khô của hạt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chín, nảy mầm của
hạt [25, 15]. Không có hạt trưởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó
có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó. Phytate cũng được tìm
thấy ở hạt phấn, bào tử túi và mô sinh dưỡng như rễ, cuống và lá. Phytate
chứa 14 - 25% phốt pho; 1,2 - 2% canxi; 1 - 2% kẽm và sắt. Trong các loại
hạt ngũ cốc, các loại hạt đậu chứa hàm lượng phytate cao nhất (5,92 –
9,15%); tiếp đó là hạt ngô/bắp (0,83 – 2,22%) [33]. Phytate làm giảm khả
năng hấp thụ protein, tinh bột và lipit vì chúng tạo phức với protein làm cho
protein kém tan và kháng lại sự phân giải protein trong đường tiêu hóa của
động vật nuôi và người. Ở pH thấp 4,0 - 5,0; axit phytic mang điện tích âm
mạnh do các nhóm phốt phát không phân ly hoàn toàn. Trong điều kiện này,
axit phytic gây ảnh hưởng đến khả năng hòa tan protein vì liên kết ion giữa
các nhóm phốt phát của chúng với các gốc axit amin bị ion hóa (lysyl,
histidyl, arginyl). Ở pH 6,0 - 8,0; axit phytic và protein thực vật đều có điện
tích âm nhưng phức hợp giữa axit phytic và protein vẫn được hình thành
thông qua cầu nối liên kết với các ion kim loại, làm giảm giá trị dinh dưỡng
của protein trong thực phẩm [27].
Phytate còn có khả năng ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột, protein
thông qua sự liên kết với tinh bột và canxi tham gia hoạt hóa enzyme
amylase. Phytate tạo phức với protein (Hình 1.1) và ức chế trypsinogen. Vì


Bảng 1.1. Phân loại phytase theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học Quốc tế
[12, 34]
Kí hiệu
Tên
thông thường
Tên
hệ thống
Vị trí
thủy phân
liên kết phosphodieste đầu tiên
Sản phẩm
đầu tiên

Đối tượng

Phytase-3-phosphatase
EC 3.1.3.8

Phytase-6-phosphatase
EC 3.1.3.26

3 – phytase

6 – phytase

myo - inositolhexakis
phosphate - 3 –
phosphohydrolase
vị trí gốc phốt phát thứ
3 của myoinositolhexakis

Nhóm thứ 2 (EC 3.1.3.8) là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là
các enzyme của Bacillus. Cho đến nay, việc phân lập, xác định các gen
điều khiển hoạt động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ. Hiện có 2
loại phytase của Bacillus thuộc nhóm này đã được xác định là phyC [19] và
TS-phy [21].
Nhóm thứ 3 (EC 3.1.3.2) bao gồm các purple axit phosphatase (PAP).
Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm
enzyme này. Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế
xúc tác của Gmphy [8].
Bảng 1.2. Phân loại một số phytase đã được nghiên cứu [47]
Stt Gen

Nguồn cung cấp

Nhóm phân loại

1. appA

Escherichia coli

Histidin acid phosphatase

2. phyA

Aspergillus ficuum

Histidin acid phosphatase

3. phyB


Bacillus amyloliquefaciens

Beta-propeller phytase

9. 168phyA

Bacillus subtilis 168

Beta-propeller phytase

7


1.2.2. Đặc tính sinh lí, sinh hóa của phytase
Phytase từ vi nấm, E. coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis đã
được xác định là các enzyme đơn phân tử. Kích thước phân tử của phytase từ
vi khuẩn thường dao động trong khoảng từ 35 đến 50 kDa. Phytase của
Klebsiella aerogenes có hai dạng khác nhau, một dạng có kích thước khoảng
700 kDa, dạng còn lại có kích thước phân tử từ 10 – 13 kDa nhưng vẫn đảm
bảo chức năng của một enzyme, trong đó các gốc glycosyl hóa chiếm phần
lớn khối lượng của enzyme [17].
Phytase của các sinh vật nhân thực có kích thước phân tử lớn hơn vi
khuẩn, kích thước phân tử phytase của nấm men khoảng 500 kDa; ở thực vật
và động vật enzyme được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị có kích thước từ 50150 kDa. Hạt ngô trong quá trình nảy mầm sinh ra phytase được xác định
gồm 2 tiểu đơn vị có kích thước 38kDa. Phytase được tinh sạch từ đường ruột
của chuột thể hiện thành 2 loại protein trên bản điện di SDS - PAGE với kích
thước 70 và 90 kDa [17].
Phytase có nguồn gốc từ các đối tượng khác nhau sẽ có khoảng nhiệt
độ tối ưu khác nhau nhưng trung bình dao động từ 45 đến 77°C. Phần lớn các
phytase đều bị bất hoạt ở nhiệt độ 40-65°C [29]. Phytase của A. niger có khả

3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

Aspergillus niger 92
Candida intermedia
Citrobacter freundii
Escherichia coli
Bacillus sp. DS11
Bacillus subtilis (natto)
Pseudomonas sp.
Enterobacter sp. 4
Salenomonas ruminatium
Typha latifola (hạt phấn)
Lúa mì

5,0
4,5
2,7; 5,0
4,5
7,5
6,0 - 6,5
5,5


55
-

Các ion kim loại được xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp đến
hoạt độ phytase. Tuy nhiên, rất khó để xác định rõ ảnh hưởng của các kim
loại khác nhau vì sự liên kết trực tiếp của chúng với enzyme hoặc các ion kim
loại ở dạng hợp chất liên kết với axit phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt
động của cơ chất. Phytase của Enterobacter sp. 4 bị ức chế bởi các ion Zn2+,
Ba2+, Cu2+ và Al3+ [48].
Theo nghiên cứu của Wyss và cs (1999), ion Cu2+ được xác định có khả
9


năng làm giảm hoạt độ của phytase có nguồn gốc từ E. nidulans và A. terms.
Phytase của A. fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim loại thông thường.
Hoạt độ phytase của A. fumigatus bị giảm 50% dưới tác dụng của EDTA,
ngược lại, EDTA không phải là yếu tố chính tác động lên hoạt độ phytase có
nguồn gốc từ nấm như E. nidulans, A. niger, A. Terrus [51]. Những chất hóa
học khác có khả năng kìm hãm hoạt độ phytase là flor và molypdate.
1.3. Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp.
1.3.1. Vài nét về chi Bacillus
Bacillus là nhóm vi khuẩn được nghiên cứu rất kĩ cứu về đặc điểm, sinh
lý cũng như khả năng cảm ứng, sinh tổng hợp các loại enzyme. Chúng bao
gồm các vi khuẩn gram dương, hình que, sống hiếu khí, có khả năng sinh bào
tử và hình thái tế bào không bị biến dạng khi sinh bào tử [1, 2]. Bào tử hình
elip hoặc hình viên trụ, tròn đầu. Bào tử có màng mỏng và không dễ bắt màu
thuốc nhuộm [6].
Hầu hết các chủng Bacillus đều có khả năng sử dụng các hợp chất hữu
cơ như đường, amino axit, các axit hữu cơ. Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng

enzyme; một nếp gấp β phụ được thêm vào cuối đầu N của enzyme, kết nối
dải băng thứ 6 và thứ 5 [14] ( Hình 1.3.)

Hình 1.3. Cấu trúc của BPP phytase (Ha và cs [14])

11


Tính đặc hiệu của phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên chúng thường
nhạy cảm với một số enzyme tiêu hóa như pepsin. Hoạt độ riêng thấp và sự
nhạy cảm cao với pepsin đã làm cản trở việc sản xuất và sử dụng phytase của
Bacillus ở quy mô công nghiệp [23, 24].
Phytase từ Bacillus là enzyme đơn phân tử, kích thước phân tử khoảng
36,5 - 44 kDa trên bản gel SDS-PAGE. Kích thước phân tử của phytase từ B.
subtilis là 44 kDa [22].
Canxi là yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp đến độ bền phân tử
và hoạt tính của các phytase từ Bacillus. Trong môi trường có CaCl2 sau 10
phút ủ ở 70°C, hoạt độ của phytase từ Bacillus sp. DS11 không thay đổi (giữ
nguyên 100% hoạt tính). Hoạt tính của enzyme này giảm ở 50°C nếu trong
môi trường thiếu CaCl2. Sau khi ủ ở 90°C trong 10 phút, hoạt độ còn lại đạt
khoảng 50% hoạt độ lúc ban đầu khi có mặt canxi. Điều đó cho thấy ion Ca2+
ảnh hưởng mạnh mẽ đến duy trì sự ổn định của enzyme trước tác động biến
tính của nhiệt độ [20].
Đa số phytase của Bacillus có pH tối ưu khoảng 6,5 - 7,0; phytase của
B. subtilis có pH tối ưu 6,0 - 6,5; B. subtilis VTC68013 có pH ở 7,0 nhiệt độ
tối ưu là 55°C [23].
1.4. Ứng dụng của phytase
Ở động vật nhai lại, phytate được phân hủy thông qua hoạt động của
các phytase có nguồn gốc từ các vi sinh vật trong dạ cỏ (vi khuẩn, nấm).
Tuy nhiên, cơ chế này thường không có ở các động vật dạ dày đơn như

khẩu phần ăn không bổ sung phytase) [3]. Thử nghiệm này cho thấy việc bổ
sung 1000 IU phytase tái tổ hợp/kg thức ăn đã thay thế được hoàn toàn
lượng Pvc mà động vật nuôi cần, đặc biệt làm giảm 21,9 - 41,9% lượng phốt
phát thải ra phân [26].
Ngoài ra, phytase còn được nghiên cứu sử dụng dể loại bỏ phytate

13


trong thực phẩm, sản xuất các dẫn xuất myo-inositol phốt phát cho công
nghiệp dược, loại bỏ phytate trong công nghiệp sản xuất giấy [17].
1.5. Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase
Các sản phẩm phytase thương mại trên thị trường hiện nay đều là các
phytase axit (HAP – Histidine acid phosphatase), chúng có nguồn gốc từ E.
coli hoặc nấm mốc. Các enzyme này hoạt động rất tốt trong môi trường axit
song lại kém bền ở nhiệt độ cao do đó gây cản trở trong việc chế biến thức ăn
công nghiệp [28, 36, 43]. Để nâng cao tính bền nhiệt của phytase axit, hàng
loạt các nghiên cứu đã được tiến hành, trong đó có nghiên cứu đột biến điểm
trên phytase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus fumigatus của Lehmann và
cs [22, 23]. Nghiên cứu này đã thành công trong việc làm tăng tính chịu nhiệt
của enzyme lên 15 – 26oC so với phytase trước đột biến mà vẫn bảo toàn
được hoạt tính của phytase. Đột biến điểm thay thế Gly - 277 và Tyr - 282
trên phytase từ A. fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase
A. niger đã làm thay đổi pH hoạt động của enzyme này [42, 43]. Năm 2000,
để nâng cao được hiệu quả xúc tác và tính chịu nhiệt của axit phosphatase
(appA) có nguồn gốc từ Escherichia coli, Rodriguez và cs đã tiến hành gây
đột biến điểm ở 3 vị trí và các cấu trúc này được biểu hiện trong Pichia
pastori. Kết quả bước đầu cho thấy enzyme này đã hoạt động được ở pH 3,5 5,5; phytase của các cấu trúc đột biến sau khi hoạt động ở 80°C trong 10 phút
giữ lại hơn 20% (P < 0.05), và tăng 7°C so với phytase chưa đột biến [36].
Kỹ thuật gây đột biến điểm có định hướng cũng được Mullaney và cs sử dụng

có một nghiên cứu nào nhằm nâng cao khả năng kháng pepsin của phytase,
giúp enzyme này bền hơn trong pha dạ dày và thể hiện được đầy đủ hoạt
tính của nó trong pha ruột non của động vật dạ dày đơn.
1.6. Pepsin
Pepsin là enzyme tiêu hóa chủ yếu trong dạ dày của động vật bậc cao.
Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa protein trong
các sản phẩm thịt, trứng, các loại hạt, hoặc sữa.
15


Pepsin chủ yếu có trong dịch vị, thường được tiết ra dưới dạng zymogen
(tiền enzyme) là pepsinogen chưa có hoạt tính. Khi tiếp xúc với môi trường
axit của dạ dày pepsinogen chuyển thành pepsin dạng hoạt động. Pepsin này lại
tiếp tục hoạt hóa pepsinogen thành pepsin (giai đoạn tự xúc tác).
Pepsin hoạt động tốt trong môi trường axit của dạ dày, nồng độ axit
HCl thích hợp là 0,1 % - 0,8%.
Pepsin bền vững ở pH thấp, nhưng dễ mất hoạt tính ở pH > 6,5 - 7.
Nguyên nhân làm bất hoạt pepsin là do có sự biến tính của protein, dẫn đến
cấu trúc của enzyme bị biến đổi. Khả năng tái hoạt hóa của enzyme tùy thuộc
pH, nồng độ enzyme hoặc thời gian làm biến tính [32, 8]. Trong môi trường
axit mạnh, nhiệt độ cao (pH 1,8 và 50°C) thì pepsin mất dần hoạt tính. Tốc độ
sự mất hoạt tính tỷ lệ trực tiếp với nồng độ [Η +] [8].
Ở pH = l,5 - 2, pepsin thủy phân các protein có khối lượng phân tử lớn
do có khả năng cắt vào khoảng 30% các liên kết peptit, sản phẩm chính của
quá trình thủy phân là protease, pepton và một ít axit amin. Các protein tan
trong nước (caseine, albumin, hemoglobin) thì pepsin dễ dàng phân cắt, còn
đối với các nucleoprotein và các protein không tan như keratin (ở tóc, da),
collagen, sợi fibroin… thì hầu như ít bị pepsin phân cắt [32].
Pepsin là enzyme thuộc nhóm protease, có khả năng phân cắt không
đặc hiệu, có thể cắt tại nhiều điểm trên phân tử protein (Hình1.4) [32].

phép xác định các vị trí cắt/thủy phân của pepsin trên cấu trúc phân tử
ACZ57955.1 bậc 1 mà chưa cho phép xác định mức độ ưu tiên đối với từng vị
trí cắt. Dựa vào nghiên cứu của Palashoff về tần suất thủy phân đối với từng
vị trí cắt P1-P1’ của pepsin, tác giả Vương Thị Thanh Hằng và cs đã xác định
được tần suất thủy phân của pepsin đối với từng vị trí axit amin trên phân tử
ACZ57955.1. So với công cụ PeptideCutter, bảng xác suất cắt của Palashoff
cho phép các tác giả xác định được 276 vị trí cắt trên toàn phân tử
ACZ57955.1. Mặc dù tổng số các vị trí cắt gấp 3,5 lần so với dự đoán của
công cụ PeptideCutter, hầu hết các vị trí cắt với xác suất cắt cao (≥40%) trên
phân tử ACZ57955.1 đều trùng với các vị trí cắt được dự đoán bằng công cụ

17