ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP
TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ
VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN PHƢƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƢƠNG PHÁP
TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ
VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Chƣơng 1 - TỔNG QUAN .................................................................................3
1.1.

Vi khuẩn Bacillus ..........................................................................................3

1.1.1.

Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus ..............................................3

1.1.2.

Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus ...............................................4

1.1.3.

Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại ......................................................5

1.1.4.

Phương pháp phân lập và phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus ...........7

1.2.

Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus ..........................................................12

1.2.1.

Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương ....................................13

i


2.2.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22

2.2.1.

Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn ............22

2.2.2.

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào ..........................................22

2.2.3.

Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan ..................................23

2.2.4.

Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA ....................23

2.2.5.

Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen ..............23

2.2.6.

Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại ..........24


Enzyme ngoại bào .................................................................................32

3.1.4.

Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh

trưởng IAA .........................................................................................................33
3.2.

Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B. amyloliquefaciens subsp.

plantarum ...............................................................................................................34
3.2.1.

Phân tích dấu vân tay rep-PCR .............................................................34

3.2.2.

Phân tích trình tự đa gen .......................................................................36

ii


3.3.

Tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất sinh học của chất kháng nấm và

chất kháng khuẩn từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604 ......39
3.3.1.


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1.

Thông tin cơ bản của 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum.

Bảng 3.2.

Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn

Bảng 3.3.

Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào

Bảng 3.4.

Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh
trưởng IAA

Bảng 3.5.

Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của dịch chiết thô

Bảng 3.6.

Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm và kháng khuẩn

Bảng 3.7.


Cấu trúc chuỗi peptide của chất kháng sinh polymyxin.

Hình 1.4.

Cấu trúc chất kháng sinh iturin.

Hình 1.5.

Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin.

Hình 1.6.

Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin.

Hình 3.1.

Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu
vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC

Hình 3.2.

Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu
vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5.

Hình 3.3.

Mối quan hệ giữa chủng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng
loại và các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis.



Daton

Dab:

2,4 - diaminobutyric acid

GTTB:

Giá trị trung bình

HPLC:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA:

Hóc môn thực vật IAA (Indole-3-Acetic Acid)

KBT:

Khoảng biến thiên

MIC:

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration)

MS:

Khối phổ (Mass Spectrometry)

subtilis. Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho
cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây,
sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có
khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi
sinh vật gây bệnh. Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ
giải mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên
cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi
và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây
trồng. Một số chủng như B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 cũng đã
được sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng
trừ bệnh cây. Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quả sử dụng các chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh
cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra. Sản
lượng nông sản thu hoạch cũng tăng lên đáng kể khi bổ sung chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 vào phân bón.
B. amyloliquefaciens subsp. plantarum sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi
bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây. Các chất trao đổi
đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn.
Đa số các chất này được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized

1


peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases
(NRPS). Nhiều chất trong số này đã được nghiên cứu tỉ mỉ về cấu trúc hóa học, đặc
tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y - dược học.
Nhằm tìm kiếm, đánh giá và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng
dụng trong sản xuất nông nghiệp xanh và bền vững, trong luận văn này, chúng tôi

tìm thấy trong các loại đất nhiễm kim loại nặng hay nhiễm asen. Một số loài có khả
năng sống ký sinh và gây bệnh cho người, động vật và côn trùng như B. cereus, B.
anthracis và B. thuringiensis. Một số loài là vi sinh vật vùng rễ hay sống cộng sinh
trong rễ của một số loại thực vật. Gần đây, một số loài vi khuẩn mới thuộc chi
Bacillus còn được tìm thấy ở độ cao từ 24 đến 41 km trong tầng bình lưu của khí
quyển [44].
Các đặc điểm phân loại đặc trưng của chi Bacillus
Bacillus là vi khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào
tử, có thể di động bằng tiêm mao, đa số sống hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc.

3


Tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ, xếp đôi hay nối với nhau tạo thành các chuỗi dài.
Hầu hết các loài vi khuẩn Bacillus có thể sinh sống trên môi trường thạch dinh
dưỡng (nutrient agar; NA) hay thạch máu (blood agar). Hình thái và kích thước
khuẩn lạc rất khác nhau giữa các loài khác nhau hay thậm chí giữa các chủng khác
nhau trong cùng một loài. Bacillus có phản ứng catalase dương tính nhưng phản
ứng oxydase khác nhau giữa các loài khác nhau.
1.1.2. Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus
Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus
Bacillus là một trong những vi khuẩn đầu tiên được con người biết đến sau
phát minh về kính hiển vi của Anton van Leeuwenhoek. Các sự kiện nghiên cứu về
vi khuẩn Bacillus bắt đầu từ năm 1835 khi Ehrenberg mô tả và đặt tên một loài vi
khuẩn là Vibrio subtilis [14]. Đến năm 1872, Ferdinand Cohn lần đầu tiên phát hiện
loài vi khuẩn mà Ehrenberg đã mô tả có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu lại
các điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống. Ông đặt lại tên cho loài vi khuẩn
này là Bacillus subtilis. Trong cùng khoảng thời gian này, Robert Kock cũng phân
lập và mô tả tác nhân gây bệnh than là Bacillus anthracis. Ông cũng quan sát thấy
loài vi khuẩn này có khả năng sinh nội bào tử như loài Cohn đã mô tả. Kock đã mô

các chi khác như Alicyclobacillus, Halobacillus, Gracilibacillus và Virgibacillus
[48].
1.1.3. Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại
Đến những năm đầu thế kỷ 21, với sự gia tăng số lượng nghiên cứu đa dạng
vi sinh vật trong các vùng sinh thái đặc biệt, số lượng các loài vi khuẩn trong nhóm
Bacillus lớn tăng lên đáng kể. Khoảng thời gian từ năm 2004 đến 2006, trung bình
mỗi tuần có một loài mới thuộc Bacillus nhóm lớn được mô tả trên các tạp chí phân
loại chuyên ngành [18]. Sự gia tăng đột biến về số lượng loài cũng dẫn đến sự thay
đổi nhanh chóng hệ thống phân loại của nhóm vi khuẩn này. Đến nay, có khoảng
37 chi mới trong Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato). Các chi này được nhóm
vào 3 họ: Bacillaceae, Paenibacillaceae, Alicyclobacillaceae (Hình 1.1.) cùng với 7
họ khác (như Thermoactinomycetaceae, Staphylococcaceae, Pasteuriacea) tạo nên
bộ Bacillales [18].

5


Hình 1.1. Mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại của các loài Bacillus nhóm
lớn. Cây được thiết lập dựa trên trình tự gen 16S rRNA.
Trong Bacillus nhóm lớn, Bacillus là chi có số lượng loài nhiều nhất. Đến
nay, có khoảng 150 loài vi khuẩn Bacillus đã được mô tả. Loài chuẩn của chi vẫn là
B. subtilis mà Cohn đã mô tả năm 1872. Có 2 nhóm quan trọng nhất trong chi
Bacillus là nhóm B. subtilis và nhóm B. cereus. Nhóm B. subtilis có khoảng 10 loài
và các loài phụ có quan hệ gần gũi với nhau và có nhiều loài như B. subtilis, B.
licheniformis và B. amyloliquefaciens được ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm
thương mại trên quy mô công nghiệp. B. subtilis gồm 3 loài phụ dưới loài là B.
subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp.
inaquosorum. Nhóm B. cereus gồm 6 loài có quan hệ gần gũi với nhau. Trong chi

6



Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus rất đa dạng và phong phú giữa các
loài khác nhau hay thậm chí giữa các chủng khác nhau trên cùng một loài [48]. Một
số chủng còn tạo nên nhiều kiểu hình thái khuẩn lạc khác nhau trên cùng một đĩa
nuôi cấy hay thậm chí có các kiểu hình thái khuẩn lạc khác nhau giữa các lần nuôi
cấy khác nhau, giữa các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau và giữa các môi trường nuôi
cấy khác nhau. Tuy nhiên, nếu có nhiều kinh nghiệm làm việc trên nhóm vi khuẩn
này thì lại rất dễ dàng phân biệt được khuẩn lạc của các loài vi khuẩn Bacillus với
khuẩn lạc của các loài thuộc các nhóm vi sinh khác, đặc biệt là những kiểu khuẩn
lạc quen thuộc của các loài trong 2 nhóm B. subtilis và B. cereus. Bề mặt khuẩn lạc
của các loài trong nhóm B. subtilis nhăn nheo và hơi khô; kích thước khuẩn lạc
khoảng 2 - 4 mm. Trong khi đó, bề mặt khuẩn lạc của các loài trong nhóm B. cereus
phẳng, có cấu trúc lăn tăn dạng hạt; khuẩn lạc dẹt, phát triển lan trên mặt thạch tạo
cho kích thước khuẩn lạc lớn (2 - 7 mm) sau 2 ngày nuôi cấy.
Phương pháp nhuộm soi
Dựa vào các hình thái khuẩn lạc ta có thể đánh giá sơ bộ chủng cần nghiên
cứu thuộc nhóm B. subtilis hay B. cereus. Tuy nhiên, nếu chúng ta tiến hành soi các
loài này dưới kính hiển vi với vật kính dầu thì chúng ta có thể có những bằng chứng
để bước đầu kết luận chủng đó thuộc nhóm nào. Tế bào nhóm vi khuẩn B. subtilis
kích thước khoảng 0,7 - 0,8 × 2,0 - 3,0 µm, đầu tế bào tròn, đứng riêng rẽ, xếp
thành đôi hay thành các chuỗi ngắn trong khi đó tế bào nhóm vi khuẩn B. cereus có
kích thước 1,0 - 1,2 × 3,0 - 5,0 µm, đầu tế bào vuông, xếp thành chuỗi dài. Hơn
nữa, khi nhuộm soi tế bào ta có thể dễ dàng phân biệt được B. cereus và B.
thuringiensis do sự xuất hiện của tinh thể độc ở B. thuringiensis. Tuy nhiên, tính
chất này cũng chỉ tương đối vì nhiều chủng B. thuringiensis thuộc các tuýp kháng
huyết thanh khác nhau cũng không sinh tinh thể độc trong điều kiện nuôi cấy thông
thường [33].

8

bào thường bắt màu Gram (-). Giai đoạn này chúng ta thường nhìn thấy các cấu trúc

9


tế bào đã bị phá vỡ và nội bào tử được giải phóng ra bên ngoài. Hơn nữa, chúng ta
có thể quan sát được hình dạng tinh thể độc giải phóng ra từ các tế bào B.
thuringiensis.
Phương pháp nhuộm bào tử
Đây là phương pháp nhuộm nhằm xác định hình dáng, kích thước nội bào tử
của vi khuẩn Bacillus. Hơn nữa, chúng ta cũng quan sát được vị trí hình thành bào
tử trong tế bào mang bào tử. Theo phương pháp này, vi khuẩn được cố định trên
lam kính và được nhuộm với dung dịch xanh malachite (0,5 g malachite green pha
trong 100 ml nước cất) trên dòng hơi nước nóng trong khoảng 8 phút. Sau khi rửa
dưới vòi nước, tế bào được nhuộm với dung dịch safranin (2,5 g safranin O pha
trong 100 ml cồn 95%) trong 1 phút. Dưới vật kính soi dầu, nội bào tử của vi khuẩn
bắt mầu xanh của thuốc nhuộm xanh malachite; tế bào vi khuẩn bắt mầu hồng của
thuốc nhuộm safranin [38].
Để có một hình ảnh nhuộm soi nội bào tử đẹp thì việc xác định thời điểm tế
bào sinh nội bào tử rất quan trọng. Nếu nhuộm khi tế bào còn quá non thì sẽ không
quan sát được nội bào tử; nếu nhuộm khi tế bào quá già thì đa số nội bào tử đã được
giải phóng ra bên ngoài tế bào. Chính vì vậy, chúng ta cần tiến hành phương pháp
nhuộm soi nội bào tử ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau như nhuộm soi sau 16, 20,
24, 28 và 32 giờ nuôi cấy.
Phương pháp phân loại dựa trên các đặc tính sinh hóa API
Sản sinh các loại enzyme trong quá trình trao đổi chất hay khả năng đồng
hóa các nguồn cacbon khác nhau là những đặc tính sinh hóa quan trọng trong phân
loại vi sinh vật. Năm 1970, hãng Biomerieux (Pháp) đã phát triển các loại thanh thử
(strip test) đơn giản để kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật. Từ kết quả
sinh hóa thu được giữa các nhóm vi sinh vật dưới dạng chữ, dữ liệu được chuyển

hay gặp nhiều nhất trong đơn vị phân loại hiển thị tại thông tin “significant taxa”,
giá trị T càng tiến đến 1 thì tương đồng sinh hóa càng cao, và (iv) kết luận phân loại
cuối cùng, kết luận này được đưa ra dựa trên các chỉ số sau:
 “Excellent identification” kết quả phân loại chính xác: % ID ≥ 99,9% và T ≥ 0,75
 “Very good identification” kết quả phân loại rất tốt: % ID ≥ 99,9% và T ≥ 0,50

11


 “Good identification” kết quả phân loại tốt: % ID ≥ 90,0% và T ≥ 0,25
 “Acceptable identification” kết quả phân loại chấp nhận được: % ID ≥ 80,0% và
T≥0
Phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật giải trình tự DNA
Năm 1991, Ash cùng cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật giải trình tự đoạn 16S
rDNA vào phân loại các loài Bacillus [3]. Theo phương pháp này, DNA được tách
chiết từ tế bào vi khuẩn và đoạn 16S rDNA được khuếch đại sử dụng cặp mồi 27F
(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC

AG-3')

và

1525R

(5'-

AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'). Sau khi điện di kiểm tra sự có mặt của băng 16S
rDNA, sản phẩm PCR được tinh sạch và được dùng trong phản ứng PCR giải trình
tự sử dụng các loại mồi 27F, 1525 R, 518F (5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG3’), 800R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’) và Bigdye® terminator v3.1
(Applied Biosystem). Trình tự đoạn 16S rDNA được kết nối sử dụng phần mềm

sinh từ các enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome (nonribosomal
peptide synthetases; NRPSs) [34]. Chuỗi peptide trong lipopeptide chứa hỗn hợp
các amino acid dạng D và dạng L, qua đó giúp cho chất kháng sinh bền với các
protease thủy phân. Phần đầu N của lipopeptide thường được acylated với mạch
acid béo chứa nhóm β - hydroxyl. Dựa vào cấu trúc hóa học, các loại lipopeptide từ
vi khuẩn Bacillus được chia ra thành 3 lớp chính sau đây:
1.2.1. Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương
Hầu hết các lipopeptide sản sinh từ vi khuẩn Bacillus và Paenibacillus được
xếp trong lớp này. Phần peptide được vòng hóa tại đầu C bởi liên kết este hoặc liên
kết amide và phần lipid được gắn vào đầu N của amino acid nhờ quá trình acylate
hóa bởi enzyme NRPS. Điện tích dương của phân tử lipopeptide được tạo ra nhờ sự
có mặt của amino acid 2,4 - diaminobutyric acid (Dab) [11]. Dựa vào cấu trúc, lớp
này được chia ra thành các nhóm sau đây:
Polymyxin
Polymyxin là một trong những lipopeptide đầu tiên được phát hiện từ
Bacillus (nay là Paenibacillus polymyxa) vào năm 1947 [36]. Cho đến nay, nhiều

13


loại polymyxin đã được phát hiện như polymyxin A, B, E (colistin) và M
(mattacin). Cấu trúc tự nhiên chung của phần peptide trong phân tử polymyxin là
chuỗi chứa 10 amino acid, có từ 5 đến 6 phân tử Dab và đóng vòng ở vị trí Dab 4.
Các phân tử Dab tạo cho polymyxin có chứa nhiều điện tích dương. Polymyxin có
tính kháng mạnh vi khuẩn Gram âm do tương tác với lipiA của lipopolysacchride,
quá đó phá hủy màng tế bào. Polymyxin gây độc tính với tế bào thần kinh và thận.
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy polymyxin không độc như đã từng
công bố. Vì vậy, cơ quan thực phẩm và dược phẩm Mỹ gần đây đã cấp phép sử
dụng một số loại polymyxin trong điều trị bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Gram âm
đa kháng thuốc gây nên như Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae,

mycosubtilin, mojavensin và bacillomycin. Nhóm kháng sinh iturin thường có hoạt
tính kháng nấm mạnh, nhưng kháng khuẩn yếu. Cơ chế tiêu diệt nấm là do chất
khang sinh tương tác với thành phần sterol trong màng tế bào nấm, làm tăng tính
thấm với ion K+ và làm thoát các vật chất ra khỏi tế bào.
Surfactin và lichenysin
Giống như iturin, surfactin và lichenysin có chuỗi peptide 7 amino acid khép
vòng hoàn toàn bằng liên kết este thay vì liên kết amide ở iturin. Hơn nữa, thành
phần amino acid của kháng sinh nhóm này khác hoàn toàn với kháng sinh nhóm
iturin và cấu hình amino acid là LDLLDL. Surfactin khác với lichenysin ở vị trí
amino acid số 1 là Glu thay vì Gln. Đây là chất kháng sinh có hoạt tính bề mặt

15


mạnh, tấn công tế bào đích thông qua cơ chế phá hủy màng tế bào. Khi có mặt ở
nồng độ cao, chất kháng sinh này hoạt động như một chất tẩy rửa; khi ở nồng độ
thấp, chúng tạo nên các lỗ trên màng tế bào, làm thoát vật chất và làm chết tế bào
[11]. Surfactin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ký sinh
trùng và kháng viêm. Tuy nhiên, chất kháng sinh này có hoạt tính dung giải máu
cao nên đã hạn chế việc ứng dụng của chất này vào thực tế.

Hình 1.4. Cấu trúc chất kháng sinh iturin.
Fengycin
Nhóm này bao gồm fengysin và plipastatin. Đây là nhóm có 10 amino acid
trong thành phần chuỗi peptide được vòng hóa giữa phân tử phenol của Tyr 3 với
đầu C (Hình 1.5). Đây là nhóm lipopeptide có hoạt tính kháng nấm mạnh, đặc biệt
là các loại nấm sợi. Ngoài ra, nhóm kháng sinh này có khả năng kìm hãm sự tăng
sinh của các tế bào ung thư phổi dòng 95D in vitro và in vivo [11]. Fengycin có độc
tính tế bào thấp hơn 40 lần so với surfactin.
Fusaricidin